松果菊苷對尿毒癥大鼠腎損傷的影響及機制 Δ

熊 瑋，彭 斌，高 智（武漢市中醫(yī)醫(yī)院腎病科，武漢 430014）

尿毒癥（uremia，URE）是慢性腎臟病的終末階段，也是急性腎損傷發(fā)展的最后狀態(tài)。急性腎損傷若不及時有效地治療，隨著疾病的進展會出現(xiàn)惡化或延遲，進而發(fā)展為慢性腎功能不全、腎功能衰竭，最終發(fā)展為URE。

管花肉蓯蓉是一種具有肝、腎、腸保護作用的植物，松果菊苷（echinacoside，ECH）是其主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗神經(jīng)毒素、抗細胞凋亡和保護神經(jīng)等多種生物學(xué)效應(yīng)[1]。目前ECH 在臨床上的應(yīng)用尚未見報道，但有研究顯示ECH 可通過降低URE 大鼠血清中白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18 的含量，改善其腎功能[2]；ECH可修復(fù)免疫系統(tǒng)動態(tài)平衡、抑制炎癥反應(yīng)、保護腎功能，改善膿毒癥大鼠急性腎損傷[3]。ECH還能夠通過抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路來抑制下游炎癥因子的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)[4]。p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）是NF-κB 上游的信號通路，抑制p38 MAPK/NF-κB信號通路的激活能減輕5/6腎切除大鼠炎癥反應(yīng)和腎損傷[5]?；诖耍疚难芯苛薊CH對URE大鼠腎損傷和p38 MAPK/NF-κB信號通路的影響，初步探討其作用機制，旨在為URE的治療提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括JIDI-20D 型臺式多用途高速離心機（廣州吉迪儀器有限公司）、HBS-1096A型酶標儀（南京德鐵實驗設(shè)備有限公司）、BX53M 型光學(xué)顯微鏡[儀景通光學(xué)科技（上海）有限公司]、LSM 900 型共聚焦顯微鏡（北京普瑞賽司儀器有限公司）、Mini-PROTEAN Tetra Cell 型電泳儀[迪圖（上海）生物科技有限公司]、Tanon MINI Space系列多功能凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能生命科學(xué)有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

ECH（貨號HY-N0020，純度99.65%）和茴香霉素（p38 MAPK 信號通路激活劑，貨號HY-18982，純度99.44%）均購自美國MCE 公司；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-1β、IL-6 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（貨號分別為J22405、J22380、J22434）均購自武漢吉立德生物科技有限公司；血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、β2-微球蛋白（β2-microglobulin，β2-MG）、血肌酐（serum creatinine，Scr）、24 h 尿蛋白（24 h urine protein，24 h UP）、中性粒細胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）、腎損傷分子1（kidney injury molecule-1，KIM-1）、胱抑素C（cystatin C，Cys-C）ELISA 試劑盒（貨號分別為CB10659-Ra、CB10155-Ra、CB12464-Ra、CB10651-Ra、CB10849-Mu、CB10747-Ra、CB10229-Ra）均購自上?？瓢┥锛夹g(shù)有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）ELISA試劑盒（貨號分別為ml077384、ml059387）均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；兔抗p38 MAPK單克隆抗體和兔抗磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）多克隆抗體（貨號分別為AF7668、AF5887）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；小鼠抗E-上皮鈣黏素（E-cadherin）單克隆抗體、兔抗α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle protein，α-SMA）單克隆抗體、兔抗NF-κB p65多克隆抗體、兔抗磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）單克隆抗體、兔抗β-actin 多克隆抗體和山羊抗兔IgG 二抗（貨號分別為ab231303、ab124964、ab19870、ab76302、ab8227、ab6721）均購自英國Abcam公司。

1.3 動物

SPF級SD大鼠，雄性，體重200～220 g，購自湖北貝恩特生物科技有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（鄂）2021-0027。本研究方案符合實驗動物倫理學(xué)要求，經(jīng)武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司倫理委員會審核批準，批件號HLK-202304-03。

2 方法

2.1 URE大鼠模型建立

大鼠在適宜的溫度和濕度環(huán)境下，自由飲食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。根據(jù)參考文獻方法[6]，利用5/6 腎切除法建立URE 大鼠模型：用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，背部剃毛消毒，左側(cè)背部處切口，暴露腎臟，分離腎組織，解剖腎包膜，切除腎臟上、下極部位約2/3 的左腎，止血復(fù)位縫合傷口；1周后，再次打開切口完全切除右腎。以僅切開大鼠左側(cè)背部，暴露腎臟，但不摘除腎臟的大鼠作為假手術(shù)組（Sham 組）。術(shù)后8 周，檢測Sham 組和URE 大鼠血清中BUN 和Scr 水平，如果URE 大鼠血清中BUN、Scr水平為Sham組的2～3倍，則表示URE大鼠模型建立成功。

2.2 分組與給藥

將建模成功的URE大鼠分為尿毒癥（URE）組、ECH低劑量（ECH-L）組、ECH 中劑量（ECH-M）組、ECH 高劑量（ECH-H）組和ECH 高劑量+茴香霉素（ECH-H+Ani）組，每組12 只。ECH-L、ECH-M、ECH-H 組大鼠分別灌胃10、20、40 mg/（kg·d）ECH[2]；ECH-H+Ani 組大鼠灌胃40 mg/（kg·d）ECH，尾靜脈注射2 mg/（kg·d）茴香霉素[7]；Sham 組和URE 組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥8周。

2.3 炎癥、腎功能及腎損傷相關(guān)指標檢測

各組大鼠末次給藥2 h 后，麻醉，眼眶靜脈采血，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、BUN、β2-MG、Scr、NGAL、KIM-1 和Cys-C 水平。使用代謝籠收集各組大鼠24 h的尿液標本，離心，取上清液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測其中24 h UP水平。

2.4 脂質(zhì)過氧化和抗氧化活性指標檢測

眼眶靜脈采血后，各組隨機取6只大鼠斷頭處死，分離左腎組織，取部分腎組織進行勻漿，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測腎組織中MDA 水平和SOD活性。

2.5 腎組織病理學(xué)觀察

將各組剩余的6 只大鼠斷頭處死，分離腎組織，用4%多聚甲醛固定，將組織包埋于石蠟中，切片，干燥，脫蠟并用乙醇水合，蘇木精-伊紅（HE）染色5 min，使用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠的腎組織病理學(xué)變化。根據(jù)腎小管壞死、細胞腫脹、空泡化和腎小管上皮細胞脫落的病變部位面積占比，采用半定量組織學(xué)評分法進行評分：0分，＜10%；1分，10%～25%；2分，＞25%～50%；3分，＞50%～75%；4分，＞75%～100%[8]。

2.6 腎組織中α-SMA、E-cadherin陽性表達檢測

取“2.5”項下腎組織切片，脫蠟、脫水，分別加入α-SMA和E-cadherin抗體（稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜；再加入相應(yīng)二抗，室溫孵育；用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）復(fù)染細胞核，使用共聚焦顯微鏡觀察α-SMA、E-cadherin陽性表達情況，并計算陽性表達率：陽性表達率＝陽性細胞數(shù)/全部細胞數(shù)×100%。

2.7 腎組織中p38 MAPK/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達檢測

取各組大鼠腎組織，提取總蛋白，檢測蛋白濃度，電泳、分離后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，并用5%脫脂奶粉封閉1 h；加入p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65、p-NF-κB p65、β-actin抗體（稀釋比例分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶500、1∶500、1∶1 000），4 ℃孵育過夜；加入山羊抗兔IgG 二抗（稀釋比例為1∶5 000），室溫孵育1 h；ECL顯影，使用Image J 軟件分析，以目標蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）灰度值比值表示蛋白表達水平，再以p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值表示p38 MAPK、NF-κB p65的磷酸化水平。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；不符合正態(tài)分布時，組間比較采用Mann-whitneyU秩和檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 ECH對URE大鼠血清中炎癥因子水平的影響

與Sham 組相比，URE 組大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6 水平均顯著升高（P＜0.05）；與URE 組相比，ECH-L、ECH-M、ECH-H 組大鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平均呈劑量依賴性降低（P＜0.05）；與ECH-H 組相比，ECH-H+Ani組大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 ECH 對URE 大鼠血清中炎癥因子水平的影響（±s，n＝12，pg/mL）

表1 ECH 對URE 大鼠血清中炎癥因子水平的影響（±s，n＝12，pg/mL）

a：與Sham組相比，P＜0.05；b：與URE組相比，P＜0.05；c：與ECHL組相比，P＜0.05；d：與ECH-M組相比，P＜0.05；e：與ECH-H組相比，P＜0.05。

IL-6 32.61±1.05 58.42±3.47a 51.66±2.55b 46.32±2.12bc 37.86±1.74bcd 42.15±1.87e 205.987＜0.001組別Sham組URE組ECH-L組ECH-M組ECH-H組ECH-H+Ani組FP TNF-α 14.85±1.32 42.62±4.06a 36.04±2.17b 27.42±1.86bc 19.23±2.01bcd 24.01±1.31e 242.772＜0.001 IL-1β 66.43±5.13 161.20±13.86a 134.57±11.23b 108.69±9.11bc 75.92±5.28bcd 89.41±4.92e 198.635＜0.001

3.2 ECH 對URE 大鼠腎功能及腎損傷相關(guān)指標的影響

與Sham 組相比，URE 組大鼠的BUN、Scr、β2-MG、24 h UP、NGAL、KIM-1 和Cys-C 水平均顯著升高（P＜0.05）；與URE 組相比，ECH-L、ECH-M、ECH-H 組大鼠的BUN、Scr、β2-MG、24 h UP、NGAL、KIM-1 和Cys-C水平均呈劑量依賴性降低（P＜0.05）；與ECH-H組相比，ECH-H+Ani 組大鼠的BUN、Scr、β2-MG、24 h UP、NGAL、KIM-1 和Cys-C 水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 ECH對URE大鼠腎功能指標的影響（±s，n＝12）

表2 ECH對URE大鼠腎功能指標的影響（±s，n＝12）

a：與Sham組相比，P＜0.05；b：與URE組相比，P＜0.05；c：與ECH-L組相比，P＜0.05；d：與ECH-M組相比，P＜0.05；e：與ECH-H組相比，P＜0.05。

組別Sham組URE組ECH-L組ECH-M組ECH-H組ECH-H+Ani組腎功能指標腎損傷指標KIM-1/（ng/L）24.36±2.04 84.51±6.97a 71.62±6.01b 58.19±4.32bc 36.88±2.12bcd 45.17±3.45e 291.283＜0.001 Scr/（μmol/L）41.24±2.13 82.03±7.62a 65.51±4.32b 54.06±3.27bc 46.17±2.09bcd 51.78±2.94e 150.935＜0.001 β2-MG/（ng/mL）12.54±1.03 26.48±1.94a 23.12±1.83b 19.53±1.47bc 14.17±1.28bcd 17.62±1.30e 147.683＜0.001 24 h UP/mg 30.18±2.66 62.01±6.07a 56.32±3.89b 49.58±4.01bc 38.63±2.74bcd 45.88±2.15e 111.055＜0.001 FP Cys-C/（mg/L）0.36±0.01 1.17±0.21a 0.94±0.08b 0.75±0.06bc 0.41±0.03bcd 0.55±0.02e 130.543＜0.001 BUN/（mmol/L）16.34±1.88 38.72±2.76a 34.25±2.34b 28.94±2.02bc 20.38±1.37bcd 25.42±1.82e 196.250＜0.001 NGAL/（ng/mL）3.18±0.12 8.25±1.03a 7.13±0.69b 5.87±0.35bc 3.65±0.20bcd 4.43±0.17e 167.450＜0.001

3.3 ECH 對URE 大鼠脂質(zhì)過氧化和抗氧化活性指標的影響

與Sham 組相比，URE 組大鼠的MDA 水平顯著升高，SOD活性顯著降低（P＜0.05）；與URE組相比，ECH-L、ECH-M、ECH-H組大鼠的MDA水平均呈劑量依賴性降低，SOD活性均呈劑量依賴性升高（P＜0.05）；與ECH-H組相比，ECH-H+Ani 組MDA 水平顯著升高，SOD 活性顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表3 ECH 對URE 大鼠脂質(zhì)過氧化和抗氧化活性指標的影響（±s，n＝6）

表3 ECH 對URE 大鼠脂質(zhì)過氧化和抗氧化活性指標的影響（±s，n＝6）

a：與Sham組相比，P＜0.05；b：與URE組相比，P＜0.05；c：與ECHL組相比，P＜0.05；d：與ECH-M組相比，P＜0.05；e：與ECH-H組相比，P＜0.05。

SOD/（U/mg）405.08±11.53 262.54±4.32a 293.17±11.06b 332.85±8.17bc 376.24±9.54bcd 341.10±5.09e 214.835＜0.001組別Sham組URE組ECH-L組ECH-M組ECH-H組ECH-H+Ani組FP MDA/（nmol/mg）3.67±0.18 9.34±0.87a 7.65±0.52b 6.49±0.47bc 4.03±0.20bcd 5.34±0.23e 124.859＜0.001

3.4 ECH 對URE 大鼠腎組織病理學(xué)變化及腎損傷評分的影響

與Sham組相比，URE組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)嚴重破壞，腎小球腫脹嚴重，基質(zhì)增多，系膜增厚，腎小管上皮細胞出現(xiàn)大量損傷壞死，并伴有嚴重的間質(zhì)炎癥，腎損傷評分顯著升高[（3.21±0.55）分vs. Sham組（0.00±0.00）分，P＜0.05]；與URE 組相比，ECH-L、ECH-M、ECH-H 組大鼠腎小球腫脹及上皮細胞損傷壞死明顯減輕，炎癥細胞浸潤明顯減少，腎損傷評分呈劑量依賴性降低[（2.77±0.65）分、（2.35±0.49）分、（1.74±0.46）分vs. URE 組（3.21±0.55）分，P＜0.05]；與ECH-H 組相比，ECH-H+Ani 組大鼠腎小球和腎間質(zhì)組織學(xué)病變加重，腎損傷評分顯著升高[（2.13±0.32）分vs. ECH-H 組（1.74±0.46）分，P＜0.05]。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理學(xué)變化顯微圖（HE染色）

3.5 ECH 對URE 大鼠腎組織中α-SMA 和E-cadherin陽性表達的影響

與Sham 組相比，URE 組大鼠腎組織中α-SMA 陽性表達率顯著升高，E-cadherin 陽性表達率顯著降低（P＜0.05）；與URE 組相比，ECH-L、ECH-M、ECH-H組大鼠腎組織中α-SMA 陽性表達率均呈劑量依賴性降低，E-cadherin 陽性表達率均呈劑量依賴性升高（P＜0.05）；與ECH-H 組相比，ECH-H+Ani 組大鼠腎組織中α-SMA 陽性表達率顯著升高，E-cadherin 陽性表達率顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖2、圖3和表4。

圖2 各組大鼠腎組織中α-SMA陽性表達顯微圖

圖3 各組大鼠腎組織中E-cadherin陽性表達顯微圖

表4 ECH對URE大鼠腎組織中α-SMA和E-cadherin陽性表達率的影響（±s，n＝6，%）

表4 ECH對URE大鼠腎組織中α-SMA和E-cadherin陽性表達率的影響（±s，n＝6，%）

a：與Sham組相比，P＜0.05；b：與URE組相比，P＜0.05；c：與ECHL組相比，P＜0.05；d：與ECH-M組相比，P＜0.05；e：與ECH-H組相比，P＜0.05。

E-cadherin陽性表達率56.76±3.81 16.25±1.94a 24.81±1.85b 35.62±2.74bc 48.33±2.88bcd 41.09±3.01e 172.638＜0.001組別Sham組URE組ECH-L組ECH-M組ECH-H組ECH-H+Ani組FP α-SMA陽性表達率10.35±1.03 66.10±5.17a 54.67±3.89b 43.13±3.13bc 21.47±1.69bcd 27.82±1.12e 282.771＜0.001

3.6 ECH 對URE 大鼠腎組織中p38 MAPK/NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

與Sham 組相比，URE 組大鼠腎組織中p-p38 MAPK/p38 MAPK 和p-NF-κB p65/NF-κB p65 均顯著升高（P＜0.05）；與URE 組相比，ECH-L、ECH-M、ECH-H組大鼠腎組織中p-p38 MAPK/p38 MAPK 和p-NF-κB p65/NF-κB p65均呈劑量依賴性降低（P＜0.05）；與ECHH 組相比，ECH-H+Ani 組大鼠腎組織中p-p38 MAPK/p38 MAPK 和p-NF-κB p65/NF-κB p65 均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖4和表5。

圖4 各組大鼠腎組織中p38 MAPK/NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白表達的電泳圖

表5 ECH對URE大鼠腎組織中p38 MAPK/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達的影響（±s，n＝6）

表5 ECH對URE大鼠腎組織中p38 MAPK/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達的影響（±s，n＝6）

a：與Sham組相比，P＜0.05；b：與URE組相比，P＜0.05；c：與ECHL組相比，P＜0.05；d：與ECH-M組相比，P＜0.05；e：與ECH-H組相比，P＜0.05。

組別Sham組URE組ECH-L組ECH-M組ECH-H組ECH-H+Ani組FP p-p38 MAPK/p38 MAPK 0.13±0.02 0.58±0.06a 0.47±0.02b 0.32±0.01bc 0.18±0.01bcd 0.25±0.03e 197.258＜0.001 p-NF-κB p65/NF-κB p65 0.27±0.01 0.91±0.06a 0.73±0.04b 0.58±0.05bc 0.36±0.02bcd 0.44±0.03e 238.259＜0.001

4 討論

URE是一種與腎功能惡化相關(guān)的臨床疾病，嚴重影響患者的生存質(zhì)量。炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)可能是觸發(fā)5/6 腎切除大鼠腎損傷的關(guān)鍵原因[5]。α-SMA 增加及E-cadherin 減少會促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致腎纖維化[9]。本研究結(jié)果顯示，ECH 干預(yù)后，URE 大鼠腎小球和腎間質(zhì)組織學(xué)病變減輕，腎損傷評分及TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA 水平和α-SMA 陽性表達率均顯著降低，SOD活性和E-cadherin陽性表達率均顯著升高，且呈劑量依賴性。這表明ECH能抑制URE大鼠腎組織炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，避免腎纖維化，改善腎組織病變。

腎功能異常時，腎小球濾過作用降低，尿液中會出現(xiàn)大量的蛋白質(zhì)，故以UP 水平作為檢測腎功能的重要指標之一。BUN 和Scr 常用于評估腎損傷疾病中的腎功能[10]。β2-MG由淋巴細胞產(chǎn)生，是反映腎損傷時腎小球濾過率和近端小管重吸收功能的指標[11]。NGAL、KIM-1 和Cys-C 是檢測腎損傷的生物標志物[12]。本研究結(jié)果顯示，ECH 干預(yù)后，URE 大鼠血清中BUN、Scr、β2-MG、24 h UP、NGAL、KIM-1 和Cys-C 水平均顯著降低，且呈劑量依賴性。這表明ECH能抑制腎損傷標志物分泌，增強腎功能，改善URE大鼠腎損傷。

有研究表明，URE 患者治療后NF-κB 水平下降，炎癥狀態(tài)減輕[13]。URE可通過NF-κB信號通路過度激活來誘發(fā)心肌損傷，而抑制該信號通路過度激活，能緩解炎癥反應(yīng)，保護心肌細胞，預(yù)防URE 心肌病[14]。本研究結(jié)果顯示，ECH 干預(yù)后，URE 大鼠腎組織中p38 MAPK 和NF-κB p65的磷酸化水平均顯著下調(diào)，且呈劑量依賴性。而在ECH 處理的基礎(chǔ)上給予p38 MAPK 激活劑茴香霉素后，與高劑量ECH 組相比，URE 大鼠腎組織中p38 MAPK和NF-κB p65的磷酸化水平均顯著升高，血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、BUN、Scr、β2-MG、24 h UP、NGAL、KIM-1、Cys-C和腎組織中MDA水平、α-SMA陽性表達率均顯著升高，腎組織中SOD活性和E-cadherin陽性表達率均顯著降低，可見茴香霉素逆轉(zhuǎn)了高劑量ECH對URE大鼠腎損傷的改善作用。這表明ECH能抑制p38 MAPK/NF-κB信號通路的表達和激活，抑制腎臟炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護腎功能，減輕URE大鼠腎損傷程度。

綜上所述，ECH可能通過抑制p38 MAPK/NF-κB信號通路的激活來抑制URE 大鼠的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，增強腎功能，改善腎損傷。但其在臨床上改善URE癥狀的具體作用效果還需要進一步研究。