基于黏膜sIgA抗體的非洲豬瘟病毒感染早期血清學(xué)檢測(cè)方法的建立

白 昀,謝青云,歐陽(yáng)偉,甘 源,袁 廳,趙東明,步志高, 邵國(guó)青,馮志新*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210014; 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱 150069; 3.獸用生物制品(泰州)國(guó)泰技術(shù)創(chuàng)新中心,泰州 225300)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起家豬及野豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。ASFV的臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、皮膚發(fā)紺和淋巴結(jié)、腎、胃腸黏膜明顯出血,強(qiáng)毒株感染的病死率可高達(dá)100%[1]。2018年8月,我國(guó)遼寧省某養(yǎng)豬場(chǎng)首次暴發(fā)ASF疫情,而后迅速席卷全國(guó),造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。目前,臨床上流行的低毒力突變株產(chǎn)生亞急性型、且可造成長(zhǎng)期潛伏感染,給ASF的精準(zhǔn)預(yù)防和控制帶來(lái)了很大的困難[4-6]。由于感染這些低毒力突變株的動(dòng)物病毒載量低、間歇性排毒和個(gè)體差異大[4],采用qPCR檢測(cè)ASFV是有限的。目前臨床上已嘗試同步檢測(cè)抗原和抗體,以提高檢測(cè)精度,但ASFV血清抗體檢測(cè)技術(shù)還有待進(jìn)一步提高,特別是早期診斷的靈敏度方面。

P30蛋白是ASFV粒子的主要誘導(dǎo)蛋白,由CP204 L基因編碼,帶有強(qiáng)的免疫原決定簇,可作為體液免疫反應(yīng)非常有效的誘導(dǎo)蛋白。P30蛋白能在感染后早期表達(dá)和分泌,與世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties,OIE)推薦的以CS-P為包被抗原的ELISA抗體檢測(cè)方法相比,可以提前1周檢測(cè)到ASFV特異性抗體,可用于感染后免疫反應(yīng)的早期檢測(cè)[7]。另外,ASFV主要以口鼻接觸的方式感染,除了血清中產(chǎn)生特異性的IgG抗體外,還可從口腔液中檢測(cè)特異性的黏膜sIgA抗體。sIgA抗體主要存在于口腔及呼吸道分泌液、唾液、淚液、乳汁、胃腸分泌液和泌尿生殖道分泌液中,是機(jī)體黏膜免疫的主要抗體,據(jù)報(bào)道,每100 mL人的唾液中IgA、IgG和IgM的含量分別僅為19.4、1.4和0.2 mg,明顯低于血清中的含量,這使得以口腔液作為抗體檢測(cè)對(duì)象時(shí),IgA抗體檢測(cè)極限沒(méi)有血清抗體高,同時(shí)由于口腔液的均質(zhì)性問(wèn)題,檢測(cè)值的均一穩(wěn)定性也不如血清,但黏膜sIgA抗體也是病原體侵入后最先產(chǎn)生的免疫反應(yīng),常用作疾病感染早期診斷的檢測(cè)指標(biāo)[8-10]。許多學(xué)者將口腔液應(yīng)用于不同豬病的抗體檢測(cè),如豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型病毒(PCV2)、豬瘟病毒、豬流感病毒和偽狂犬病病毒等[11-17],認(rèn)為口腔液中的抗體水平可以滿足免疫學(xué)診斷[11]。本課題組前期研究將呼吸道黏膜sIgA抗體作為豬肺炎支原體感染的診斷靶標(biāo),可實(shí)現(xiàn)感染后4 d即檢測(cè)到轉(zhuǎn)陽(yáng),比血清中IgG抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)時(shí)間至少早14 d[18]。

因此,本研究擬建立一種不用采血,可以從口腔液中檢測(cè)ASFV特異性sIgA抗體的方法,為ASFV的早期診斷提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料 MiniBEST質(zhì)粒純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、BAC/PAC DNA Isolation Kit購(gòu)自O(shè)mega公司;蛋白marker和質(zhì)粒pFastBac1購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司;X-tremeGENE HP DNA transfection轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Roche公司;HRP-豬IgA單克隆抗體[19]由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所制備與保存;Grace’s Insect Cell Culture購(gòu)自Gibco公司;其他試劑均為分析純。

1.1.2 參考血清 ASFV抗體陰性血清,收集自2017年以前健康豬,由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存提供;ASFV抗體陽(yáng)性血清,由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所國(guó)家非洲豬瘟專業(yè)實(shí)驗(yàn)室提供,保存于-70 ℃。

1.1.3 參考口腔液 ASFV黏膜抗體陰性口腔液,采集自8～10周齡健康豬,其對(duì)應(yīng)豬的血清經(jīng)金諾百泰公司非洲豬瘟病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒(批號(hào):20210646)鑒定為陰性,由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供;感染ASFV后不同時(shí)間同一頭豬的口腔液和血清樣品由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所國(guó)家非洲豬瘟專業(yè)實(shí)驗(yàn)室提供;豬瘟病毒(CSFV)抗體陽(yáng)性口腔液、豬偽狂犬病病毒(PRV)抗體陽(yáng)性口腔液和PRRSV抗體陽(yáng)性口腔液分別采集自4～6周齡經(jīng)口鼻免疫(滴鼻1頭份,口服5頭份)相應(yīng)活疫苗(CSFV活疫苗(CVCC AV1412株)、PRV活疫苗(Bartha-K61株)和PRRSV活疫苗(JXA1-R株))后28 d的杜×長(zhǎng)×大三元豬。三種抗體檢測(cè)方法如下:分別在CSFV抗體檢測(cè)試劑盒、PRV抗體檢測(cè)試劑盒和PRRSV抗體檢測(cè)試劑盒(均購(gòu)自韓國(guó)金諾)的酶標(biāo)板中每孔加入100 μL用試劑盒稀釋液稀釋一倍后的口腔液樣品,37 ℃孵育2 h后洗滌3次,加再入1∶10 000稀釋的 HRP標(biāo)記羊抗豬IgA(BETHYL公司產(chǎn)品),100 μL·孔-1,37 ℃孵育0.5 h后洗滌3次;加入底物TMB,37 ℃避光顯色,測(cè)定OD450 nm值>2.1×未免對(duì)照組OD450 nm值;同時(shí),同一頭豬其對(duì)應(yīng)時(shí)間的血清經(jīng)相應(yīng)的商品化ELISA抗體檢測(cè)試劑盒鑒定也為陽(yáng)性;以上樣品均保存于-70 ℃。

1.1.4 臨床樣品 臨床口腔液樣品43份,其中30份采集自2018年以前屠宰場(chǎng)的屠宰豬,由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院獸醫(yī)研究所保存于-40 ℃。另13份采集自人工感染野毒變異株HLJ/HRB1/20后不同時(shí)間以及與感染豬同圈飼養(yǎng)豬,以及與口腔液樣品對(duì)應(yīng)的同一時(shí)間同一頭豬的血清樣品13份,由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所國(guó)家非洲豬瘟專業(yè)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒 SUMO-P30 的構(gòu)建

1.2.1 密碼子優(yōu)化與基因合成 根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的非洲豬瘟病毒P30基因序列CP204L(GenBank. NO. MH766894,124 770～125 375),采用分子生物學(xué)技術(shù),根據(jù)昆蟲(chóng)細(xì)胞的密碼子偏愛(ài)性,對(duì)ASFV的P30基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化,同時(shí)在P30的N′端添加6×His-SUMO標(biāo)簽。優(yōu)化設(shè)計(jì)的基因6×His-SUMO-P30由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成。

1.2.2 重組桿狀病毒vBAC-P30的制備與鑒定 將上述合成的6×His-SUMO-P30基因通過(guò)BamHI和HindIII雙酶切插入桿狀病毒供體質(zhì)粒pFastBac1,獲得含SUMO-P30基因的重組桿狀病毒供體質(zhì)粒pFastBac-SUMO-P30。再轉(zhuǎn)化E.coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞,按X-tremeGENE HP DNA transfection說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9細(xì)胞;當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)80%時(shí),離心收集培養(yǎng)上清即為重組桿狀病毒vBAC-P30。用BAC/PAC DNA Isolation Kit提取重組Bacmid DNA,以其為模板采用引物S-p30(y-F2):5′-GGATCCACCATGTCCTACTACC-3′和S-p30(y-R2):5′-AAGCTTTTAGAACATCAGGTGC-3′進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序。

1.3 重組SUMO-P30蛋白的表達(dá)與鑒定

1.3.1 重組SUMO-P30蛋白的表達(dá)與純化 將重組桿狀病毒vBAC-P30株按1%的體積(V/V)感染sf9細(xì)胞,72～96 h后,1 000×g離心10 min,棄掉上清,收集細(xì)胞沉淀。用Binding buffer重懸細(xì)胞沉淀,超聲破碎。4 ℃,12 000×g15 min收獲上清液。經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾裝載至Ni親和柱。用10倍柱體積Binding buffer進(jìn)行漂洗,用5倍柱體積 Elution buffer進(jìn)行洗脫,洗脫后的蛋白用蛋白濃縮超濾管(截留分子量10 000 MWCO)4 000×g離心,洗滌濃縮后即為SUMO-P30蛋白,分裝,-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 重組SUMO-P30蛋白的Western blot鑒定 將純化的SUMO-P30重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)印至NC膜,用5%脫脂乳(PBS稀釋)37 ℃封閉2 h后,分別以500倍稀釋(PBS)的ASFV抗體陽(yáng)性血清和ASFV抗體陰性血清作為一抗,2～8 ℃孵育過(guò)夜;TBST洗滌3次,10 min·次-1。用TBST進(jìn)行1∶20 000倍稀釋的HRP-羊抗豬IgG酶標(biāo)抗體,37 ℃孵育0.5 h。TBST洗滌3次,10 min·次-1。按ECL試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行顯色,觀察特異蛋白條帶。

1.4 ASFV間接ELISA黏膜sIgA抗體檢測(cè)方法的條件優(yōu)化及效果檢驗(yàn)

1.4.1 包被方案的確定及條件優(yōu)化 用棋盤法對(duì)P30重組蛋白不同包被濃度(4～0.5 μg·mL-1)和口腔液樣品稀釋度(9∶1、8∶2、5∶5、2∶8、1∶9)進(jìn)行優(yōu)化;以最佳方案包被P30重組蛋白后,分別以5%脫脂乳、3%脫脂乳、1%水解乳蛋白、1%牛血清白蛋白(BSA)、1%酪蛋白(OXOID)和0.25%明膠作為封閉液,37 ℃封閉2 h后棄去,分別檢測(cè)2份ASFV抗體陰性口腔液和2份ASFV抗體陽(yáng)性口腔液樣品,37 ℃溫育30～120 min后棄去液體,洗滌酶標(biāo)板3次后加入不同稀釋比例的HRP-豬IgA單克隆抗體,置37 ℃溫育30～90 min后棄去液體,洗滌酶標(biāo)板3次,加入TMB顯色液,37 ℃避光顯色5～20 min后終止反應(yīng)。讀取OD450 nm值,計(jì)算P/N平均值。

1.4.2 臨界值CUT-OFF的確定 按照優(yōu)化好的方案檢測(cè)219份健康豬口腔液樣品(其中育肥豬169份、母豬20份、保育豬30份),與其對(duì)應(yīng)同一頭豬的血清樣品經(jīng)金諾百泰公司非洲豬瘟病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒鑒定為陰性,計(jì)算S/P值=(樣品的OD450 nm值-陰性對(duì)照的OD450 nm平均值)/(陽(yáng)性對(duì)照的OD450 nm平均值-陰性對(duì)照的OD450 nm平均值),再計(jì)算所有樣品的S/P平均值(X)和3倍S/P值標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)之和,將X+3SD作為陰性血清的臨界值,小于等于臨界值判為陰性。大于臨界值判為陽(yáng)性。

1.4.3 敏感性檢驗(yàn) 取ASFV黏膜抗體陽(yáng)性口腔液,按2倍比稀釋至128倍,利用本試驗(yàn)建立的 ELISA方法進(jìn)行檢測(cè),評(píng)估該ELISA方法的靈敏度。

1.4.4 特異性檢驗(yàn) 利用本試驗(yàn)建立的間接ELISA方法分別檢測(cè) CSFV、PRV、PRRSV黏膜抗體陽(yáng)性口腔液,檢測(cè)該方法的特異性。

1.4.5 重復(fù)性與穩(wěn)定性檢驗(yàn) 取2份ASFV黏膜抗體陽(yáng)性口腔液作為強(qiáng)陽(yáng)性樣品、2份經(jīng)16倍稀釋(PBS)的ASFV黏膜抗體陽(yáng)性口腔液作為弱陽(yáng)性樣品及4份陰ASFV黏膜抗體陰性口腔液作為陰性樣品,使用同批次包被的酶標(biāo)板進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn),檢驗(yàn)該方法的批次內(nèi)穩(wěn)定性;使用3個(gè)不同批次包被的酶標(biāo)板進(jìn)行檢測(cè),檢驗(yàn)該方法的批次間穩(wěn)定性;分別以O(shè)D450 nm讀值計(jì)算出變異系數(shù),分析該方法的穩(wěn)定性。

1.4.6 抗體分泌規(guī)律檢驗(yàn) 以本試驗(yàn)建立ASFV間接ELISA黏膜抗體檢測(cè)方法檢測(cè)2頭經(jīng)口鼻接種105TCID50ASFV強(qiáng)毒株HLJ/18后0、3、6 d的口腔液樣品(2頭試驗(yàn)豬均在感染后第8天死亡)和2頭經(jīng)口腔接種106TCID50ASFV人工致弱株HLJ/18-7GD后0、5、10、15、20、30、45、60 d的口腔液樣品,同時(shí)用金諾百泰公司ASFV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)同一頭豬的血清抗體,比較黏膜抗體和血清抗體的轉(zhuǎn)陽(yáng)時(shí)間。

1.4.7 臨床樣品的檢測(cè) 用本研究建立的非洲豬瘟病毒間接ELISA黏膜抗體檢測(cè)方法對(duì)43份臨床口腔液樣品進(jìn)行檢測(cè),并將其中來(lái)自于人工感染豬的13份口腔液樣品和13份血清樣品,分別用本研究方法及商品化非洲豬瘟病毒血清抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)并比較,計(jì)算符合率。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物及酶切鑒定

將人工合成的6×His-SUMO-P30基因克隆到pFastBac1載體上后,轉(zhuǎn)染SF9細(xì)胞,構(gòu)建重組桿狀病毒vBAC-P30株。以提取的重組質(zhì)粒為模板,通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得了大小約為981 bp的特異性目的條帶,與預(yù)期大小一致,測(cè)序結(jié)果通過(guò)比對(duì)顯示插入序列無(wú)突變和缺失,結(jié)果表明正確構(gòu)建了重組桿狀病毒vBAC-P30株。

2.2 重組SUMO-P30蛋白的SDS-PAGE和Western blot鑒定

重組桿狀病毒vBAC-P30株在SF9細(xì)胞中傳代兩次后收獲培養(yǎng)液上清,經(jīng)Ni柱親和純化后,對(duì)純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot鑒定。SDS-PAGE結(jié)果顯示,純化后出現(xiàn)一條約47 ku大小的單一條帶,Western blot結(jié)果顯示,其與ASFV抗體陽(yáng)性血清在約47 ku大小左右位置出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶(圖1);而與ASFV抗體陰性血清沒(méi)有出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶,由此證明該SUMO-P30重組表達(dá)蛋白能夠被ASFV抗體識(shí)別,具有良好的反應(yīng)原性。

P.重組蛋白SUMO-P30純化前后PAGE分析;A.非洲豬瘟病毒抗體陽(yáng)性血清;B.非洲豬瘟病毒抗體陰性血清。泳道:1.空載體pFastBac1-6×His-SUMO轉(zhuǎn)染SF9細(xì)胞破碎蛋白;M. Protein Marker;2.純化前的感染SF9細(xì)胞破碎蛋白;3.純化后的SUMO-P30重組蛋白 P. PAGE analysis of recombinant protein SUMO-P30 before and after purification; A. ASFV antibody positive serum; B. ASFV antibody negative serum. Lane: 1. Empty plasmid pFastBac1-6×His SUMO transfected SF9 cell disruption protein; 2. Infected SF9 cell disruption protein before purification; 3. Purified SUMO-P30 recombinant protein圖1 重組蛋白SUMO-P30的SDS-PAGE和Western blot分析Fig.1 SDS-PAGE and Western blot analysis of recombinant protein SUMO-P30

2.3 ASFV間接ELISA黏膜sIgA抗體檢測(cè)方法反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果顯示5%脫脂乳為最佳封閉液。P30重組蛋白的最佳包被濃度為1.0 μg·mL-1,口腔液樣品與5%脫脂乳的最佳比例為8∶2,待檢口腔液在37 ℃的最佳孵育時(shí)間為120 min;酶標(biāo)抗體的最佳作用稀釋度為1∶5 000,最佳反應(yīng)時(shí)間為60 min;TMB底物的最佳顯色時(shí)間為15 min。

2.4 臨界值的確定

按照優(yōu)化好的方案檢測(cè)219份健康豬口腔液樣品(其中采集自育肥豬169份,母豬20份,保育豬30份,與其對(duì)應(yīng)同一頭豬的血清樣品經(jīng)金諾百泰公司ASFV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)為陰性),計(jì)算S/P值。結(jié)果顯示,所有陰性口腔液樣品的S/P平均值(X)為0.024,標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)為0.050,陰性樣品的S/P平均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差為0.174,考慮到臨床樣品的復(fù)雜性,適當(dāng)放寬陽(yáng)性樣品判定的臨界值,即當(dāng)樣品的S/P值<0.2時(shí)判為陰性,當(dāng)樣品的S/P值≥0.2時(shí)判為陽(yáng)性(圖2)。

圖2 陰性口腔液樣品的黏膜sIgA抗體ELISA檢測(cè)結(jié)果(n=219)Fig.2 ELISA results of mucosal sIgA antibody in negative oral fluid samples(n=219)

2.5 敏感性檢驗(yàn)

利用本研究建立的間接ELISA方法檢測(cè)經(jīng)PBS作1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128稀釋的ASFV黏膜sIgA抗體陽(yáng)性口腔液,結(jié)果顯示,2份ASFV黏膜sIgA抗體陽(yáng)性口腔液的最大稀釋倍數(shù)均為1∶32(圖3),表明該方法具有較好的敏感性。

圖3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Sensitivity test results

2.6 特異性檢驗(yàn)

利用本研究建立的間接ELISA方法分別檢測(cè) CSFV、PRV、PRRSV黏膜sIgA抗體陽(yáng)性口腔液,結(jié)果如表1所示,該方法能夠特異性檢測(cè) ASFV黏膜sIgA抗體口腔液,具有良好的特異性。

2.7 重復(fù)性與穩(wěn)定性檢驗(yàn)

利用建立的ASFV間接ELISA 黏膜sIgA抗體檢測(cè)方法對(duì)8 份口腔液樣本進(jìn)行批次內(nèi)及批次間重復(fù)試驗(yàn),結(jié)果顯示其變異系數(shù)均小于15%(表2),表明該方法具有較好的穩(wěn)定性。

2.8 黏膜sIgA抗體分泌規(guī)律

以本研究建立的ASFV間接ELISA黏膜sIgA抗體檢測(cè)方法檢測(cè)2頭經(jīng)口鼻感染 ASFV強(qiáng)毒株HLJ/18后0、3、6 d的口腔液樣品(2頭試驗(yàn)豬均在感染后第8天死亡)和2頭經(jīng)口腔接種106TCID50ASFV人工致弱株HLJ/18-7GD后0、5、10、15、20、30、45、60 d的口腔液樣品,同時(shí)用金諾百泰公司ASFV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)同一頭豬的血清抗體,結(jié)果如圖4所示,感染ASFV強(qiáng)毒株HLJ/18后第3天就有1頭豬可檢測(cè)到口腔液中的ASFV特異性黏膜sIgA抗體轉(zhuǎn)陽(yáng),到感染后第6天,兩頭豬均可檢測(cè)到黏膜sIgA抗體轉(zhuǎn)陽(yáng),而兩頭豬的血清抗體在感染后的第6天仍為陰性(圖4A)。感染人工致弱株HLJ/18-7GD后,口腔液中的ASFV特異性黏膜sIgA抗體最早在第5天就顯著提升,30～45 d后可穩(wěn)定檢出抗體陽(yáng)性;血清抗體在監(jiān)測(cè)期內(nèi)一直未檢測(cè)到轉(zhuǎn)陽(yáng)(圖4B)。

表1 特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Specific test results

表2 ASFV間接ELISA 黏膜sIgA抗體檢測(cè)方法的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(OD450 nm值)Table 2 Repeatability test results of ASFV indirect ELISA mucosal sIgA antibody detection method(OD450 nm value)

A. 感染強(qiáng)毒株HLJ/18;B. 口腔接種人工致弱株HLJ/18-7GD。血清IgG抗體的判定標(biāo)準(zhǔn):S/P值>0.4為陽(yáng)性,S/P值≤0.4為陰性;黏膜sIgA抗體的判定標(biāo)準(zhǔn):S/P值≥0.2為陽(yáng)性,S/P值<0.2為陰性 A. Infected with virulent strain HLJ/18; B. Oral inoculation of artificially attenuated strain HLJ/18-7GD. The determination standard of serum IgG antibody: S/P value > 0.4 is positive, and S/P value ≤ 0.4 is negative; The determination standard of mucosal sIgA antibody: S/P value ≥ 0.2 is positive, and S/P value<0.2 is negative圖4 人工感染ASFV后黏膜抗體與血清抗體的分泌規(guī)律Fig.4 Secretion patterns of mucosal and serum antibodies after artificial infection with ASFV

2.9 臨床樣品的檢測(cè)

用本研究建立的非洲豬瘟病毒間接ELISA黏膜抗體檢測(cè)方法對(duì)43份臨床口腔液樣品進(jìn)行檢測(cè),其中采集自2018年以前的30份口腔液樣品均為陰性;采集自人工感染豬的13份口腔液樣品中有10份陽(yáng)性,而對(duì)應(yīng)的13份血清樣品經(jīng)商品化非洲豬瘟病毒血清抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)出5份為陽(yáng)性。本研究方法與商品化血清抗體檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)陽(yáng)性符合率為100%,陰性符合率為37.5%,總符合率為61.5%。

表3 13份臨床口腔液與13份血清樣品檢測(cè)結(jié)果符合率Table 3 Compliance rate of 13 clinical oral fluid samples and 13 serum samples detection results

3 討 論

ASF于2018年傳入我國(guó),是一種急性、熱性、感染病死率高達(dá)100%的烈性傳染病,給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的損失[2-3]。經(jīng)過(guò)近4年的傳播,國(guó)內(nèi)出現(xiàn)了部分自然變異弱毒株,其致病力發(fā)生一定程度減弱,引起的臨床癥狀不明顯,傳播不易引起注意,更容易造成大面積擴(kuò)散,對(duì)其根除也將變得困難[20-21]。當(dāng)豬被低毒力毒株感染時(shí),高特異性與靈敏度的抗體診斷可能是監(jiān)測(cè)被感染動(dòng)物的最佳方法。目前,我國(guó)商品化的ASFV抗體檢測(cè)試劑盒都是檢測(cè)血清中的抗體,在ASFV的監(jiān)測(cè)和防控工作中被應(yīng)用,但其檢測(cè)敏感性仍有待進(jìn)一步提高[22-24]。而豬的機(jī)體在應(yīng)答ASFV感染時(shí),除了血清中產(chǎn)生特異性的IgG抗體外,在呼吸道與消化道黏膜還可產(chǎn)生特異性的sIgA抗體。sIgA抗體主要存在于呼吸道分泌液、唾液、淚液、乳汁、胃腸分泌液和泌尿生殖道分泌液中,是機(jī)體黏膜免疫的主要抗體,也是病原體通過(guò)侵入后最先產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。ASFV作為一種主要通過(guò)口鼻途徑傳播的病原,口腔液中的 sIgA抗體非常適合作為早期檢測(cè)的抗體樣本。另外,以口腔液為檢測(cè)樣品而替代常規(guī)的血清樣品,在樣品采集的操作上更為方便,也更加符合動(dòng)物福利的要求。

P30蛋白是 ASFV較為保守的主要結(jié)構(gòu)蛋白,在感染早期表達(dá)和分泌,感染后4 h即可在細(xì)胞漿中檢測(cè)到P30,可用于感染早期的檢測(cè)[25-27],是目前國(guó)內(nèi)外最常選擇的檢測(cè)靶標(biāo)蛋白之一[22,28-33]。本研究選擇利用昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)P30蛋白,并且通過(guò)在目標(biāo)蛋白前增加SUMO標(biāo)簽和His標(biāo)簽,使P30蛋白呈可溶性表達(dá),且表達(dá)量可達(dá)每100 mL的SF細(xì)胞產(chǎn)出10 mg以上的純化蛋白,大大提高了P30蛋白的產(chǎn)出。通過(guò)與ASFV陰、陽(yáng)性血清的Western blot試驗(yàn)結(jié)果表明,SUMO和His標(biāo)簽不會(huì)影響試驗(yàn)的特異性。為之后產(chǎn)業(yè)化降低成本提供了可能。

在確定臨界值的試驗(yàn)中,由于大量的臨床陽(yáng)性樣品難以得到,本研究通過(guò)用大量的臨床陰性樣品的S/P平均值+3倍的標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)確定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)仍有個(gè)別樣品的S/P值在0.174以上,考慮到臨床樣品的復(fù)雜性,將判定臨界值確定為0.2以減少檢測(cè)的假陽(yáng)性。在特異性檢驗(yàn)試驗(yàn)中,由于沒(méi)有CSFV、PRV、PRRSV黏膜抗體陽(yáng)性口腔液標(biāo)準(zhǔn)品,本研究通過(guò)檢測(cè)接種相應(yīng)的弱毒活疫苗后不同時(shí)間點(diǎn)的口腔液發(fā)現(xiàn),免疫后28 d時(shí),用相應(yīng)病毒的商品化抗體檢測(cè)試劑盒中的抗原包被板檢測(cè)口腔液樣品,以超過(guò)對(duì)照未免豬的口腔液檢測(cè)值的2.1倍為閾值線,均可判為陽(yáng)性,可作為CSFV、PRV、PRRSV黏膜抗體陽(yáng)性口腔液樣品使用。

在檢測(cè)經(jīng)口鼻接種ASFV強(qiáng)毒株HLJ/18后的口腔液樣品結(jié)果顯示,感染強(qiáng)毒株后第3天即可從口腔液中檢測(cè)到的ASFV特異性黏膜sIgA抗體,而血清抗體在感染后的第6天仍為陰性。在檢測(cè)口服接種ASFV基因缺失株HLJ/18-7GD后的抗體分泌規(guī)律試驗(yàn)中,有1頭豬口腔液中的黏膜sIgA抗體最早感染后5 d,S/P值就顯著提升,但在隨后的10、15和20 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)不能穩(wěn)定的檢測(cè)到特異性黏膜抗體,直到接種后第30天以后才可穩(wěn)定的檢測(cè)到特異性黏膜抗體,這可能是由于口腔液中的黏膜抗體不均一,或采樣前試驗(yàn)豬喝水導(dǎo)致口腔液被稀釋等原因造成。本研究中,試驗(yàn)豬經(jīng)口服接種ASFV基因缺失株HLJ/18-7GD后,血清抗體雖在監(jiān)測(cè)末期出現(xiàn)提升,但在整個(gè)監(jiān)測(cè)期內(nèi)一直未檢測(cè)到轉(zhuǎn)陽(yáng),這與以前發(fā)表的報(bào)道中,以相同劑量肌肉注射14 d后出現(xiàn)血清抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)不一致[34]。這可能與ASFV弱毒株以不同的接種方式感染后,在體內(nèi)增殖效率及抗體應(yīng)答能力的差異有關(guān)。

在檢測(cè)口腔液中ASFV黏膜sIgA抗體分泌規(guī)律試驗(yàn)中,本研究只統(tǒng)計(jì)了2頭試驗(yàn)豬的樣品,數(shù)量較少,但表現(xiàn)出了一致的趨勢(shì)。自然變異弱毒株的感染在目前臨床上較為多見(jiàn),給常規(guī)的核酸檢測(cè)與血清抗體檢測(cè)帶來(lái)很大挑戰(zhàn)。本研究建立的黏膜sIgA抗體檢測(cè)方法在自然變異弱毒株感染的檢測(cè)中,相比常規(guī)的血清抗體檢測(cè)方法體現(xiàn)出更為敏感的優(yōu)勢(shì),可實(shí)現(xiàn)ASFV感染的早期與敏感診斷。另外,在目前越來(lái)越注重ASFV精準(zhǔn)防控和提高動(dòng)物福利的大環(huán)境下,無(wú)需采集血清即可快速檢測(cè)ASFV感染的方法具有廣闊的應(yīng)用前景。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)了ASFV的SUMO-P30蛋白,并建立了ASFV黏膜sIgA抗體的間接ELISA檢測(cè)方法,可從感染豬的口腔液中檢測(cè)到特異性sIgA黏膜抗體,陽(yáng)性口腔液的最大稀釋度可達(dá)1∶32,且不與CSFV、PRV、PRRSV黏膜抗體陽(yáng)性口腔液反應(yīng),感染ASFV后3～5 d,S/P值就顯著提升,具有良好的敏感性和特異性。為ASFV的早期血清學(xué)診斷方法提供了新的思路,為ASFV的防控提供了科學(xué)工具。