不同香菇品種拮抗反應(yīng)·ISSR標(biāo)記與農(nóng)藝性狀分析

張玉鐸 郭永杰 張東雷 徐凱

摘要 為區(qū)分常用香菇品種L808和申香215，以香菇武香一號為對照，對3個品種進(jìn)行了拮抗試驗、ISSR分析和農(nóng)藝性狀比較，結(jié)果表明：武香一號與L808和申香215拮抗反應(yīng)明顯，L808與申香215品種間無明顯拮抗反應(yīng)；在農(nóng)藝性狀比較方面，同一栽培條件下，品種L808和申香215在形狀、顏色性狀上無明顯區(qū)別，但是在菌絲體長速、生長發(fā)育各個階段時間節(jié)點(diǎn)、子實體大小、單菇重、生物學(xué)效率等性狀上存在明顯差異；在ISSR分子標(biāo)記中申香215和L808存在特異性條帶，能夠有效區(qū)分2個品種。

關(guān)鍵詞 香菇；品種比較；拮抗反應(yīng)；分子標(biāo)記

中圖分類號 S646 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2024）02-0040-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.02.009

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Analysis of Antagonistic Reaction， ISSR Marker and Agronomic Traits of Different Lentinus edodes Varieties

ZHANG Yu-duo， GUO Yong-jie， ZHANG Dong-lei et al

（Fangshan District Extension Station of Planting Technology， Beijing 102446）

Abstract In order to distinguish the commonly used Lentinus edodes varieties L808 and Shenxiang 215 in Fangshan， Beijing area， the strain Wuxiang 1 was used as check cultivars， the antagonism test， ISSR analysis ， and agronomic traits comparison of the 3 varieties were carried out. The results showed that the antagonism reaction was obviously existed between the strain Wuxiang 1 and L808，similarly existed between Wuxiang 1 and Shenxiang 215， but there was no antagonism reaction between the strain L808 and Shenxiang 215. In agronomic traits comparison experiments， under the same cultivation conditions， there was no significant difference in fruit body shape and color traits between L808 and Shenxiang 215， but there were significant differences in agronomic traits such as mycelium growth speed， growth time in each development stage， fruit body size， single fruit body weight， biological efficiency etc. There were specific amplification bands in strain L808 and Shenxiang 215 by ISSR molecular marker analysis， which could effectively distinguish them.

Key words Lentinus edodes;Variety comparison;Antagonistic reaction;Molecular marker

作者簡介 張玉鐸（1982—），男，河北威縣人，高級農(nóng)藝師，碩士，從事食用菌栽培技術(shù)研究推廣和遺傳育種工作。

收稿日期 2023-01-29

香菇（Lentinus edodes（Berk.）Sing.）是我國栽培歷史最長、栽培規(guī)模最大的食用菌之一，由于其肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，風(fēng)味獨(dú)特，而且含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、香菇多糖、礦物質(zhì)元素及多種維生素等，深受消費(fèi)者歡迎。香菇是房山區(qū)第二大設(shè)施食用菌栽培種類，也是林下食用菌主栽種類，在帶動農(nóng)村勞動就業(yè)、發(fā)展林下經(jīng)濟(jì)及保證市場供應(yīng)中具有舉足輕重的作用。

香菇L808是麗水市大山菇業(yè)研究開發(fā)有限公司選育品種，申香215是上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育品種，近幾年作為北京房山區(qū)秋冬季日光溫室栽培和高海拔山區(qū)夏秋季林下拱棚栽培的常用品種，其菇型好，質(zhì)地優(yōu)，產(chǎn)量高，但是這2個品種在子實體顏色、形態(tài)特征上比較相似，容易混淆。付顯鋒從菌絲長速和子實體農(nóng)藝性狀方面對2個品種進(jìn)行了對比試驗，申香215單朵鮮菇重量和菌蓋更大，菌蓋更厚，菌柄更粗短。但是，在食用菌種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中，子實體表型標(biāo)記，易受到環(huán)境等客觀因素及檢測者的主觀因素影響。DNA分子標(biāo)記則不受外界環(huán)境和生長階段限制，對品種的識別明顯高于形態(tài)學(xué)和生理生化指標(biāo)，且操作簡便，特異性好，準(zhǔn)確性高。目前對這2個品種分子標(biāo)記研究鮮見報道。ISSR是由加拿大蒙特利爾大學(xué)Zietkiewicz等于1994年創(chuàng)建的一種分子標(biāo)記技術(shù)，具有很好的穩(wěn)定性、多態(tài)性和重復(fù)性，且有操作簡便、安全，成本低等特點(diǎn)。ISSR標(biāo)記技術(shù)在食用菌品種鑒定和遺傳多樣性分析方面得到廣泛的應(yīng)用。筆者以武香一號為對照，通過拮抗試驗、農(nóng)藝性狀比較和ISSR分析，對這2個品種做了系統(tǒng)鑒別，明確了兩者的特征與區(qū)別，也為栽培管理過程中如轉(zhuǎn)色、催菇等時間節(jié)點(diǎn)的掌控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株。L808來源于江蘇省高郵市食用菌研究所，申香215來源于上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院，武香一號來源于北京市農(nóng)林科學(xué)院。

1.1.2 儀器、試劑及其來源。

PCR儀（Eppendorf Mastercycler Gradient）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）、紫外可見分光光度計（LabtechUV9100）、電泳儀（北京六一DYY-Ⅲ-12B）、電子分析天平（奧豪斯）、臺式高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf 5415R）、移液器（Eppendorf）等。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉（BD difco）、蛋白胨（OXIOD）、磷酸二氫鉀、硫酸鎂等化學(xué)試劑均為分析純試劑，購自國藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑公司；DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN，德國）。2×Taq PCR MasterMix購自北京艾德萊生物科技有限公司；瓊脂糖購自西班牙Biowest公司；所有引物由上海生工生物公司（Sangon）合成。

硬雜木屑購自承德；輕質(zhì)碳酸鈣生產(chǎn)廠家為靈壽縣江晨礦產(chǎn)品加工廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗試驗。

將3個品種母種轉(zhuǎn)接到同一個PDA平皿上，接種塊大小3 mm×3 mm×3 mm，呈三角形接種，接種塊間距3 cm，3次重復(fù)，置于25 ℃條件下培養(yǎng)，觀察其生長和拮抗情況。

1.2.2 栽培試驗。

試驗設(shè)計：試驗品種L808和申香215，對照武香一號，單因素隨機(jī)區(qū)組試驗，3次重復(fù)，每處理300棒。

栽培料配方：硬雜木屑82%，麥麩16%，輕質(zhì)碳酸鈣2%，含水量52%。

栽培方法：日光溫室熟料栽培，采用15.000 cm×55.000 cm×0.005 cm聚乙烯折角塑料袋，每袋濕料重2.0 kg，折合干料重0.96 kg，常壓滅菌方式進(jìn)行滅菌，日光溫室內(nèi)搭建接種帳進(jìn)行無菌操作接種，就地培養(yǎng)，接種7 d后，去掉外套袋，倒垛并進(jìn)行井字形擺放。整個發(fā)菌期間設(shè)施內(nèi)溫度在20～26 ℃，菌絲生理成熟后打孔通氧一次，轉(zhuǎn)色完成脫袋出菇，靠背人字形擺放，按照常規(guī)出菇管理方式進(jìn)行出菇管理，共注水3次，整個出菇期設(shè)施內(nèi)溫度在6～25 ℃。

1.2.3 數(shù)據(jù)測定與記錄。每個品種每個處理隨機(jī)選取 50 個栽培袋測定以下指標(biāo)。

菌絲長速測定：接種10 d后，在接種口菌絲生長末端劃線做記號，10 d后再次在菌絲生長末端劃線做記號，測量2條線之間的長度，計算菌絲日均生長速率。

菌絲滿袋時間：當(dāng)所有接種塊連接，菌絲布整個菌袋時，記錄時間，計算從接種到滿袋的時間。

起瘤時間：當(dāng)90%接種口周圍開始起瘤，記錄時間，計算從接種到起瘤的時間。

生理成熟時間：60%菌棒開始出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)或斑塊，記錄時間，計算從接種到生理成熟時間。

轉(zhuǎn)色完成時間：當(dāng)全部菌棒表面由白色轉(zhuǎn)為紅褐色，形成一層紅褐色有韌性的菌膜時，轉(zhuǎn)色結(jié)束，記錄時間，計算從接種到轉(zhuǎn)色結(jié)束的時間。

原基形成時間：當(dāng)90%菌棒表面出現(xiàn)原基時，記錄時間，計算從接種到原基形成的時間。

子實體形態(tài)特性測定：第1潮菇第1次采收，每處理隨機(jī)抽取50個子實體，觀察記錄形態(tài)、顏色，測量菌蓋直徑、菌蓋厚度、菌柄長度、菌柄粗度。

單菇重統(tǒng)計：統(tǒng)計前二潮菇單菇重，每個處理隨機(jī)抽取50個子實體稱重，計算單菇重。

生物學(xué)效率：測定每個處理四潮菇總產(chǎn)量。

生物學(xué)效率=鮮菇產(chǎn)量/原料干重=每個處理總產(chǎn)量（kg）/（300棒×0.96 kg）×100%

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析：對試驗所得數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件LSD法進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.4 ISSR分子標(biāo)記。

1.2.4.1 菌絲生長供試培養(yǎng)基。

綜合PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g，瓊脂20.0 g，葡萄糖20.0 g，蛋白胨5.0 g，KHPO 3.0 g，MgSO 1.5 g，V10 mg，水1 L。

1.2.4.2 DNA提取。

分別刮取平皿上的申香215、武香一號、L808菌絲100 μg左右于1.5 mL的離心管中，加入2種大小的氧化鋯珠子各1～2勺，加400 μL AP1，放在破碎儀內(nèi)5 min，破碎后使用DNeasy Plant Mini Kit提取試劑盒提取樣品DNA。

1.2.4.3 引物。

所用引物由上海生工（Sangon）合成，具體引物編號對應(yīng)的序列見表1。

1.2.4.4 ISSR擴(kuò)增。

采用25 μL擴(kuò)增體系：1.0 μL模板（含25～50 ng DNA），2.5 μL 10×buffer緩沖液，0.6 μL dNTP（10 mmol/L），1.0 μL Primer（10 μmol/L），0.3 μL Taq DNA Polymerase（5 U/μL），ddHO補(bǔ)至25 μL。

ISSR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；循環(huán)參數(shù)為94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，運(yùn)行35個循環(huán)后，72 ℃終延伸10 min。SRAP程序：94 ℃預(yù)變性5 min；第1個循環(huán)參數(shù)為94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，運(yùn)行5個循環(huán)；第2次循環(huán)參數(shù)為94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃終延伸1.5 min，運(yùn)行35個循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。

1.2.4.5 瓊脂糖凝膠電泳。

取10 μL反應(yīng)產(chǎn)物，加入含有2% SYBR Safe DNA gel staid（invitrogen）的瓊脂糖凝膠中，在120 U電壓下進(jìn)行電泳40 min，并置于紫外凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照記錄。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計。以上試驗每個引物3次重復(fù)，以保證數(shù)據(jù)采集和分析的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗試驗

3個品種拮抗試驗結(jié)果見圖1、2，平板正反面可見武香一號與L808和申香215均產(chǎn)生了明顯的溝型拮抗線，拮抗反應(yīng)明顯。L808和申香215平板正反面未出現(xiàn)明顯的隆起型、溝型或者隔離型拮抗反應(yīng)形態(tài)類型和色素帶，拮抗反應(yīng)不明顯，需要從農(nóng)藝性狀和分子水平上進(jìn)一步進(jìn)行比較鑒定。

2.2 農(nóng)藝性狀比較

2.2.1 栽培袋菌絲體階段菌絲長速和各階段時間節(jié)點(diǎn)。

3個品種菌絲體階段長速和各階段時間節(jié)點(diǎn)見表2，在菌絲長速方面，3個品種表現(xiàn)出顯著差異，對照品種武香一號介于L808和申香215之間，長速最快的品種是L808，平均2.18 mm/d，最慢的品種是申香215，均值為1.91 mm/d。在菌絲滿袋時間上3個品種與菌絲長速表現(xiàn)一致。在表面起瘤、生理成熟、轉(zhuǎn)色完成、原基形成等每個節(jié)點(diǎn)時間上，武香一號都表現(xiàn)出了早熟特性，每個節(jié)點(diǎn)用時都快于L808和申香215。品種L808和申香215相比，每個節(jié)點(diǎn)L808都比申香215所需時間短。從該試驗看，品種L808從播種到原基形成的時間為101 d，申香215為113 d，兩者差異最大的階段是轉(zhuǎn)色完成所需時間，品種L808從生理成熟到轉(zhuǎn)色完成所需時間為33 d，申香215所需時間為41 d，相差8 d，其次是菌絲滿袋時間，品種L808比申香215提前5 d，其他階段差異不大。

2.2.2 子實體形態(tài)特性。

3個品種子實體形態(tài)特性見表3，對照品種武香一號在形態(tài)上與L808和申香215表現(xiàn)出明顯區(qū)別，形狀不同，顏色不同，子實體偏小，肉薄，柄細(xì)長。品種L808和申香215在形狀和菌蓋顏色方面差異不大，難以進(jìn)行區(qū)分，但是在個體大小上兩者差異比較明顯，品種申香215在菌蓋直徑、菌蓋厚度、菌柄長度、菌柄直徑方面平均數(shù)值均大于品種L808，尤其是菌蓋直徑，申香215比L808大17.89%。

2.2.3 產(chǎn)量性狀比較。

3個品種產(chǎn)量性狀見表4，從子實體單重上比較，3個品種間差異明顯，并且3個品種一潮菇和二潮菇單菇重順序一致，均表現(xiàn)為申香215＞L808＞武香一號。對照品種武香一號一潮菇和二潮菇單菇重均值分別為21.34和17.42 g，顯著輕于L808和申香215。申香215一潮菇和二潮菇單菇重均值分別為68.87和43.57 g，一潮菇平均單菇重比L808重77.36%，二潮菇平均單菇重比L808重47.40%，二者間差異顯著。在生物學(xué)效率上，表現(xiàn)為L808＞申香215＞武香一號，分別為98.65%、91.96%和76.14%，品種L808和申香215間生物學(xué)效率差異顯著，且均顯著高于對照品種武香一號。

2.3 ISSR分子標(biāo)記分析

以武香一號為對照，從DNA水平上分析品種L808和申香215的種質(zhì)遺傳差異性，分別提取了武香一號、申香215和L808基因組DNA，利用20個UBC-ISSR引物對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，對照品種武香一號在20個引物PCR擴(kuò)增圖譜中，與L808和申香215均存在特異性條帶。經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)，品種L808和申香215有4個引物（圖3～6），且擴(kuò)增圖譜呈現(xiàn)明顯的多態(tài)性，存在特異性條帶，說明這2個品種在DNA水平上存在差異。

3 結(jié)論與討論

拮抗反應(yīng)可作為食用菌種內(nèi)鑒別菌株異同的重要標(biāo)志，被廣泛應(yīng)用于品種比較或者鑒別試驗中，但是拮抗反應(yīng)有無的判斷需要更多的觀察經(jīng)驗，存在一定的主觀因素。在進(jìn)行品種區(qū)別鑒定時，菌株之間無拮抗反應(yīng)或拮抗反應(yīng)極不明顯，并不能確定是同一菌株。該試驗中，品種L808和申香215未產(chǎn)生明顯的拮抗反應(yīng)，難以對這2個品種進(jìn)行有效區(qū)分。因此，筆者利用農(nóng)藝性狀比較和ISSR分析進(jìn)行了進(jìn)一步鑒別。

在農(nóng)藝性狀比較中，在同一栽培條件下，栽培袋菌絲長速上，品種L808顯著快于申香215，品種L808和申香215在子實體形狀、顏色性狀上無明顯區(qū)別，但是在子實體大小、單菇重、生物學(xué)效率等數(shù)量性狀上都產(chǎn)生了明顯差異，其中在子實體大小和單菇重方面與付顯鋒的研究結(jié)果一致。申香215都表現(xiàn)出了個體大的特征，這2個性狀在一定程度上能夠區(qū)分2個品種，并能夠為從業(yè)人員在品種選擇時提供參考。

品種L808和申香215菌絲體生長發(fā)育各個階段時間節(jié)點(diǎn)比較表明，品種L808播種至原基形成所用的時間比申香215短12 d，其中，從生理成熟到轉(zhuǎn)色完成，L808所需時間比申香215少8 d，差異明顯，這不僅能夠科學(xué)區(qū)分2個品種，而且可以為香菇精準(zhǔn)化管理提供科學(xué)依據(jù)。在栽培中可以根據(jù)2個品種的轉(zhuǎn)色完成時間特點(diǎn)進(jìn)行差異化管理，科學(xué)準(zhǔn)時地進(jìn)入出菇階段，有效避免轉(zhuǎn)色不完全或者過度轉(zhuǎn)色情況發(fā)生，對提高產(chǎn)量和品質(zhì)提供保障，因為菌棒轉(zhuǎn)色的好壞直接影響香菇生產(chǎn)的質(zhì)量和產(chǎn)量。

在ISSR分子標(biāo)記試驗中，有4個引物的擴(kuò)增圖譜有明顯的多態(tài)性，L808和申香215品種間存在特異性條帶，表明2個品種現(xiàn)在DNA水平上存在差異，ISSR分子標(biāo)記能夠?qū)@2個品種進(jìn)行有效區(qū)分。申香215是通過L808優(yōu)良子實體經(jīng)組織分離系統(tǒng)篩選得到的一個出菇穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的優(yōu)異菌株。在選擇育種工作中，最有效和最常用的方法之一是子實體組織分離法，該方法所獲得的純培養(yǎng)遺傳性狀穩(wěn)定、變異小，為了明確原始品種和選育品種的差異，可以結(jié)合生理生化特征和農(nóng)藝形狀特征，進(jìn)一步在DNA水平上進(jìn)行鑒別。據(jù)秦蓮花等研究報道，Qingke20和939均是從菌株9015中選育出的，L241-4 是從 L241中選育出的，經(jīng)ITS、ISSR、RAPD、SRAP等方法進(jìn)行分析，結(jié)果表明，原始品種與分離獲得的品種的親緣關(guān)系都比較近，同一原始菌株獲得的不同后代（Qingke20和939）親緣關(guān)系也比較近，但是也都存在特異性條帶，能夠進(jìn)行有效區(qū)分。筆者結(jié)合農(nóng)藝性狀、拮抗試驗，采用分子標(biāo)記也獲得了類似的結(jié)論，為品種選擇、栽培管理中諸如轉(zhuǎn)色、催菇等時間節(jié)點(diǎn)的掌控提供了科學(xué)依據(jù)。

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