不同來源大豆毛油磷脂組成的核磁檢測(cè)及磷脂酸含量比較

俞 樂，叢 芳，王興國(guó)，金青哲，姜元榮

(1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122； 2.豐益(上海)生物技術(shù)有限公司，上海 200137)

檢測(cè)分析

不同來源大豆毛油磷脂組成的核磁檢測(cè)及磷脂酸含量比較

俞 樂1，叢 芳2，王興國(guó)1，金青哲1，姜元榮2

(1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122； 2.豐益(上海)生物技術(shù)有限公司，上海 200137)

植物毛油中存在一定量以磷脂為主的膠質(zhì)。為保證后續(xù)物理精煉順利進(jìn)行，植物毛油需先經(jīng)過脫膠處理。綜合考慮原料產(chǎn)地、加工工藝、生產(chǎn)批次等因素，收集了25種不同大豆毛油，利用31P NMR 技術(shù)對(duì)其進(jìn)行磷脂組成分析，并研究了毛油中的磷脂酸含量與其他雜質(zhì)間的關(guān)系。結(jié)果表明：不同品種大豆制備的毛油在磷脂組成上存在顯著性差異(p<0.05)，而磷含量沒有顯著性差異；隨著儲(chǔ)藏溫度升高，毛油磷脂中磷脂酸占比有一定程度上升；大豆毛油中磷脂酸的含量與金屬離子含量極顯著正相關(guān)(p<0.01)，與游離脂肪酸含量(以酸值表示)不存在顯著性關(guān)聯(lián)(p>0.05)。

大豆毛油；磷脂組成；核磁檢測(cè)；磷脂酸

毛油脫膠處理中，水化磷脂通常易于分離，非水化磷脂則難以通過常規(guī)水化脫膠、酶法脫膠[1]去除。毛油中的非水化磷脂主要由磷脂酸(PA)的鈣鎂鹽組成[2]，毛油磷脂的PA比例過高，則不利于脫膠進(jìn)行，影響成品油品質(zhì)。油料運(yùn)輸、儲(chǔ)存、生產(chǎn)過程中，由于其中磷脂酶(如磷脂酶A、磷脂酶D等)[3]的作用，毛油磷脂中磷脂酰膽堿(PC)等水化磷脂含量下降。在磷脂酶A的作用下，水化磷脂被水解為溶血磷脂及游離脂肪酸[4]。磷脂酶D作用于磷脂質(zhì)的磷酸二酯鍵，能夠?qū)C等磷脂水解為PA和羥基化合物[5]。

磷脂檢測(cè)的常用方法主要有薄層色譜法(TLC)和高效液相色譜法(HPLC)。TLC很難將所有組分完全分開；HPLC對(duì)樣品需要進(jìn)行復(fù)雜的前處理，存在檢測(cè)器選擇等問題[6-7]。近年來隨著核磁檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，利用31P核磁共振(31P NMR)檢測(cè)磷脂逐漸受到人們關(guān)注，該方法對(duì)含磷組分的選擇具有唯一性，不受其他元素的干擾，具有預(yù)處理簡(jiǎn)便、分析快捷、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)[8]。

目前，國(guó)內(nèi)鮮有將31P NMR運(yùn)用于植物毛油磷脂組成檢測(cè)的報(bào)道。施邑屏等[9]曾利用該法檢測(cè)大豆磷脂并進(jìn)行了重復(fù)性定量驗(yàn)證，證實(shí)了31P NMR檢測(cè)混合磷脂中單體組分的可行性。但實(shí)驗(yàn)中未很好地控制pH，檢測(cè)過程中發(fā)生磷脂單體水解等不良副反應(yīng)[10]，影響磷脂組分定量的準(zhǔn)確性。而且施邑屏等[9]所使用的核磁工作頻率僅為90 MHz，單峰信號(hào)的分離度不足。龐思勉等[11]運(yùn)用該法檢測(cè)了堅(jiān)果中磷脂的組成，并對(duì)該法的定量性及檢出限進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果同樣存在檢測(cè)工作頻率低造成分離度不足的問題。近年來，國(guó)外一些學(xué)者研究了將31P NMR運(yùn)用于植物毛油磷脂組成檢測(cè)的方法[12]，但這些方法都需要先對(duì)毛油中的磷脂進(jìn)行富集，再進(jìn)行檢測(cè)。

本文采用31P NMR檢測(cè)25種不同來源大豆毛油中磷脂的PA含量，并探討了PA含量與毛油中游離脂肪酸、金屬離子含量的相關(guān)性，以期為脫膠方法的選擇提供簡(jiǎn)單有效的判斷依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

25種大豆毛油由益海嘉里集團(tuán)提供；氘代氯仿、99.5%一水合氫氧化銫由Aldrich Chemical公司提供；其余試劑為分析純，由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。鈣鎂檢測(cè)時(shí)樣品以10倍航空煤油稀釋，實(shí)驗(yàn)用航空煤油由蘭州煉油廠提供。

Bruker Ascend 400型超導(dǎo)核磁共振波譜儀，安捷倫7700x型ICP-MS。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.131P NMR檢測(cè)磷脂組成[12]

稱取80～90 mg油樣，添加以氯仿稀釋的磷酸三甲酯(TPP)溶液(體積比1∶50)為內(nèi)標(biāo)，添加量為5 μL。依次加入氘代氯仿，甲醇，pH為8.5、濃度為0.2 mol/L EDTA-Cs各600 μL，混勻后加入核磁共振管。

分析條件：31P NMR工作頻率600 MHz；檢測(cè)探頭PABBO NMR；溫度25℃；脈沖寬度11.2 μs；脈沖延遲時(shí)間2 s；掃描次數(shù)16；31P NMR的譜寬64 102 Hz；采樣點(diǎn)數(shù)65 536。

采用內(nèi)標(biāo)法定量計(jì)算毛油中磷脂各組分的含量以及各磷脂組分在毛油的總磷脂中的占比。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定

鈣鎂離子含量的測(cè)定參照AOCS檢測(cè)方法Ca 20-99；酸值的測(cè)定參照GB/T 5530—2005；磷含量的測(cè)定參照GB/T 5537—2008。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS19.0進(jìn)行顯著相關(guān)性、顯著差異性分析，相關(guān)性分析采用Person分析(p<0.05)，差異性分析采用ANOVA分析(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆毛油磷脂的31P NMR分析

大豆毛油中的磷脂組分主要為磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)，此外還存在少量溶血磷脂酰膽堿(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、N-酰基磷脂酰乙醇胺(APE)等組分。影響磷脂31P NMR化學(xué)位移的主要因素為相連X基團(tuán)的電負(fù)性、共軛性以及鍵角[13]，以磷原子為中心，相連各基團(tuán)對(duì)稱性越強(qiáng)，化學(xué)位移越向高場(chǎng)(正為低場(chǎng)，負(fù)為高場(chǎng))移動(dòng)，通過檢測(cè)條件的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)大豆磷脂各組分的有效檢測(cè)。

圖1為2015年6月份由益海嘉里南天工廠提供的以巴西大豆為原料的大豆毛油的31P NMR檢測(cè)圖譜。由圖1可以看出，除了4種主要磷脂外，含量較低的溶血磷脂、APE等也均在圖上得到了分開的單峰信號(hào)。各主要峰分離度高，峰型規(guī)整，檢測(cè)效果良好。

圖1 大豆毛油的 31P NMR檢測(cè)圖譜

2.2 大豆毛油的PA占比、磷含量、金屬離子含量、酸值

本實(shí)驗(yàn)涉及25種毛油使用了來自4個(gè)不同國(guó)家的大豆，由益海嘉里集團(tuán)下屬的8個(gè)不同地區(qū)工廠生產(chǎn)提供。其中14種大豆毛油以巴西大豆為原料，4種大豆毛油以美國(guó)大豆為原料，4種大豆毛油以國(guó)產(chǎn)大豆為原料，2種大豆毛油以阿根廷大豆為原料，1種大豆毛油的原料為美國(guó)大豆和巴西大豆的混合大豆。25種大豆毛油的PA占比(以在磷脂中計(jì))、磷含量、鈣鎂離子含量和酸值見表1。

表1 25種大豆毛油的PA占比(以在磷脂中計(jì))、磷含量、鈣鎂離子含量和酸值

由表1可以看出，25個(gè)油樣中有7個(gè)樣品的PA占比超過30%，這些樣品均以來自巴西的大豆為原料。巴西大豆制得毛油的磷脂中，PA占比極顯著高于其他地區(qū)大豆生產(chǎn)的毛油(p<0.01)。美國(guó)大豆為原料制取的毛油中，PA在磷脂中的占比顯著低于其他大豆毛油(p<0.05)，兩種PA占比最低的樣品，均使用了來自美國(guó)的大豆為原料。中國(guó)及阿根廷的大豆制得的毛油PA在磷脂中的占比處于中等水平，大部分在20%～25%之間。不同地區(qū)大豆生產(chǎn)的毛油在磷含量上不存在顯著性差異。

對(duì)采集的25種毛油進(jìn)行鈣、鎂、鐵、銅、鎳等全金屬離子分析后發(fā)現(xiàn)，所有毛油中鈣、鎂離子的含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他金屬離子，因此可以用鈣鎂離子含量代表毛油中的金屬離子含量。25個(gè)樣品中，鈣鎂離子含量超過300 mg/kg的3種大豆毛油，均由巴西大豆制得，同時(shí)也有一些巴西大豆毛油的鈣鎂離子含量較低，其中3種大豆毛油的鈣鎂離子含量低于200 mg/kg，總體而言，巴西大豆毛油與其他來源大豆生產(chǎn)的毛油，在鈣鎂離子含量上不存在顯著性差異。與其他毛油相比，美國(guó)大豆毛油的鈣鎂離子含量顯著偏低(p<0.05)，其中最高的美國(guó)大豆毛油鈣鎂離子含量?jī)H為226.70 mg/kg。

不同來源大豆毛油在酸值上同樣存在顯著性差異。巴西大豆毛油的酸值顯著高于其他大豆毛油(p<0.05)，美國(guó)大豆毛油的酸值顯著低于其他來源大豆毛油(p<0.05)。就所采集樣品而言，巴西大豆毛油的平均酸值(KOH)為2.57 mg/g，美國(guó)大豆毛油平均為1.08 mg/g，阿根廷大豆毛油平均為2.36 mg/g，中國(guó)大豆毛油平均為1.43 mg/g；美國(guó)、巴西混合大豆所制毛油的酸值(KOH)為 3.11 mg/g，高于美國(guó)大豆毛油和巴西大豆毛油的平均值。

值得注意的是，10號(hào)、11號(hào)、14號(hào)樣品均由同一家工廠提供，且原料為同批進(jìn)口大豆，生產(chǎn)時(shí)間分別為2015年7月、8月、6月。3批毛油中，7月份生產(chǎn)的大豆毛油PA占比略高于另外兩個(gè)月生產(chǎn)的大豆毛油。根據(jù)當(dāng)?shù)貧庀筚Y料，該地區(qū)2015年7月份平均氣溫為全年最高，為32℃左右，其他月份的平均氣溫均未超過30℃，7月份大豆內(nèi)磷脂酶酶活力最高[14]，這可能是該樣品的磷脂組成中PA占比略高的原因。

2.3 大豆毛油的PA含量與金屬離子含量及酸值間的相關(guān)性分析

考察25種大豆毛油中PA含量與鈣鎂離子含量的關(guān)系，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 大豆毛油中PA含量與鈣鎂離子含量的關(guān)系

經(jīng)分析，大豆毛油中PA含量與金屬離子含量存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.738(p<0.01)。PA的結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)羥基，與二價(jià)金屬離子，如鈣、鎂離子等，有很強(qiáng)的親和力[2]，當(dāng)其他條件相仿時(shí)，大豆毛油中的PA含量增高通常會(huì)導(dǎo)致金屬離子含量的上升。

阿根廷大豆制取的毛油與其他樣品相比，每毫克PA結(jié)合到的鈣鎂離子量極顯著偏高(p<0.01)，每毫克PA平均結(jié)合到0.082 mg鈣鎂離子。巴西大豆和國(guó)產(chǎn)大豆生產(chǎn)的毛油每毫克PA平均結(jié)合到0.050 mg左右鈣鎂離子，美國(guó)大豆毛油每毫克PA平均結(jié)合到0.060 mg 鈣鎂離子?？梢姶蠖沟钠贩N、生長(zhǎng)環(huán)境等條件可能會(huì)影響PA含量與金屬離子含量間的關(guān)系[15]。

毛油生產(chǎn)工藝也可能對(duì)PA含量與金屬離子含量間的關(guān)系造成影響。本實(shí)驗(yàn)收集的毛油絕大多數(shù)為浸出法制備的毛油，但21號(hào)大豆毛油通過壓榨法生產(chǎn)得到，該毛油中每毫克PA結(jié)合到的鈣鎂離子與其他浸出法國(guó)產(chǎn)大豆毛油相比，顯著偏高，正常國(guó)產(chǎn)浸出大豆毛油每毫克PA平均結(jié)合鈣鎂離子為0.037 mg 左右，壓榨大豆毛油每毫克PA平均結(jié)合鈣鎂離子為0.066 mg。此外，大豆品質(zhì)也可能影響PA與金屬離子結(jié)合能力，劣質(zhì)國(guó)產(chǎn)浸出大豆毛油(19號(hào)樣品)每毫克PA平均結(jié)合量達(dá)0.058 mg(以鈣鎂離子計(jì))。

考察25種大豆毛油中PA含量與酸值的關(guān)系，結(jié)果如圖3所示。

圖3 大豆毛油中PA含量與酸值的關(guān)系

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，大豆毛油所含PA的含量與游離脂肪酸含量(以酸值表示)不存在顯著性關(guān)聯(lián)(p>0.05)。

3 結(jié) 論

以收集到的25種以不同來源大豆為原料，對(duì)由不同工廠在不同時(shí)間段加工生產(chǎn)制得的毛油進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，大豆的來源、儲(chǔ)存溫度、生產(chǎn)工藝等條件均可能對(duì)毛油中包括磷脂、金屬離子、游離脂肪酸在內(nèi)的雜質(zhì)組成和含量造成一定影響。本實(shí)驗(yàn)涉及的樣品中，以巴西大豆為原料制取的大豆毛油PA占比和游離脂肪酸含量普遍較高；美國(guó)大豆制得的大豆毛油PA占比低、游離脂肪酸含量少，品質(zhì)普遍較好。生產(chǎn)工藝對(duì)大豆毛油品質(zhì)存在一定影響，當(dāng)原料、生產(chǎn)工藝等條件相近時(shí)，環(huán)境溫度對(duì)生產(chǎn)的大豆毛油品質(zhì)也有一定影響。

在工廠的實(shí)際生產(chǎn)中，磷脂組分的定量檢測(cè)存在諸多不便。本文考察了金屬離子及酸值與磷脂酸含量間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)大豆毛油中金屬離子含量與PA含量存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，酸值與PA含量不存在顯著性關(guān)聯(lián)。對(duì)于工廠而言，可以通過金屬離子含量大致推測(cè)毛油中非水化磷脂的含量高低，指導(dǎo)后續(xù)脫膠方法、條件的選擇。

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Determination of phospholipids composition in crude soybean oil from different sources by nuclear magnetic resonance and comparison of phosphatidic acid content

YU Le1，CONG Fang2，WANG Xingguo1，JIN Qingzhe1，JIANG Yuanrong2

(1. School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China;2.Wilmar Biotechnology Research & Development Center (Shanghai) Co.，Ltd.，Shanghai 200137，China)

The crude vegetable oil contained a finite amount of colloid substance which was mainly composed of phospholipids. In order to ensure the smooth operation of physical refining，the crude vegetable oil needed to be degummed firstly. Comprehensive considering the factors of origin，processing technology and production batch，25 kinds of crude soybean oils were collected and their phospholipids compositions were analyzed by31P NMR.The relationships between the contents of phosphatidic acid content and other impurities in crude oil were studied. The results showed that there were significant differences in phospholipids compositions in crude oils which were made from different varieties of soybeans (p<0.05)，but there was no significant difference in phosphorus content. The proportion of phosphatidic acid in phospholipids increased with the storage temperature rising. The contents of phosphatidic acid and metal ions in crude soybean oil were markedly positive correlated(p<0.01). There was no significant correlation between the contents of phosphatidic acid and free fatty acids(p>0.05).

crude soybean oil; phospholipid composition; NMR; phosphatidic acid

2016-04-05；

2016-09-26

俞 樂(1990)，女，在讀碩士，研究方向?yàn)橹参镉偷牧字瑱z測(cè)及酶法脫膠(E-mail)lyhappyfish@126.com。

王興國(guó)，教授(E-mail)wxg1002@qq.com。

TS225.1;TQ646

A

1003-7969(2017)01-0130-04