產(chǎn)β?葡萄糖苷酶植物乳植桿菌c4?3發(fā)酵豆?jié){的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)和代謝分析

鮑捷，代藝偉，陳映羲，梁會(huì)朋，林心萍，張素芳*

（1.大連工業(yè)大學(xué)國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連 116034）

大豆作為世界重要糧食作物，富含多種營(yíng)養(yǎng)和人體所需物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、油脂[1?2]、維生素[3]常見(jiàn)物質(zhì)，以及異黃酮、酚類(lèi)[2，4]、萜類(lèi)[5]等次生代謝產(chǎn)物。大豆中天然存在的異黃酮多為糖苷型異黃酮（soybean isofla?vone glycoside，SIG），人體吸收利用率較差，其可通過(guò)腸道微生物產(chǎn)生的β?葡萄糖苷酶水解為配基型異黃酮（soybean isoflavone aglycones，SIA），能夠被人體更好地吸收利用[6]。有許多研究已經(jīng)證明，通過(guò)添加產(chǎn)β?葡萄糖苷酶的微生物對(duì)豆?jié){進(jìn)行發(fā)酵，可以提高豆?jié){中配基型異黃酮的含量[7]。此外，微生物發(fā)酵作為傳統(tǒng)加工工藝，在實(shí)際發(fā)酵體系中，因?yàn)槲⑸锂a(chǎn)生的酶系復(fù)雜，會(huì)有多種代謝產(chǎn)物生成，對(duì)營(yíng)養(yǎng)提升和有害物質(zhì)的代謝有著極佳處理效果，為發(fā)酵食品提供更高價(jià)值。

為了研究產(chǎn)β?葡萄糖苷酶的菌株在發(fā)酵豆?jié){時(shí)菌株的代謝行為和豆?jié){營(yíng)養(yǎng)成分的變化，本文選取一株前期篩選到的產(chǎn)β?葡萄糖苷酶的植物乳植桿菌c4?3發(fā)酵豆?jié){，測(cè)定發(fā)酵前后豆?jié){中大豆異黃酮種類(lèi)和含量；并進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析，利用液相色譜四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（liquid chromatograph?quadru?pole?time of flight，LC?QTOF），通過(guò)主成分分析（princi?pal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal projections to latent structures?discriminant analysis，OPLS?DA）等方法，分析發(fā)酵前后豆?jié){中SIG 的代謝，并確定主要代謝通路。同時(shí)，解析植物乳植桿菌c4?3發(fā)酵豆?jié){中除異黃酮外，其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或有害物質(zhì)的含量變化，以整體評(píng)價(jià)植物乳植桿菌c4?3 代謝行為。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

產(chǎn)β?葡萄糖苷酶的植物乳植桿菌c4?3（Lactiplan?tibacillusplantarumc4?3）：大連工業(yè)大學(xué)中國(guó)海洋食品研發(fā)中心；大豆：市售；MRS 肉湯培養(yǎng)基、瓊脂粉：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純）、大豆苷元（≥98%）、大豆苷、金雀異黃酮（≥98%）、染料木素：上海麥克林生化科技有限公司；甲醇（色譜純）：斯百全化學(xué)（上海）有限公司；L?2?氯苯丙氨酸（≥98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；冰乙酸（色譜純）：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

pH 計(jì)（多參數(shù)測(cè)試儀S400?B）：梅特勒?托利多儀器（上海）有限公司；高效液相色譜儀（Agilent 1260 In?finity）、Acquity UPLC HSS T3 色譜柱（1.8μm，2.1 mm×100 mm）：安捷倫（美國(guó)）科技有限公司；超高效液相色譜儀（ACQUITY UPLC I?Class）、高分辨質(zhì)譜儀（UPLC Xevo G2?XS QTOF）：沃特世科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵豆?jié){的制備

挑取植物乳植桿菌c4?3 單菌落接種于MRS 液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600=0.6。取200 g 已浸泡10 h 的大豆，加水至1 000 mL，豆?jié){機(jī)研磨破碎后，采用60 目篩過(guò)濾豆?jié){，121 ℃滅菌15 min，分裝于50 mL 離心管中，每管分裝5 mL。按照1%接種量，將活化好的菌株接種于豆?jié){，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)12 h，得到發(fā)酵豆?jié){。

1.2.2 發(fā)酵豆?jié){的產(chǎn)酸速率測(cè)定

在豆?jié){發(fā)酵2、4、6、8、10、12 h 時(shí)，分別用pH 計(jì)和酸堿滴定法測(cè)量pH 值和滴定酸度，表征產(chǎn)酸速率。

1.2.3 發(fā)酵豆?jié){異黃酮含量測(cè)定

取15 mL 發(fā)酵豆?jié){在-80 ℃預(yù)凍12 h，再凍干72 h。參考Rostagno 等[8]的方法提取異黃酮，取0.5 g 凍干豆?jié){，加入15 mL 50%乙醇溶液，超聲2 h 后，8 000 r/min離心30 min，取上清液，0.22μm 濾膜過(guò)濾。

參考Wu 等[9]的高效液相色譜法測(cè)定異黃酮含量。選取常見(jiàn)的4 種異黃酮進(jìn)行測(cè)定，包括屬于SIG 的大豆苷和染料木素，以及屬于SIA 的金雀異黃酮和大豆苷元。通過(guò)添加內(nèi)標(biāo)確定出峰時(shí)間，并根據(jù)標(biāo)品所得回歸方程換算樣品中4 種異黃酮含量。

1.2.4 發(fā)酵豆?jié){的可溶性蛋白含量測(cè)定

參考吳成[10]的方法，繪制可溶性蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=2.114x+0.560 7（R2=0.999），并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算豆?jié){中可溶蛋白含量。

1.2.5 發(fā)酵豆?jié){氨基態(tài)氮含量測(cè)定

參考徐鑫等[11]的方法測(cè)定發(fā)酵豆?jié){的氨基態(tài)氮含量。取發(fā)酵豆?jié){1.25 mL，定容于25 mL 容量瓶，測(cè)量用去離子水作空白對(duì)照，甲醛滴定法測(cè)定發(fā)酵豆?jié){的氨基態(tài)氮含量，記錄使用NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，氨基態(tài)氮含量計(jì)算公式如下。

式中：X為氨基態(tài)氮含量，g/100 mL；V為樣品滴定消耗氫氧化鈉體積，mL；V0為空白樣品消耗氫氧化鈉體積，mL；N為NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，0.1 mol/L；0.014為氮的毫克當(dāng)量。

1.2.6 發(fā)酵豆?jié){的持水力測(cè)定

參考Wang 等[12]的方法測(cè)定發(fā)酵豆?jié){持水力，計(jì)算公式如下。

式中：W為發(fā)酵豆?jié){持水力，%；W1為離心后樣品的質(zhì)量，g；W2為離心前樣品的質(zhì)量，g。

1.2.7 發(fā)酵豆?jié){的抗氧化能力測(cè)定

抗氧化能力的測(cè)定采用1，1?二苯基?2?三硝基苯肼（1，1?diphenyl?2?picrylhydrazyl，DPPH）法和2，2?聯(lián)氮?二（3?乙基?苯并噻唑?6?磺酸）二銨鹽[2′?azinobis?（3?ethylbenzthiazoline?6?sulphonate），ABTS]法測(cè)定。

1.2.7.1 DPPH 自由基清除率的測(cè)定

分別取2 mL 發(fā)酵后的豆?jié){，在10 000 r/min 條件下離心10 min。取1 mL 離心上清液，超純水稀釋4 倍，參考鄭茵[13]的方法測(cè)定DPPH 自由基清除率，計(jì)算公式如下。

式中：Y為DPPH 自由基清除率，%；Ai為1 mL DPPH+1 mL 樣品的吸光度；Aj為1 mL 蒸餾水+1 mL 樣品的吸光度；Ac為1 mL DPPH+1 mL 蒸餾水的吸光度。

1.2.7.2 ABTS+自由基清除率的測(cè)定

分別取2 mL 豆?jié){，在10 000 r/min 條件下離心10 min，取1 mL 離心上清液，超純水稀釋10 倍，參考鄭茵[13]的方法測(cè)定ABTS+自由基清除率，計(jì)算公式如下。

式中：N為ABTS+自由基清除率，%；AS為樣品的吸光度；AC為對(duì)照品的吸光度。

1.2.8 發(fā)酵豆?jié){的總酚含量測(cè)定

參考李穎等[14]的方法，繪制沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到y(tǒng)=0.250 5x-0.202，并根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算發(fā)酵豆?jié){中的總酚含量。

1.2.9 發(fā)酵豆?jié){代謝組測(cè)定

選用L?2?氯苯丙氨酸作為內(nèi)標(biāo)，參考Dunn 等[15]、Want 等[16]的方法并稍作修改。量取100 μL 發(fā)酵豆?jié){，加入500 μL 含有內(nèi)標(biāo)的提取液，渦旋混勻30 s。之后置于冰水浴下超聲10 min。采用超高效液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜儀測(cè)定，進(jìn)樣體積為1 μL，其余條件參考Wang 等[17]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1）β?葡萄糖苷酶及大豆異黃酮的數(shù)據(jù)分析使用Origin 2019b 軟件。GraphPad Prism 9.0.0.121 軟件用于分析差異以計(jì)算p值。采用生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行，所有試驗(yàn)完成3 個(gè)平行，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用單因素方差分析和鄧肯多范圍檢驗(yàn)確定平均值的顯著差異。2）代謝組學(xué)試驗(yàn)使用UHPLC/QTOF?MS 進(jìn)行原始數(shù)據(jù)導(dǎo)出及收集。3）代謝組學(xué)數(shù)據(jù)預(yù)處理：將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Progenesis QI 軟件做峰提取、峰對(duì)齊等數(shù)據(jù)處理操作，計(jì)算峰強(qiáng)度，精確質(zhì)量和保留時(shí)間，基于Progen?esis QI 軟件在線METLIN 數(shù)據(jù)庫(kù)、公共數(shù)據(jù)庫(kù)以及百邁客自建庫(kù)進(jìn)行鑒定，同時(shí)進(jìn)行理論碎片識(shí)別，母離子質(zhì)量數(shù)偏差100 ppm、碎片離子質(zhì)量數(shù)偏差50 ppm 以內(nèi)[17]。4）將編輯后的代謝組數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入軟件，進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析處理，相關(guān)軟件見(jiàn)表1。

表1 數(shù)據(jù)分析軟件Table 1 Data analysis software

5）尋找差異性表達(dá)代謝物：結(jié)合單變量統(tǒng)計(jì)分析和多元統(tǒng)計(jì)分析的方法，并根據(jù)數(shù)據(jù)特性從多角度分析，最終準(zhǔn)確挖掘差異代謝物?；贠PLS?DA 結(jié)果，使用R2Y 和Q2 兩個(gè)參數(shù)用來(lái)評(píng)價(jià)模型的預(yù)測(cè)能力，獲得的多變量分析OPLS?DA 模型的變量重要性投影（variable importance in projection，VIP），VIP＞1 且p＜0.05 的化合物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。6）通路分析：將這些潛在生物標(biāo)記物輸入KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.kegg.com/）進(jìn)行匹配，運(yùn)用通路富集分析并計(jì)算富集因子，尋找顯著性代謝通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵豆?jié){產(chǎn)酸及異黃酮變化

發(fā)酵豆?jié){產(chǎn)酸及異黃酮變化見(jiàn)圖1。

圖1 發(fā)酵豆?jié){產(chǎn)酸及異黃酮變化Fig.1 Changes in acid production and isoflavones in fermented soymilk

由圖1a 可知，在產(chǎn)酸方面，未發(fā)酵豆?jié){在12 h內(nèi)，pH 值與滴定酸度基本不變，pH 值保持在6.5 左右，滴定酸度保持在2.0°T 左右。發(fā)酵后pH 值明顯降低，在發(fā)酵12 h 時(shí)降至4.4；滴定酸度明顯升高，在發(fā)酵10 h 時(shí)增加至4.6°T，不過(guò)在10～12 h 時(shí)略有下降，下降至4.3°T。pH 值的降低與滴定酸度的升高，是因?yàn)榫暝诎l(fā)酵豆?jié){時(shí)產(chǎn)生大量有機(jī)酸，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，含量逐漸增加。但發(fā)酵后期滴定酸度的下降，是因?yàn)殡S著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，乳酸菌活力降低、產(chǎn)酸速率降低，有機(jī)酸被代謝。

由圖1b 可知，在異黃酮含量變化方面，豆?jié){經(jīng)植物乳植桿菌c4?3 發(fā)酵后SIG（大豆苷、染料木素）的含量明顯下降，大豆苷含量從41.86 mg/L 減少至2.10 mg/L，轉(zhuǎn)化率為94.98%；染料木苷含量從100.35 mg/L 減少至3.17 mg/L，轉(zhuǎn)化率為96.84%。SIA（大豆苷元、金雀異黃酮）含量明顯上升，金雀異黃酮從9.68 mg/L 增加至26.61 mg/L；大豆苷元從13.93 mg/L 增加至68.43 mg/L。這是因?yàn)橹参锶橹矖U菌c4?3 在發(fā)酵時(shí)能夠產(chǎn)生β?葡萄糖苷酶，能夠?qū)l(fā)酵豆?jié){中的SIG 水解為SIA。Das等[7]發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌也可將發(fā)酵豆?jié){中的SIG 轉(zhuǎn)化為SIA，其中大豆苷轉(zhuǎn)化率為55.43%，染料木苷轉(zhuǎn)化率為72.30%；Feng 等[18]采用植物乳植桿菌處理豆?jié){，發(fā)現(xiàn)處理后的豆?jié){大豆苷轉(zhuǎn)化率為64.58%，染料木苷轉(zhuǎn)化率為74.43%，低于本研究的植物乳植桿菌c4?3。

2.2 豆?jié){發(fā)酵后理化性質(zhì)變化

豆?jié){發(fā)酵后理化性質(zhì)變化見(jiàn)表2。

表2 豆?jié){發(fā)酵前后理化性質(zhì)Table 2 Physical and chemical properties of soymilk before and after fermentation

由表2 可知，豆?jié){發(fā)酵后可溶性蛋白含量顯著下降，影響可溶性蛋白含量的因素包括蛋白質(zhì)的變性和蛋白的水解。氨基態(tài)氮是判斷蛋白水解度的重要指標(biāo)。氨基態(tài)氮含量在發(fā)酵前后無(wú)顯著差異，說(shuō)明可溶性蛋白含量的下降不是蛋白水解導(dǎo)致的。

持水力是決定發(fā)酵豆?jié){品質(zhì)的重要指標(biāo)，影響發(fā)酵豆?jié){持水力的因素包括發(fā)酵豆?jié){的氨基酸組成、蛋白質(zhì)構(gòu)象、類(lèi)型和數(shù)量、發(fā)酵產(chǎn)酸量、發(fā)酵代謝物等。隨著豆?jié){發(fā)酵，酸大量積累，大豆蛋白變性，發(fā)生沉淀，可溶蛋白的含量顯著減少，持水力顯著增加。

豆?jié){發(fā)酵前后總酚含量和抗氧化活性無(wú)顯著變化，總黃酮含量減少，這與Asmaa 等[19]的研究結(jié)果類(lèi)似。目前關(guān)于發(fā)酵前后豆?jié){抗氧化活性的變化結(jié)論有兩種，一些研究發(fā)現(xiàn)豆?jié){發(fā)酵后總酚含量、總黃酮含量、抗氧化能力均增加，并認(rèn)為大豆的抗氧化活性大多與酚類(lèi)物質(zhì)呈正相關(guān)[20]；而一些研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后黃酮、總酚含量降低，抗氧化能力依舊顯著增加[21]。這是因?yàn)榇蠖怪械亩喾宇?lèi)抗氧化劑主要有異黃酮、綠原酸異構(gòu)體、咖啡酸和阿魏酸，這些化合物主要以糖苷的形式出現(xiàn)。而抗氧化能力與抗氧化物質(zhì)羥基化程度和羥基位置有關(guān)[22]，SIA 的抗氧化活性高于SIG。因此，本文雖因微生物生物轉(zhuǎn)化導(dǎo)致總黃酮減少，但因?yàn)镾IA含量升高，抗氧化活性并未發(fā)生顯著變化。

2.3 代謝組分析

將植物乳植桿菌c4?3發(fā)酵豆?jié){與未發(fā)酵豆?jié){進(jìn)行PCA 分析和OPLS?DA 分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 發(fā)酵豆?jié){PCA 及OPLS?DA 分析Fig.2 Principal component analysis and orthogonal partial least squares?discriminant analysis of fermented soymilk

R2Y 和Q2Y 越接近于1 時(shí)表示模型越穩(wěn)定可靠，由圖2 可知，所建模型均可靠。

2.4 代謝差異物分析

為進(jìn)一步討論豆?jié){發(fā)酵前后代謝組的差異，利用clusterProfiler 選用超幾何檢驗(yàn)的方法對(duì)差異代謝物京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）的注釋結(jié)果進(jìn)行富集分析，富集后選取通路中注釋到差異代謝物最多的前20條代謝通路，繪制富集柱形圖。計(jì)算20 條通路上的富集因子，繪制差異代謝物KEGG 富集因子氣泡圖，其中富集因子越大，表示差異代謝物在該通路的富集顯著性越可靠。根據(jù)富集因子確定5條主要代謝途徑，并繪制差異代謝物KEGG 富集網(wǎng)絡(luò)圖，具體結(jié)果見(jiàn)圖3～圖4。豆?jié){發(fā)酵前后代謝物變化見(jiàn)表3。

圖3 豆?jié){發(fā)酵前后差異代謝物分析Fig.3 Differential metabolites in soymilk before and after fermentation

圖4 發(fā)酵豆?jié){主要代謝途徑Fig.4 Main metabolic pathway of fermented soymilk

表3 豆?jié){發(fā)酵前后代謝物變化Table 3 Changes of metabolite in soymilk before and after fer?mentation

莽草酸代謝途徑廣泛存在于植物、真菌和微生物中，主要用于合成芳香化合物，為許多代謝途徑提供前體物質(zhì)，與類(lèi)黃酮生物合成有關(guān)。由表3 可知，豆?jié){經(jīng)過(guò)發(fā)酵，莽草酸含量由2 697.57 mg/L 減少至2 254.68 mg/L。這可能是發(fā)酵時(shí)微生物產(chǎn)生復(fù)雜酶系，使莽草酸轉(zhuǎn)變?yōu)榉种幔蠼?jīng)預(yù)苯酸進(jìn)一步生成苯丙氨酸和酪氨酸。苯丙氨酸脫氨后可形成肉桂酸，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為咖啡酸和查爾酮類(lèi)物質(zhì)，再通過(guò)類(lèi)黃酮生物合成途徑生成黃酮類(lèi)物質(zhì)。

許銀彪等[23]對(duì)莽草酸途徑代謝節(jié)點(diǎn)進(jìn)行挖掘，證明其與酪氨酸的合成有關(guān)，在發(fā)酵時(shí)添加5 g/L 莽草酸，可將菌株HGPA 與HGPAK 的酪氨酸合成量從1 200 mg/L，分別提升至1 311 mg/L 和1 490 mg/L。張妍等[24]在用乳酸菌發(fā)酵玉米汁時(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)苯丙類(lèi)化合物和黃酮類(lèi)化合物發(fā)生了變化?？Х纫虼x與嘌呤代謝有關(guān)，咖啡因在酶的作用下可轉(zhuǎn)化為可可堿，豆?jié){中可可堿含量在發(fā)酵后從1 524.58 mg/L 增加至1 732.17 mg/L；可可堿可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為甲基嘌呤，豆?jié){中甲基嘌呤含量在發(fā)酵后從2 075.42 mg/L 增加至2 662.90 mg/L；最終甲基嘌呤生成黃嘌呤，進(jìn)入嘌呤代謝。豆?jié){發(fā)酵后黃嘌呤的前體物質(zhì)均上升，但黃嘌呤含量反而下降，含量從2 441.26 mg/L 減少至1 547.69 mg/L，這可能是植物乳植桿菌c4?3 在發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生有關(guān)嘌呤降解的酶所致（圖4b）。

2.5 發(fā)酵豆?jié){營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分析

根據(jù)OPLS?DA 得分圖，取VIP＞1 且p＜0.05 的化合物作為差異代謝物，從營(yíng)養(yǎng)方面考慮，選取與黃酮、氨基酸、嘌呤、維生素有關(guān)的差異代謝物進(jìn)行分析，并與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，作為潛在生物標(biāo)記物，并參考KEGG Pathway map 繪制代謝通路圖，具體結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 植物乳植桿菌c4?3發(fā)酵豆?jié){代謝Fig.5 Metabolism of soymilk fermented with Lactiplantibacillus plantarum c4?3

由圖5a 可知，植物乳植桿菌c4?3發(fā)酵豆?jié){與未發(fā)酵豆?jié){相比，在β?葡萄糖苷酶的影響下，兒茶素的含量從72.69 mg/L 增加至1 389.50 mg/L。此外，通路上一些代謝差異物的含量變化，可能不是β?葡萄糖苷酶作用的結(jié)果，如高良姜素的含量從9 224.13 mg/L 增加至18 716.58 mg/L；槲皮素?3?硫酸鹽和二氫山奈酚分別從66.58、465.25 mg/L 增加至561.43、892.81 mg/L。

嘌呤的代謝可以總結(jié)為兩個(gè)關(guān)鍵步驟，首先是次黃嘌呤核苷酸（inosine monophosphate，IMP）的合成，合成的IMP 不會(huì)在細(xì)胞內(nèi)堆積，會(huì)迅速進(jìn)行下一步轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換為腺嘌呤核苷酸（adenosine monophosphate，AMP）和鳥(niǎo)嘌呤核苷酸（guanosine monophosphate，GMP）。AMP 和GMP 進(jìn)一步反應(yīng)，變?yōu)榇蠖怪泻枯^高的4 種嘌呤。在人體內(nèi)，4 種嘌呤會(huì)代謝為尿酸，危害人體健康。豆?jié){發(fā)酵后，IMP 合成通路上的中間物質(zhì)均有升高，但4 種嘌呤總量反而減少了836.08 mg/L，且嘌呤代謝產(chǎn)物尿囊素和尿囊酸的含量增加，分別從77.63 mg/L和876.07 mg/L 變?yōu)?48.54 mg/L 和1 025.81 mg/L。這或許是因?yàn)橹参锶橹矖U菌c4?3 能夠產(chǎn)生尿酸氧化酶，在尿酸氧化酶的作用下尿酸能夠分解成尿囊素，尿囊素進(jìn)一步水解生成尿囊酸（圖5b）。與尿酸不同，尿囊素和尿囊酸在水中溶解度高，很容易排除出。谷巍等[25]也發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)尿酸氧化酶的乳酸菌，并將其應(yīng)用于畜牧業(yè)。

發(fā)酵豆?jié){有關(guān)氨基酸代謝主要涉及18 種氨基酸代謝變化，這些代謝離不開(kāi)酶的產(chǎn)生，說(shuō)明植物乳植桿菌c4?3 在發(fā)酵豆?jié){時(shí)產(chǎn)生了復(fù)雜的酶系。在有關(guān)氨基酸代謝的差異通路中，發(fā)現(xiàn)γ?氨基丁酸（γ?aminobu?tyric acid，GABA）和高肌肽（homocarnosine）的存在。其中，γ?氨基丁酸從220.88 mg/L 上升至318.14 mg/L，而高肌肽從1 069.94 mg/L 上升至1 568.42 mg/L。γ?氨基丁酸是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的重要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在自然界中分布廣泛，且微生物是目前γ?氨基丁酸的主要來(lái)源。谷氨酸脫羧酶（glutamate decarbox?ylase，GAD）是γ?氨基丁酸合成的關(guān)鍵酶，Liu 等[26]發(fā)現(xiàn)了幾株高產(chǎn)γ?氨基丁酸的乳酸菌，并研究在不同條件下，谷氨酸脫羧酶對(duì)γ?氨基丁酸轉(zhuǎn)化率的影響。高肌肽是γ?氨基丁酸和組氨酸的二肽，具有抗驚厥作用，還可以抗氧化、抗炎、防止DNA 損傷和抑制晚期糖基化的終產(chǎn)物形成[27]。

除了對(duì)上述比較完整的代謝通路進(jìn)行關(guān)注外，還發(fā)現(xiàn)磷酸吡哆醇（pyridoxine phosphate）、吡哆醇（pyri?doxal）的含量明顯增加，分別從152.97 mg/L 和無(wú)信號(hào)峰增加至310.12 mg/L 和127.62 mg/L，這兩種物質(zhì)都是維生素B6（vitamin B6）的存在形式。維生素B6在醫(yī)療健康領(lǐng)域有極大貢獻(xiàn)，如預(yù)防骨質(zhì)疏松、預(yù)防心血管疾病等[28]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)攝入量較高時(shí)，維生素B6的需求量可能會(huì)增加，這是因?yàn)榫S生素B6是人體內(nèi)某些輔酶的組成成分，參與多種代謝反應(yīng)，尤其與氨基酸代謝有密切關(guān)系[29]。例如在γ?氨基丁酸生產(chǎn)中，維生素B6會(huì)作為輔酶，發(fā)揮重要作用[30]。

3 結(jié)論

本文對(duì)植物乳植桿菌c4?3發(fā)酵豆?jié){的產(chǎn)酸速率、基礎(chǔ)理化性質(zhì)、發(fā)酵前后異黃酮組分及含量變化、其它營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)豆?jié){發(fā)酵后pH 值明顯下降，在發(fā)酵12 h 時(shí)降至4.4；滴定酸度明顯升高，在發(fā)酵10 h 時(shí)達(dá)到峰值4.6°T，這主要是由發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸所致，有助于豆?jié){的儲(chǔ)存。在植物乳植桿菌c4?3 作用下，發(fā)酵豆?jié){中的SIG 被大量轉(zhuǎn)化，其中大豆苷轉(zhuǎn)化率為94.98%，染料木素轉(zhuǎn)化率為96.84%；SIA 含量明顯增加，金雀異黃酮含量提升了1.75 倍，大豆苷元含量提升了3.91 倍，說(shuō)明植物乳植桿菌c4?3 產(chǎn)生的β?葡萄糖苷酶能夠有效水解SIG，使其轉(zhuǎn)化為人體吸收利用率更好的SIA。

通過(guò)對(duì)植物乳植桿菌c4?3發(fā)酵豆?jié){的非靶向代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵涉及5 條主要代謝通路，分別為莽草酸途徑、咖啡因代謝、類(lèi)黃酮生物合成、嘌呤代謝和產(chǎn)熱作用。豆?jié){發(fā)酵后不止異黃酮含量發(fā)生變化，γ?氨基丁酸的含量也上調(diào)了44.03%，兒茶素、磷酸吡哆醇的含量分別上調(diào)了18.12 倍和1.03 倍。且植物乳植桿菌c4?3 在發(fā)酵時(shí)可能產(chǎn)生了有關(guān)嘌呤代謝的酶系，在嘌呤前體物增加的情況下，嘌呤總量反而減少了33.07%，主要是代謝生成了尿囊素和尿囊酸，這將降低因嘌呤攝入過(guò)多發(fā)生痛風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)。

上述研究結(jié)果表明，植物乳植桿菌c4?3 是發(fā)酵豆?jié){的優(yōu)良菌株，能夠有效提升豆?jié){的營(yíng)養(yǎng)。本研究對(duì)發(fā)酵豆?jié){的生產(chǎn)具有重要理論與實(shí)踐意義，也為植物乳植桿菌c4?3 的后續(xù)開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。