豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白納米抗體的篩選及其對(duì)病毒復(fù)制的抑制效應(yīng)

宋雯妍,張瀚文,吳澳迪,張麗燕,劉 照,葉桐桐,陳創(chuàng)夫,盛金良

(石河子大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院,石河子 832000)

豬繁殖與呼吸綜合征又稱豬藍(lán)耳病,是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)感染而導(dǎo)致妊娠母豬在懷孕晚期出現(xiàn)流產(chǎn),育肥豬食欲不振,體重減輕,以及各日齡豬呼吸系統(tǒng)紊亂的疾病[1-4]。PRRSV是單股正鏈RNA病毒,屬于動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬,其結(jié)構(gòu)為二十面體,具立體對(duì)稱性,病毒衣殼內(nèi)含有不分節(jié)段的基因組 RNA,全長(zhǎng)大小約為 15 kb,編碼至少8 種結(jié)構(gòu)蛋白與14 種非結(jié)構(gòu)蛋白[5-6]。GP5 蛋白又稱E蛋白,是由病毒 ORF5 開放閱讀框編碼的主要糖基化結(jié)構(gòu)的跨膜蛋白,其特點(diǎn)是具有較好的免疫原性,并能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,且該蛋白在體內(nèi)及體外試驗(yàn)中,均能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[7-8]。此外GP5蛋白與 M 蛋白可形成 GP5/M 異源二聚體,于病毒的裝配起到重要作用,并介導(dǎo)PRRSV對(duì)靶細(xì)胞的吸附過程[9-10]。鑒于GP5蛋白于病毒的生命周期中發(fā)揮著重要生物學(xué)功能,因此該蛋白是研發(fā)抗豬藍(lán)耳病藥物的理想靶標(biāo)蛋白。

納米抗體(Nb)是研究人員基于駱駝等駝科動(dòng)物以及鯊魚等軟骨魚體內(nèi)的重鏈抗體可變區(qū)片段上所研發(fā)的一種單域抗體,其僅由重鏈可變區(qū)構(gòu)成,長(zhǎng)4 nm,直徑2.5 nm,呈橢圓形,其大小僅是傳統(tǒng)抗體的1/10,是目前所知最小且具備活性的抗原結(jié)合蛋白[11-12]。納米抗體因具備體積小、親和力高、穩(wěn)定性與組織穿透性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì),近年來(lái)其于病毒感染治療領(lǐng)域的相關(guān)研究不斷深入。目前已有針對(duì)SARS-冠狀病毒-2、艾滋病病毒、甲型流感病毒等多種病毒的納米抗體報(bào)道,研究結(jié)果顯示,這些納米抗體對(duì)病毒復(fù)制的抑制效應(yīng)較好,可作為治療病毒感染的理想工具。

本研究基于研發(fā)PRRSV GP5蛋白納米抗體,并探究其在細(xì)胞內(nèi)對(duì)病毒復(fù)制的抑制效力,目前針對(duì)此蛋白納米抗體的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。因此,將GP5蛋白經(jīng)原核表達(dá)并純化后免疫羊駝,利用噬菌體展示技術(shù)最終篩選出PRRSV-GP5蛋白的高特異性納米抗體,并將其轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)以驗(yàn)證該納米抗體對(duì)PRRSV復(fù)制與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的影響,為抗PRRSV新型藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、表達(dá)載體、試驗(yàn)動(dòng)物 大腸桿菌 DH5α、BL21(DE3)、TG1及pET-32a載體、pCANTAB-5E、pcDNA3.1(-)載體均由石河子大學(xué)獸醫(yī)病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存;健康成年母羊駝1只,飼養(yǎng)于石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院。

1.1.2 細(xì)胞與毒株 Marc-145細(xì)胞與PRRSV毒株均由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院人獸共患病實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR反應(yīng)試劑、 DNA Marker、 Protein Marker、 Ni-NTA Resin、 Anti-His Mouse Monoclonal Antibody、 Goat Anti-Mouse IgG (H+L), HRP Conjugate均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;T-Vector pMD19(Simple)、 DNA Ligation Kit Ver.2.1、 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、PstⅠ、NotⅠ均購(gòu)自于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;Anti-M13 Antibody (HRP)購(gòu)自北京義翹神州科技股份有限公司;E-tag Antibody(HRP)購(gòu)自金斯瑞生物科技股份有限公司;無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;Lipofectamine3000購(gòu)自美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司;Goat Anti-Llama IgG H&L(HRP)為進(jìn)口試劑。

1.2 方法

1.2.1 PRRSVORF5基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)GenBank中PRRSV XJzx1-2015分離株的GP5序列(AQV08435.1)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,去除該基因中的信號(hào)肽及跨膜區(qū)序列,并針對(duì)優(yōu)化后的截短序列設(shè)計(jì)引物(表1),以實(shí)驗(yàn)室保存的PRRSV陽(yáng)性病料為模板,使用PCR技術(shù)擴(kuò)增ORF5基因,并通過限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ將ORF5基因克隆至原核表達(dá)載體pET-32a中,得到重組質(zhì)粒pET-32a-GP5,后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。

表1 構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-GP5的引物序列Table 1 Primer sequence for constructing recombinant plasmid pET-32a-GP5

1.2.2 PRRSV GP5蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 將經(jīng)雙酶切及測(cè)序正確的重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DE3(BL21)感受態(tài)細(xì)胞中,挑單克隆入含有氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng),37 ℃,200 r·min-1培養(yǎng)至菌液OD600 nm值達(dá)到0.6時(shí)停止,取1 mL菌液作為誘導(dǎo)前對(duì)照,后于剩余菌液中加入1 mmol·L-1的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),37 ℃,200 r·min-1培養(yǎng)6 h,同時(shí)設(shè)置空載體對(duì)照,SDS-PAGE鑒定重組蛋白的表達(dá)。取誘導(dǎo)后菌液進(jìn)行超聲破碎(功率50 w,超聲5 s,間隔6 s,90 次·周期-1),收集上清與沉淀進(jìn)行可溶性分析并使用鎳柱親和層析法對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化,后Western blot鑒定。

1.2.3 動(dòng)物免疫 首次免疫前,對(duì)羊駝進(jìn)行采血以作陰性對(duì)照,后將純化好的1 mL GP5重組蛋白與等量弗氏完全佐劑混合乳化,于羊駝背部體表進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射。此后每隔14 d使用0.5 mL重組蛋白與等量弗氏不完全佐劑乳化對(duì)羊駝進(jìn)行加強(qiáng)免疫,直至三免結(jié)束,分別于免疫第0、14、28、42 天時(shí)采血,使用間接ELISA方法檢測(cè)羊駝體內(nèi)抗體效價(jià),隨后采集羊駝全血,分離淋巴細(xì)胞以備后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 VHH基因的擴(kuò)增 提取淋巴細(xì)胞RNA,反轉(zhuǎn)錄后參考文獻(xiàn)[13]中的引物序列(表2)進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增出VHH片段。首先使用引物CALL001、CALL002進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件:98 ℃預(yù)變性30 s;98 ℃變性10 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸25 s,共28 個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸 5 min,PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,并對(duì)位于700 bp的條帶進(jìn)行膠回收以用于第二輪PCR的模板,使用引物VHH-F及VHH-R進(jìn)行VHH片段的擴(kuò)增。反應(yīng)條件:98 ℃預(yù)變性 30 s;98 ℃變性10 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸15 s,共18個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸 5 min,PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,對(duì)位于400 bp的目標(biāo)條帶進(jìn)行膠回收并于-20 ℃保存。

表2 擴(kuò)增VHH片段所需引物Table 2 Primers required for VHH fragment amplification

1.2.5 VHH噬菌體展示文庫(kù)的構(gòu)建及鑒定 將VHH片段與pCANTAB 5E載體分別用限制性內(nèi)切酶PstⅠ和NotⅠ于37 ℃雙酶切1 h后使用T4連接酶于16 ℃連接16 h。取10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入100 μL大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞中,次日用細(xì)胞刮刀收集培養(yǎng)皿中的所有菌落并充分混勻,即可得到VHH噬菌體展示文庫(kù)。使用2×YT液體培養(yǎng)基進(jìn)行10倍梯度稀釋,加入等體積處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TG1溶液,混勻,37 ℃靜置感染30 min,涂布于LB/AMP固體培養(yǎng)基中進(jìn)行過夜培養(yǎng),統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化子的數(shù)量以計(jì)算庫(kù)容。隨機(jī)挑取培養(yǎng)皿中的陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定并計(jì)算文庫(kù)插入率。

1.2.6 VHH噬菌體展示文庫(kù)的救援 取1 mL上一步制備的VHH噬菌體展示文庫(kù)溶于100 mL 2×YT/AMP液體培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r·min-1培養(yǎng)至菌液OD600 nm值達(dá)到0.6時(shí)停止,加入200 μL M13K07輔助噬菌體(6.14×1012PFU·mL-1)進(jìn)行救援,混勻,37 ℃靜置30 min后于37 ℃,200 r·min-1,振蕩培養(yǎng)40 min。離心后棄上清,菌體沉淀用500 mL 2×YT/AMP 液體培養(yǎng)基重懸,37 ℃,200 r·min-1,振蕩培養(yǎng)14 h。14 000 r·min-1,離心后收集上清,加入1/5體積提前預(yù)冷的PEG/NaCl溶液,混勻后于冰上靜置6 h。離心后收集沉淀,用1 mL的無(wú)菌PBS(1×)重懸沉淀后于4 ℃搖床過夜孵育,完全溶解噬菌體顆粒。

1.2.7 PRRSV-GP5特異性納米抗體的淘選 取純化后GP5蛋白用碳酸鹽包被液稀釋至10 μg·mL-1,每孔100 μL加入至96孔酶標(biāo)板中,同時(shí)設(shè)置PBS(1×)作為陰性對(duì)照,4 ℃包被過夜。棄去包被液,5%脫脂乳于37 ℃封閉2 h,PBST洗板。加入稀釋至6.1×1010的重組噬菌體(“1.2.6”方法),100 μL·孔-1,37 ℃孵育2 h,洗板后加入新鮮配制的0.1 mol·L-1三乙胺溶液,100 μL·孔-1,37 ℃靜置10 min后吸出洗脫液,并迅速加入等體積的1 mol·L-1Tris-HCl(pH=7.4)進(jìn)行中和,對(duì)洗脫液中的重組噬菌體滴度進(jìn)行測(cè)定,并計(jì)算回收率。取4 mL 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TG1溶液,加入400 μL洗脫的重組噬菌體溶液,混勻后于37 ℃靜置30 min,加入16 mL的2×YT/AMP 液體培養(yǎng)基,37 ℃,200 r·min-1培養(yǎng)至菌液OD600 nm值達(dá)到0.6時(shí)停止,加入100 μL M13K07輔助噬菌體救援,按照“1.2.6”的方法對(duì)噬菌體粒子進(jìn)行濃縮純化,重復(fù)上述操作三次,完成對(duì)重組噬菌體的三輪淘選。

1.2.8 重組納米抗體的誘導(dǎo)表達(dá)與粗提物獲取 取重組噬菌體第三輪淘選的洗脫液,測(cè)定滴度后從LB-AMP固體培養(yǎng)基中隨機(jī)挑取96個(gè)單克隆,過夜培養(yǎng)。次日各菌液取10 μL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至1 mL TB培養(yǎng)基,37 ℃,200 r·min-1培養(yǎng)至菌液OD600 nm值達(dá)到0.6時(shí)加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)12 h。離心后吸棄上清液,菌體反復(fù)凍融三次后使用無(wú)菌PBS(1×)重懸,離心后收集上清即獲得可溶性納米抗體粗提物。

1.2.9 重組納米抗體的間接ELISA檢測(cè) 將純化后的GP5蛋白稀釋至10 μg·mL-1,100 μL·孔-1加入至96孔酶標(biāo)板中,共包被同時(shí)設(shè)置PBS(1×)作為陰性對(duì)照,4 ℃包被過夜。次日棄包被液,用5%脫脂乳于室溫封閉2 h,PBST洗板。將可溶性納米抗體粗提物用5%脫脂乳1∶1稀釋后,每孔加入100 μL,37 ℃孵育1 h。PBST洗板,分別加入Anti-M13抗體和Anti-E-tag抗體以作二抗,100 μL·孔-1,37 ℃孵育1 h后進(jìn)行顯色,加入ELISA終止液終止反應(yīng)后于酶標(biāo)儀測(cè)取OD450 nm并分析數(shù)據(jù)。

1.2.10 PRRSV-GP5 特異性納米抗體序列分析 將與Anti-M13抗體和Anti-E-tag抗體反應(yīng)均為陽(yáng)性的單克隆擴(kuò)大培養(yǎng),進(jìn)行菌液PCR鑒定后陽(yáng)性者送去測(cè)序,用DNAMAN軟件比對(duì)測(cè)序結(jié)果,并根據(jù)納米抗體的高變區(qū)序列歸類。

1.2.11 PRRSV-GP5 特異性納米抗體對(duì)PRRSV增殖的影響 以所篩PRRSV-GP5特異性納米抗體所對(duì)應(yīng)的菌液為模板,使用表3所示的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并通過限制性內(nèi)切酶SacⅠ和Hind Ⅲ將擴(kuò)增出的納米抗體基因克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)中,得到重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Nb1與pcDNA3.1(-)-Nb2,后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。次日,隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化成功的單克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證及雙酶切鑒定,二者均正確者送去測(cè)序。

將含有構(gòu)建成功質(zhì)粒的菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并使用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取,后使用Lipofectamine3000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Marc-145細(xì)胞中,經(jīng)Western blot及熒光定量PCR(引物見表4)檢測(cè)Nb mRNA的相對(duì)表達(dá)量來(lái)鑒定重組質(zhì)粒于細(xì)胞中的表達(dá)情況。

將pcDNA3.1(-)-Nb1、pcDNA3.1(-)-Nb2分別轉(zhuǎn)染至Marc-145細(xì)胞中,取1 MOI PRRSV 接種各組細(xì)胞,同時(shí)設(shè)置空細(xì)胞接毒組作為陰性對(duì)照,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中共孵育1 h(期間每30 min輕柔晃動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板),棄去毒液,1×PBS洗兩遍,于各組0 h細(xì)胞樣品中加入TRIZOL裂解后置于-80 ℃保存?zhèn)溆?剩余各組加入含3% FBS的DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),后分別于24、36、48、60、72 h收集各組細(xì)胞樣本,進(jìn)行RNA提取后反轉(zhuǎn)錄,并使用表4所示的引物檢測(cè)PRRSVORF7基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化以判定各組納米抗體在不同時(shí)間段對(duì)病毒復(fù)制所產(chǎn)生的影響。

表3 構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Nbs的引物序列Table 3 Primer sequence for constructing recombinant plasmid pcDNA3.1(-)-Nbs

表4 熒光定量PCR引物序列Table 4 Fluorescence quantitative PCR primer sequences

2 結(jié) 果

2.1 pET-32a-GP5重組質(zhì)粒的構(gòu)建

取實(shí)驗(yàn)室保存的PRRSV陽(yáng)性病料,該病料據(jù)文獻(xiàn) [14]記載,內(nèi)含毒株為野毒株,且通過對(duì)其進(jìn)行遺傳變異分析可知,該毒株與香港PRRSV毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系較為接近,推測(cè)其與經(jīng)典毒株相比,毒性有所增強(qiáng),另外,將該毒株的ORF5基因序列與19株P(guān)RRSV美洲型毒株進(jìn)行序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)該基因針對(duì)不同毒株的廣譜性較好。因此,本試驗(yàn)使用PCR技術(shù)對(duì)PRRSVORF5基因進(jìn)行擴(kuò)增,得到一條片段大小為216 bp的目的條帶(圖1A),與預(yù)期目的基因片段大小一致。回收目的條帶后與原核表達(dá)載體pET-32a分別通過限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后進(jìn)行連接,構(gòu)建出重組質(zhì)粒pET-32a-GP5,隨后進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證(圖1B)與雙酶切鑒定(圖1C),并送去測(cè)序。結(jié)果表明,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-GP5。

A. PRRSV ORF5基因的PCR擴(kuò)增;B. 重組質(zhì)粒pET-32a-GP5的PCR鑒定;C. 重組質(zhì)粒pET-32a-GP5的雙酶切鑒定;M1. DL700 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. 陰性對(duì)照;2. ORF5基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;M2. DL700 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);3～8. 菌液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;M3. DL5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);9～11. pET-32a-GP5重組質(zhì)粒 A. PCR amplificaiton of PRRSV ORF5 gene; B. Identification of pET-32a-GP5 by PCR; C. Identification of pET-32a-GP5 by double enzyme digestion; M1. DNA marker DL700; 1. Negative control; 2. PCR amplification product of ORF5 gene; M2. DNA marker DL700; 3-8. PCR amplification products of bacterial fluid; M3. DNA marker DL5000; 9-11. Recombinant pET-32a-GP5圖1 pET-32a-GP5重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Construction of pET-32a-GP5 recombinant plasmid

2.2 PRRSV GP5蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

對(duì)含有pET-32a-GP5的重組質(zhì)粒的菌液于1 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h后,將空載體對(duì)照、誘導(dǎo)前對(duì)照以及誘導(dǎo)后的重組蛋白均進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,結(jié)果顯示空載體及誘導(dǎo)前對(duì)照無(wú)重組蛋白表達(dá),誘導(dǎo)后重組蛋白于28 ku處有明顯的蛋白條帶產(chǎn)生(圖2A),與預(yù)期大小一致。經(jīng)可溶性分析,重組蛋白于包涵體沉淀中表達(dá)(圖2B),使用鎳柱親和層析法過柱純化GP5重組蛋白,最終收集到純度較好的2.16 mg·mL-1的純化后蛋白(圖2C)。

2.3 羊駝免疫

采用間接ELISA法對(duì)GP5蛋白免疫羊駝血清抗體進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示三免14 d后,羊駝體內(nèi)IgG抗體效價(jià)高達(dá)1∶819 200,對(duì)比陰性血清對(duì)照組,抗體水平顯著增加(圖3)。

2.4 VHH基因片段的擴(kuò)增

提取羊駝全血淋巴細(xì)胞RNA,反轉(zhuǎn)錄后首先使用引物CALL001、CALL002進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增,分別得到一條片段大小為900 bp的條帶與另一條大小為700 bp的目的條帶(圖4A),膠回收位于700 bp的條帶以用于第二輪PCR的模板,使用引物VHH-F及VHH-R對(duì)VHH片段進(jìn)行擴(kuò)增,最終位于400 bp處出現(xiàn)目的條帶(圖4B)。

2.5 VHH噬菌體展示文庫(kù)的構(gòu)建及鑒定

將VHH片段克隆至pCANTAB 5E載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞中,得到庫(kù)容量為2.93×107CFU·mL-1的VHH噬菌體展示文庫(kù),插入率為98%。

A.重組蛋白的SDS-PAGE鑒定;B. 重組蛋白的可溶性分析;C. 重組蛋白的Western blot鑒定;M1. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. pET-32a空載體; 2. pET-32a-GP5誘導(dǎo)前;3. pET-32a-GP5誘導(dǎo)后;M2. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);4. pET-32a空載體; 5. pET-32a-GP5誘導(dǎo)前; 6. pET-32a-GP5誘導(dǎo)后;7. 超聲后上清;8. 超聲后沉淀;M3. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);9. pET-32a-GP5純化 A. SDS-PAGE identification of recombinant protein; B. Solubility analysis of recombinant protein; C. Western blot identification of recombinant protein; M1. Protein molecular weight standard;1. pET-32a empty plasmid control; 2. pET-32a-GP5 before induction; 3. pET-32a-GP5 after induction; M2. Protein molecular weight standard; 4. pET-32a empty plasmid control; 5. pET-32a-GP5 before induction; 6. pET-32a-GP5 after induction; 7. Supernatant after ultrasound; 8. Precipitation after ultrasound; M3. Protein molecular weight standard;9. Purification of pET-32a-GP5圖2 PRRSV GP5蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化Fig.2 Inducible expression and purification of PRRSV GP5 protein

圖3 羊駝血清中PRRSV GP5特異性抗體效價(jià)檢測(cè)Fig.3 Detection of PRRSV GP5 specific antibody titer in alpaca serum

2.6 PRRSV-GP5特異性納米抗體的淘選

將PRRSV-GP5蛋白作為包被抗原以篩出高親和力與特異性納米抗體。進(jìn)行“吸附-洗脫-富集”共三輪淘選,通過測(cè)定每輪篩選過程中重組噬菌體的投入量與洗脫液里重組噬菌體的洗脫量,來(lái)計(jì)算回收率以評(píng)估PRRSV-GP5蛋白篩選過程中特異性噬菌體的富集情況。結(jié)果如表5所示,經(jīng)三輪淘選后,重組噬菌體得到了有效富集,洗脫量與回收率均逐漸升高,其中,特異性噬菌體的洗脫量達(dá)2.48×108CFU·mL-1。

2.7 重組納米抗體的間接ELISA檢測(cè)

于重組噬菌體第三輪淘選滴度測(cè)定的固體培養(yǎng)基中隨機(jī)挑取96個(gè)單克隆,經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)與誘導(dǎo)表達(dá)后,制得可溶性納米抗體粗提物,用于間接ELISA檢測(cè)納米抗體與PRRSV-GP5蛋白的反應(yīng)原性。其中分別選取Anti-M13抗體和Anti-E-tag抗體作為不同的二抗進(jìn)行試驗(yàn)檢測(cè),將OD值大于陰性對(duì)照三倍以上即判定為陽(yáng)性,結(jié)果如圖5所示。

A. 巢式PCR第一輪擴(kuò)增;B. 巢式PCR第二輪擴(kuò)增;M1. DL1500 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1、2. 陰性對(duì)照;3、4. 巢式PCR第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物;M2. DL700 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);5. 陰性對(duì)照;6、7,巢式PCR第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物 A. The first amplification round of nested PCR; B, The second amplification round of nested PCR; M1. DNA marker DL1500; 1, 2. Negative control; 3-4. The first round amplification products of nested PCR; M2. DNA marker DL700; 5. Negative control; 6-7. The second round amplification products of nested PCR圖4 VHH基因片段的擴(kuò)增Fig.4 Amplification of VHH gene fragment

表5 GP5蛋白篩選過程中特異性噬菌體的富集情況Table 5 Enrichment of specific phages during GP5 protein screening

2.8 PRRSV-GP5 特異性納米抗體序列分析

將與Anti-M13抗體和Anti-E-tag抗體反應(yīng)均為陽(yáng)性的克隆擴(kuò)大培養(yǎng),進(jìn)行菌液PCR,陽(yáng)性者送去測(cè)序,測(cè)得序列經(jīng)分析后共得到2條與駝源的VHH具有較高同源性并與GP5蛋白具有良好反應(yīng)原性的序列,分別命名為Nb1、Nb2(圖6)。分析可知,兩株納米抗體的FR2區(qū)均存在典型的親水氨基酸。

2.9 重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Nbs的構(gòu)建

以所篩Nb1、Nb2所對(duì)應(yīng)的菌液為模板,使用引物VHH-ZH(F)、VHH-ZH(R)對(duì)納米抗體基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分別得到片段大小約為340 bp的目的條帶(圖7A),將擴(kuò)增出的納米抗體基因克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)中,分別構(gòu)建出重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Nb1與pcDNA3.1(-)-Nb2,隨后對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證(圖7B)與雙酶切驗(yàn)證(圖7C),并送去測(cè)序,結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Nbs構(gòu)建成功。

2.10 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Marc-145細(xì)胞

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒利用Lipofectamine3000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至Marc-145細(xì)胞中,36 h后,收集細(xì)胞,分別檢測(cè)細(xì)胞中Nb1與Nb2蛋白的表達(dá)情況。如圖8A所示,轉(zhuǎn)染后可于細(xì)胞中檢測(cè)到Nb1與Nb2蛋白的表達(dá)。使用熒光定量PCR檢測(cè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞前后Nb1與Nb2 mRNA表達(dá)量的變化,如圖8B與8C所示,兩株納米抗體的表達(dá)量于細(xì)胞轉(zhuǎn)染后均顯著增加,進(jìn)一步驗(yàn)證了重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Nbs轉(zhuǎn)染成功。

2.11 細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的Nb1與Nb2對(duì)PRRSV復(fù)制的影響

A. Anti-E-tag抗體(OD450 nm值為0～1.8;1～96. 試驗(yàn)組);B. Anti-M13抗體(OD450 nm值為0～0.35;1～96. 試驗(yàn)組) A. Anti-E-tag antibody (OD450 nm value is 0-1.8; 1-96. Test group); B. Anti-M13 antibody (OD450 nm value is 0-0.35; 1-96. Test group)圖5 重組納米抗體的間接ELISA檢測(cè)Fig.5 Indirect ELISA detection of recombinant nanobodies

圖6 Gp5特異性納米抗體氨基酸序列Fig.6 Amino acid sequence of Gp5 specific nanobody

A. Nb1與Nb2基因的PCR擴(kuò)增;B. 重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Nb1與pcDNA3.1(-)-Nb2的PCR鑒定;C. 重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Nb1與pcDNA3.1(-)-Nb2的雙酶切鑒定;M1. DL700 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. 陰性對(duì)照;2. Nb1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;3. Nb2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;M2. DL700 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);4. 陰性對(duì)照;5～8. 菌液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;M3. DL5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);9. pcDNA3.1(-)-Nb1重組質(zhì)粒;10. pcDNA3.1(-)-Nb2重組質(zhì)粒 A. PCR amplification of Nb1 and Nb2 gene; B. Identification of pcDNA3.1(-)-Nb1 and pcDNA3.1(-)-Nb2 by PCR; C. Identification of pcDNA3.1(-)-Nb1 and pcDNA3.1(-)-Nb2 by double enzyme digestion; M1. DNA marker DL700; 1. Negative control; 2. PCR amplification product of Nb1 gene; 3. PCR amplification product of Nb2 gene; M2. DNA marker DL700; 4. Negative control; 5-8. PCR amplification products of bacterial fluid; M3. DNA marker DL5000; 9. Recombinant pcDNA3.1(-)-Nb1; 10. Recombinant pcDNA3.1(-)-Nb2圖7 重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Nbs的構(gòu)建Fig.7 Construction of pcDNA3.1(-)-Nbs recombinant plasmid

A. 重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Nbs轉(zhuǎn)染至Marc-145細(xì)胞的Western blot鑒定;B. 重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Nb1轉(zhuǎn)染至Marc-145細(xì)胞的熒光定量PCR鑒定;C. 重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Nb2轉(zhuǎn)染至Marc-145細(xì)胞的熒光定量PCR鑒定。與空白對(duì)照組相比,****.P<0.000 1 A. Westernblot identification of recombinant plasmid pcDNA3.1 (-)-Nbs transfected into Marc-145 cells; B. Fluorescence quantitative PCR identification of recombinant plasmid pcDNA3.1 (-)-Nb1 transfected into Marc-145 cells; C. Fluorescence quantitative PCR identification of recombinant plasmid pcDNA3.1 (-)-Nb2 transfected into Marc-145 cells. Compared with the Control group, ****. P<0.000 1圖8 重組質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Nbs轉(zhuǎn)染至Marc-145細(xì)胞Fig.8 Recombinant plasmid pcDNA3.1 (-)-Nbs transfected into Marc-145 cells

將pcDNA3.1(-)-Nb1、pcDNA3.1(-)-Nb2分別轉(zhuǎn)染至Marc-145細(xì)胞中,用1 MOI PRRSV感染各組細(xì)胞與空細(xì)胞對(duì)照組,分別收集0、24、36、48、60、72 h的細(xì)胞樣品進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)PRRSVORF7基因 mRNA表達(dá)水平的變化。如圖9A所示,病毒與細(xì)胞共孵育24 h內(nèi),Marc-145-Nb1細(xì)胞內(nèi)的病毒載量與對(duì)照組無(wú)顯著差異,而在36～72 h內(nèi),Marc-145-Nb1細(xì)胞內(nèi)所含病毒量顯著低于對(duì)照組,說(shuō)明Nb1可以在細(xì)胞內(nèi)抑制PRRSV的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄。如圖9B所示,在病毒與細(xì)胞孵育48 h內(nèi),Marc-145-Nb2細(xì)胞內(nèi)所含病毒量與對(duì)照組無(wú)顯著差異,而于60～72 h內(nèi),Marc-145-Nb2細(xì)胞內(nèi)的病毒載量顯著低于對(duì)照組,這說(shuō)明Nb2亦具備抑制PRRSV復(fù)制的能力,但較于Nb1對(duì)病毒復(fù)制的抑制效力,Nb2抑制病毒復(fù)制的時(shí)間出現(xiàn)較晚,且隨時(shí)間的推移其阻礙病毒復(fù)制的能力呈下降趨勢(shì),這些因素均說(shuō)明Nb1較Nb2具備更強(qiáng)的阻礙病毒復(fù)制的能力。

A. Marc-145-Nb1對(duì)PRRSV復(fù)制的影響;B. Marc-145-Nb2對(duì)PRRSV復(fù)制的影響。與PRRSV對(duì)照組相比,ns表示無(wú)顯著性差異,***.P<0.001,****.P<0.000 1 A. The effect of Marc-145-Nb1 on PRRSV replication; B. The effect of Marc-145-Nb2 on PRRSV replication. Compared with the PRRSV control group, ns represents no significant difference, ***. P<0.001, ****. P<0.0001圖9 細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的Nb1與Nb2對(duì)PRRSV復(fù)制的影響Fig.9 The effect of intracellular expression of Nb1 and Nb2 on PRRSV replication

3 討 論

目前,豬繁殖與呼吸綜合征(俗稱藍(lán)耳病)在全球仍呈不斷傳播與流行的趨勢(shì)。在我國(guó),該病已流行二十多年,PRRSV特別是高致病性PRRSV的變異株始終是嚴(yán)重威脅我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的最重要病原之一。其中PRRSV GP5蛋白氨基酸序列的高突變性可能給豬群的疫苗保護(hù)帶來(lái)威脅,為藍(lán)耳病的防控帶來(lái)了不利影響[15],因此,對(duì)藍(lán)耳病的診斷與治療具有重大意義。GP5蛋白作為PRRSV中的重要結(jié)構(gòu)蛋白,可以刺激機(jī)體發(fā)生T細(xì)胞的增殖反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞免疫產(chǎn)生[16]。Wang等[17]使用GP5蛋白作為抗原進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)該蛋白具有較高特異性,是一種優(yōu)異的診斷抗原。Du等[18]使用ORF5基因制備的疫苗免疫仔豬與小鼠,發(fā)現(xiàn)疫苗可以使宿主細(xì)胞的黏膜免疫有所增強(qiáng),且能夠顯著提高仔豬與小鼠血清中IgG水平以及腸道內(nèi)IgA水平。因此,GP5蛋白憑借其具備良好的免疫原性以及較強(qiáng)的中和活性,已成為藍(lán)耳病相關(guān)抗體制備及疫苗研發(fā)的優(yōu)秀候選蛋白。

納米抗體作為一種較為新穎且親和力強(qiáng)的抗原識(shí)別工具,可能因其凸起的對(duì)角以及靈活的CDR3環(huán)形成loop環(huán),可與蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)上的裂隙與空腔進(jìn)行結(jié)合,從而能識(shí)別隱蔽的病毒表位與酶的活性位點(diǎn),這意味著納米抗體有助于潛在生物靶標(biāo)的預(yù)測(cè)以及新的藥理靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)[19]。與傳統(tǒng)抗體相比,納米抗體具備體積小、易于表達(dá)與改造等優(yōu)勢(shì),其可以直接靶向作用于抗原表位,亦可以構(gòu)建成納米抗體融合蛋白或是多價(jià)納米抗體以發(fā)揮治療作用[20-21]。近年來(lái),納米抗體在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域抗體研究方面發(fā)揮著不可或缺的作用,且在疾病的診斷與治療方面的研究持續(xù)推進(jìn)[22]。劉紅亮[13]針對(duì)PRRSV Nsp9蛋白篩選出的Nb6納米抗體可以抑制多種PRRSV毒株在細(xì)胞中的增殖與復(fù)制。宋歡等[23]制備出PRRSV Nsp2蛋白納米抗體,結(jié)果顯示所篩納米抗體具有高度特異性,可滿足其作為診斷與治療抗體的要求。

本研究首先利用原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)PRRSV-GP5蛋白進(jìn)行表達(dá),經(jīng)鎳柱親和層析法純化后免疫羊駝,三免14 d后羊駝體內(nèi)抗體效價(jià)高達(dá)1∶819 200,后通過噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建GP5-VHH噬菌體抗體展示文庫(kù)。噬菌體展示技術(shù)源自于將外源多肽于單鏈?zhǔn)删w表面上展示的相關(guān)研究[24],其原理為將編碼外源蛋白的基因序列或外源多肽插入至編碼噬菌體衣殼蛋白的基因中,從而使得外源蛋白或多肽在噬菌體的表面得以展示[25]。經(jīng)鑒定,所獲噬菌體文庫(kù)的庫(kù)容量達(dá)2.93×107CFU·mL-1,插入率達(dá)98%。后進(jìn)行連續(xù)三輪“吸附-洗脫-富集”的特異性噬菌體淘選,結(jié)果顯示,重組噬菌體得到了有效富集,且每輪的洗脫量與回收率均逐漸升高,最終獲得2株不同氨基酸序列的納米抗體,間接ELISA顯示,所篩納米抗體均與PRRSV-GP5蛋白具有良好的親和力。隨后將所獲的2個(gè)Nb基因克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)中,利用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入Marc-145細(xì)胞內(nèi),與PRRSV共孵育以探究?jī)芍昙{米抗體于胞內(nèi)對(duì)病毒復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的影響,結(jié)果顯示所篩的Nb1與Nb2均可在細(xì)胞內(nèi)抑制PRRSV的復(fù)制,且Nb1對(duì)病毒復(fù)制的抑制效力要優(yōu)于Nb2,這意味著Nb1可成為新型抗PRRSV藥物的候選者。

4 結(jié) 論

成功表達(dá)與純化PRRSV-GP5蛋白,免疫羊駝后,利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建出GP5-VHH噬菌體抗體展示文庫(kù),首次篩選出針對(duì)PRRSV-GP5蛋白的特異性納米抗體,且該納米抗體于細(xì)胞內(nèi)展現(xiàn)出較好的抑制病毒復(fù)制的能力。研究結(jié)果為抗PRRSV新型藥物的研發(fā)提供了新的思路與試驗(yàn)依據(jù)。