奶牛產后急性子宮內膜炎血液氧化脂質組變化特征

王瑞玲,王雪妍,王菲菲,孔維怡,毛永霞,劉 欣,丁 輝,許立華,郭延生

(寧夏大學動物科技學院,銀川 750021)

奶牛圍產期(產前21 d～產后21 d)代謝機能會發(fā)生顯著改變,大約50%產后奶牛在圍產期會經歷一種或多種生殖道系統(tǒng)炎癥或代謝病,如奶牛胎衣不下、子宮內膜炎和酮病等[1]。奶牛子宮內膜炎是奶牛圍產期常見的生殖系統(tǒng)疾病,也是奶牛飼養(yǎng)管理中常見的疾病,可導致奶牛不孕,產奶量降低,繁殖力和生產效益下降[2],對畜牧業(yè)造成嚴重的經濟損失。奶牛子宮內膜炎在病程上分為急性和慢性子宮內膜炎,而大多數(shù)產后子宮內膜炎都是急性子宮內膜炎[3]。造成奶牛產后急性子宮內膜炎發(fā)生的病因復雜,至今尚無有效的預防手段,其發(fā)生機制也有待于進一步深入研究。Putman等[4]研究發(fā)現(xiàn)氧化脂質與產后奶牛炎性疾病的高發(fā)密切相關。氧化脂質是多不飽和脂肪酸的氧化產物,是有效的可溶性炎癥介質,在炎癥反應、免疫防御和代謝應激等生命活動中起著非常重要的調控作用[5],衍生自ω-6(n-6系列)不飽和脂肪酸(PUFA)的氧化脂質,如花生四烯酸可促進炎性反應。相反,來源于ω-3(n-3系列)PUFA的氧化脂質,包括二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸,與抗炎作用有關[6]。Luo等[7]采用廣靶代謝組技術對奶牛血液代謝物的變化規(guī)律進行了研究,發(fā)現(xiàn)與氧化脂質相關的亞油酸、花生四烯酸和γ-亞麻酸等代謝產物在產后明顯上調,但氧化脂質的變化是否與產后急性子宮內膜炎的發(fā)生密切相關,還有待于進一步驗證。脂質組學是基于分析化學和質譜聯(lián)用的方法,尋找與代謝調控密切相關的脂質標志物,可以通過研究生物體脂代謝物的變化,揭示機體內不同脂質與疾病的關系,進而探討其可能的作用機制[8]。目前尚未見到采用脂質組學技術研究產后急性子宮內膜炎奶牛血漿氧化脂質水平變化的相關報道。因此本試驗采用UPLC-MS/MS脂質組學技術研究產后急性子宮內膜炎奶牛血漿氧化脂質的變化規(guī)律,并通過通路富集分析探討了氧化脂質參與產后急性奶牛子宮內膜炎發(fā)生的可能機制,以期從氧化脂質角度揭示產后奶牛子宮內膜炎的發(fā)生機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

甲醇(Merck,色譜純,濟南澤盛化工有限公司)、乙腈(Merck,色譜純,南京鑫旭生物科技有限公司)、乙酸(Merck,色譜純,南京鑫旭生物科技有限公司)、異丙醇(Merck,色譜純,南京鑫旭生物科技有限公司)、LC-MS/MS(QTRAP 6500+,SCIEX)、離心機(5424R,Eppendorf)、超聲清洗儀(KQ5200E,昆山舒美)、ELISA試劑盒(江蘇晶美生物科技有限公司)。

1.2 實驗動物的選擇與分組

奶牛產后子宮內膜炎的痊愈標準:奶牛子宮角大小對稱,無病理性子宮分泌物、陰道中有少量透明黏液[9]。診斷標準:陰道黏液中含有50%左右黏膿性物質;細胞學檢查時陰道黏液中的中性粒細胞比例大于18%。排除標準:試驗開始前一個月有用藥記錄;患有其他產后疾病,例如胎衣不下、產后陰門炎與陰道炎、子宮內翻及脫出、乳房炎、酮病等。依據(jù)上述標準選取7頭產后7 d患有子宮內膜炎的奶牛,治療前視為試驗組(E),治療痊愈后視為對照組(C)。

患有子宮內膜炎的奶牛臨床癥狀表現(xiàn)為體溫升高,食欲減退,精神萎靡,反芻減弱,常做排尿姿勢,陰門流出灰白色黏液,并帶有臭味,臥地時排出量增多,子宮頸黏膜充血,子宮角增大。廣譜土霉素靜脈注射治療子宮內膜炎,劑量3 g,隔日一次,連用2～3次。經治療14 d后奶牛體溫恢復正常,食欲和精神狀況良好,子宮分泌物透明無異味。

1.3 血漿樣本采集與預處理

在產后7 d晨飼前用含肝素鈉的一次性真空采血管對奶牛尾根靜脈采血10 mL,4 ℃、3 000 r·min-1離心15 min,吸取上清;在奶牛痊愈后的第7天,用同樣方法采集健康奶牛的血液,將收集到的兩組血液用干冰低溫送到武漢邁特維爾生物科技有限公司進行脂質組學分析。首先將100 μL的血漿樣品(均勻的旋渦)加入200 μL的甲醇進行萃取;樣品渦旋5 min之后低溫放置沉淀蛋白;在每個樣品中添加1 μmol·L-1的內標混合溶液20 μL,渦旋10 min;在4 ℃條件下5 000 r·min-1離心10 min;用相同條件提取兩次,收集上清液混合;將固相萃取柱活化平衡后、進行上樣、淋洗、洗脫、再進行收集洗脫液;最后將洗脫液濃縮干燥,再將其與100 μL的甲醇/水(1∶1)溶液混合,并在渦旋30 s后,將上清液提取出來,進行UPLC-MS/MS分析。

1.4 炎性因子的測定

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血漿中炎性細胞因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10的水平,所有試驗步驟分別按TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10 ELISA檢測試劑盒說明書進行。

1.5 色譜質譜條件

1.5.1 超高效液相(UPLC)色譜條件 色譜柱采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱(1.8 μm,100 mm×2.1 mm),柱溫設為40 ℃,進樣量為10 μL;流動相A:乙腈/水(60/40),含0.002%乙酸;流動相B:乙腈/異丙醇(50/50);梯度洗脫條件見表1。

表1 UPLC洗脫梯度Table 1 UPLC elution gradient

1.5.2 串聯(lián)質譜(MS/MS)采集條件 電噴霧離子源(electrospray ionization,ESI)溫度設為550 ℃,質譜電壓為-4 500 V,簾氣(curtain gas, CUR)為35 psi,根據(jù)去簇電壓和碰撞能掃描檢測每個離子對。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

1.6.2 氧化脂質的定性和樣本質控分析 購買標準品構建氧化脂質質譜數(shù)據(jù)庫,對血漿樣品中的氧化脂質進行定性分析。質控樣本(quality control,QC)由樣本提取物混合制備而成,在分析過程中,每隔10個檢測分析樣本插入一個質控樣本,分析QC樣本的離子流(TIC)重疊圖,以監(jiān)測分析過程的重復性。

1.6.3 氧化脂質的定量分析 通過三重四級桿質譜的多反應監(jiān)控模式(multiple reaction monitoring,MRM)對樣品中氧化脂質進行定量分析。配制0.01、0.02、0.04、0.1、0.2、0.4、1、2、4、10、20、40、100、200、400 nmol·L-1氧化脂質標準品溶液,獲取各個濃度標準品的對應定量信號的質譜峰強度數(shù)據(jù);以外標與內標濃度比(concentration ratio)為橫坐標,外標與內標峰面積比(area ratio)為縱坐標,繪制各氧化脂質的標準曲線。將檢測到的所有樣本的積分峰面積比值代入標準曲線線性方程進行計算,獲得積分峰面積比值濃度值,將該濃度值代入氧化脂質含量計算公式,最終得到實際樣本中各氧化脂質的絕對含量。氧化脂質含量計算:X=c*V/V0,其中X為樣本中氧化脂質的含量(nmol·L-1),c為樣本中積分峰面積比值代入標準曲線得到的濃度值(nmol·L-1),V為復溶時所用溶液的體積(μL),V0為稱取的樣本體積(μL)。

1.6.4 血漿差異氧化脂質的篩選與通路富集分析 獲得各氧化脂質在每個樣品中的含量數(shù)據(jù)后,采用主成分分析(principal component analysis, PCA)法判斷兩組血漿氧化脂質的代謝輪廓的差異,在此基礎上,采用正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)法篩選差異氧化脂質,根據(jù)OPLS-DA模型中變量重要性投影(variable importance in projection, VIP)值,選取VIP≥1的代謝物,同時結合單變量分析的差異倍數(shù)值(fold change, FC),進一步篩選FC≥2或FC≤0.5且P<0.05的氧化脂質視為兩組差異氧化脂質,將差異氧化脂質導入MetaboAnalyst 5.0軟件進行聚類分析以驗證所篩選的差異氧化脂質的可靠性,并通過脂質代謝數(shù)據(jù)庫(https://lipea.biotec.tu-dresden.de/analyze)進行通路富集分析。

2 結 果

2.1 血漿中炎性細胞因子測定

如圖1所示,與對照組相比,試驗組奶牛血漿中TNF-α、IL-1、IL-8、IL-10的含量極顯著升高(P<0.01),IL-6水平顯著升高(P<0.05)。

2.2 血漿樣本定性及質控分析

血漿樣品MRM多峰圖見圖2,展示了樣本中能夠檢測到的物質,不同顏色的色譜峰代表檢測到的不同氧化脂質。通過與氧化脂質標準品數(shù)據(jù)庫比對,兩組奶牛血漿中共鑒定出43種脂質代謝物,其中花生四烯酸及其代謝物23個,亞油酸及其衍生物5個,亞麻酸及其衍生物6個,二十碳五烯酸及其代謝物6個,二十二碳六烯酸有3個(表3)。由血漿樣本質譜檢測TIC重疊圖(圖3)可知,氧化脂質檢測總離子流的曲線重疊性高,表明檢測期間儀器分析系統(tǒng)穩(wěn)定可靠,可為后續(xù)的分析提供保證。

*. P<0.05,**. P<0.01圖1 炎性細胞因子測定結果Fig.1 Measurement results of inflammatory cytokines

圖2 血漿MRM代謝物檢測多峰圖Fig.2 Multimodal diagram of plasma MRM metabolite detection

圖3 奶牛血漿樣本質譜檢測TIC重疊圖Fig.3 Overlay of TIC detected by mass spectrometry in dairy cow plasma samples

表2 43種血漿代謝物標準曲線Table 2 Standard curves of 43 plasma metabolites

(續(xù)表2 Continued)

(續(xù)表2 Continued)

2.3 子宮內膜炎奶牛血漿氧化脂質代謝輪廓和差異氧化脂質的篩選

采用PCA法對C、E兩組奶牛血漿樣本進行氧化脂質代謝輪廓分析,如圖4所示,C組與E組代謝輪廓存在明顯差異,這說明產后急性子宮內膜炎奶牛血漿氧化脂質水平發(fā)生了顯著變化。為了進一步篩選兩組差異氧化脂質,建立了OPLS-DA模型,模型評價參數(shù)Q2=0.538,R2Y=0.722(Q2≥0.4且R2Y≤1,表明模型具有可靠性),表明模型可靠,可用于篩選差異代謝物。如圖5所示,OPLS-DA模型能明顯將C,E兩組區(qū)分開。將OPLS-DA模型中VIP≥1的氧化脂質,視為候選差異氧化脂質,通過差異倍數(shù)(fold change, FC)進一步篩選FC≥2或FC≤0.5且P<0.05的氧化脂質,視為兩組最終的血漿差異氧化脂質。共篩選出了10個差異氧化脂質,其中4種含量上調,6種含量下調。差異氧化脂質的名稱、含量、平均含量、VIP值、P值、FC值及變化趨勢見表3和圖6。各氧化脂質在兩組中的變化趨勢見圖7。

圖4 對照組(C組)對試驗組(E組)血漿總體樣本PCA得分圖Fig.4 The control group (C group) versus the experimental group (E group) plasma total sample PCA score chart

圖5 血漿總體樣本OPLS-DA得分圖(a)和驗證圖(b)Fig.5 Plasma total sample OPLS-DA score chart (a) and verification plot (b)

圖中每一個點表示一種脂質代謝物,藍點代表下調的差異脂質代謝物,紅點代表上調的差異脂質代謝物,灰色的點則代表差異不顯著的脂質代謝物 Each point in the figure represents a type of oxidized lipid, blue dots represent down-regulated differential lipid metabolites, red dots represent upregulated differential lipid metabolites, and the gray dots represent lipid metabolites that are not significantly different圖6 血漿氧化脂質代謝物火山圖Fig.6 Volcanic chart of plasma oxidized lipid metabolites

圖7 血漿差異脂質代謝物小提琴圖Fig.7 Violin diagram of plasma differential lipid metabolites

2.4 差異氧化脂質的聚類驗證與通路富集

將篩選出的10種差異氧化脂質進行聚類分析,繪制熱圖(圖8),結果顯示篩選出的10種差異氧化脂質能明顯區(qū)分C組和E組,說明篩選出的差異氧化脂質有較強的可靠性。將10種差異氧化脂質通過脂質代謝庫進行通路富集分析(圖9),結果顯示這10中差異氧化脂質參與了花生四烯酸代謝通路、TRP通道的炎癥介質調節(jié)通路、PPAR信號通路、血管平滑肌收縮通路、醛固酮的合成與分泌通路和血清素能突觸通路。雖然花生四烯酸代謝通路和TRP通道的炎癥介質調節(jié)通路為顯著富集通路[-lg(P)>0.5且pathway impact>0.05],但通過文獻查閱發(fā)現(xiàn)PPAR信號通路和血管平滑肌收縮通路也都參與了炎癥的發(fā)生。

3 討 論

3.1 產后急性子宮內膜炎奶牛炎性因子的變化

細菌感染是導致奶牛發(fā)生子宮內膜炎發(fā)生的主要原因。研究表明大多數(shù)炎性細胞因子在子宮內膜炎奶牛血清中表達水平明顯升高[10-11]。本試驗研究結果顯示產后急性子宮內膜炎奶牛血漿中IL-1、IL-6、IL-8含量顯著升高,這與Sakai等[12]研究結果一致。TNF-α可用作奶牛子宮內膜炎診斷標志物[13],當TNF-α的表達量升高時,會對子宮內膜上皮細胞產生直接的影響,造成內皮細胞的損傷,引起子宮內膜炎的發(fā)生[14]。同時,高水平的TNF-α可促進IL-1、IL-6和IL-8的釋放[14]。IL-1具有較強的促炎活性,可誘導細胞因子和趨化因子等促炎介質,導致炎癥事件的發(fā)生。在局部,IL-1信號的結果可導致粘附分子上調,促進淋巴細胞募集,隨后免疫細胞被激活,炎癥進一步放大[15],另外,增多的IL-1還可間接增強子宮的收縮能力,促進子宮內分泌物的排出。子宮內膜上皮細胞和基質細胞分泌IL-6,將巨噬細胞聚集到感染部位,誘導子宮內膜炎的發(fā)生。而IL-8是中性粒細胞的重要趨化劑,與多種炎癥性疾病(如子宮內膜炎)相關[16]。

IL-10是最重要的抗炎細胞因子,由單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和T細胞的各種亞群產生[17]。IL-10的主要生物學功能是抑制單核細胞和/或巨噬細胞來源的腫瘤壞死因子TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8[18]。Justyna等[19]研究報道子宮內膜炎患者的血清中IL-10水平升高,Islam等[20]證明圍產期胎衣不下、子宮炎、子宮內膜炎奶牛血清中IL-10濃度明顯高于健康奶牛,可作為上述疾病早期診斷的指標。本試驗研究結果也顯示產后急性子宮內膜炎奶牛血漿中IL-10的表達水平顯著增高,與Islam等研究報道一致。

3.2 產后急性子宮內膜炎奶?；ㄉ南┧岽x通路的變化

在許多疾病中,氧化脂質被證明可以通過影響氧化應激的發(fā)展而調節(jié)炎癥的發(fā)生、發(fā)展與轉歸[21]。研究表明奶牛子宮內膜炎發(fā)病率隨抗氧化能力的減弱而增加,患子宮內膜炎的奶牛,子宮分泌物中有大量自由基產生,會造成機體的氧化損傷[22-23]。圍產期奶牛體內氧化應激的逐步發(fā)展是導致炎癥反應功能障礙的重要潛在因素,因此圍產期奶牛由于能量負平衡而導致的脂質大量動員參與了氧化應激的發(fā)展[22]。本試驗結果顯示試驗組奶牛血漿中氧化脂質8,9-EET、11,12-EET、14,15-EET的含量均顯著低于對照組。8,9-EET、11,12-EET、14,15-EET是環(huán)氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids,EETs)的三種同分異構體,而EETs是花生四烯酸(arachidonic acid,AA)代謝產生的主要活性物質,AA和它的衍生物參與了機體的營養(yǎng)代謝、免疫、炎癥反應以及氧化應激[24-25]。Mavangira和Sordillo[21]發(fā)現(xiàn)11,12-EET可阻斷TNF-α誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)氧化應激和凋亡,這主要歸因于EETs可介導抗氧化調節(jié)劑核因子相關紅細胞因子2(NrF2)來減少TNFα誘導的活性氧(ROS)產生。Yu等[26]研究報道,14,15-EET也通過抑制血紅素加氧酶抗氧化劑蛋白(HO-1)的轉錄抑制物的表達來降低氧化應激。此外,Sacerdoti等[27]研究表明,8,9-EET、11,12-EET和14,15-EET增加胰高血糖素釋放,而患子宮內膜炎的奶牛血漿中胰島素含量較健康奶牛低[28]。Li等[29]報道EETs可以通過阻斷核轉錄因子κB(NF-κB)介導的鈉-葡萄糖協(xié)同轉運蛋白2(SGLT2)轉錄改善葡萄糖穩(wěn)態(tài),充分說明葡萄糖穩(wěn)態(tài)與氧化脂質代謝紊亂密切相關。因此本試驗中試驗組奶牛血中8,9-EET、11,12-EET、14,15-EET水平的降低提示奶牛產后急性子宮內膜炎的發(fā)生可能與圍產期奶牛氧化應激的增強密切相關,同時氧化應激的增強還影響到了圍產期奶牛葡萄糖的穩(wěn)態(tài)。

表3 兩組血漿差異脂質代謝物及相關參數(shù)Table 3 Differential lipid metabolites and related parameters between two groups of plasma

圖8 血漿差異脂質代謝物聚類熱圖Fig.8 Clustering hat map of plasma differential lipid metabolites

圖9 差異脂質代謝物通路富集圖Fig.9 Enrichment map of differential lipid metabolite pathways

3.3 產后急性子宮內膜炎奶牛TRP通道的炎癥介質調節(jié)的變化

本試驗富集結果進一步顯示,在產后急性子宮內膜炎奶牛下調的8,9-EET和11,12-EET還參與了TRP通道的炎癥介質調節(jié)通路,瞬時受體電位(TRP)通道已被證明是參與脂質代謝和能量穩(wěn)態(tài)過程的關鍵調節(jié)蛋白,參與疾病的調節(jié)、氧化應激和炎癥介質的產生[30]。TRP通道可介導氧化應激參與細胞增殖和細胞周期進程,通過氧化應激調節(jié)TRP通道激活的治療方法可以顯著減少許多疾病過程中的組織損傷[31]。脂類物質既可與靶向TRP通道直接作用,又可與G蛋白偶聯(lián)受體結合,從而間接調控TRP通道的功能,因此,TRP通道是一種重要的脂類感受器,可以將輸入到各種脂類代謝通路中的信號進行整合并解讀[32]。脂質信號、花生四烯酸以及其他類似的多不飽和脂肪酸通過酶促或非酶促氧化反應,產生的類花生酸信號分子,激活瞬時受體電位香草酸亞型通道(TRPV),TRPV的激活可減輕炎癥反應[33-34]。Thomson等[35]發(fā)現(xiàn)11,12-EET可以激活大鼠腦動脈平滑肌細胞中的TRPV4通道,8,9-EET可以激活人內皮細胞中的TRPV4通道。本試驗結果顯示,試驗組奶牛血漿中8,9-EET和11,12-EET的含量均顯著低于對照組,提示奶牛產后急性子宮內膜炎的發(fā)生可能與產后脂質代謝紊亂,間接調控TRP通道有關。

3.4 產后急性子宮內膜炎奶牛PPAR信號通路的變化

富集結果顯示,在產后急性子宮內膜炎奶牛下調的14,15-EET還參與了PPAR信號通路。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)是作為配體激活轉錄因子發(fā)揮作用的核受體,有PPAR-α、PPAR-β/δ和PPAR-γ三種亞型。PPAR與葡萄糖和脂質代謝以及炎癥密切相關,并且在能量穩(wěn)態(tài)中起到調節(jié)作用[36]。PPAR還在免疫細胞中表達,對免疫細胞的分化具有關鍵作用。如PPAR-γ通過調控T淋巴細胞的分化,參與機體的免疫應答[37-38]。另有研究報道指出,PPAR-γ可作為抗氧化劑,通過逆轉膽固醇的轉運,進而抑制氧化應激的啟動[39-40]。PPAR配體包括多種脂肪酸,環(huán)氧合酶途徑的代謝物可以激活PPAR受體。Zhang等[41]已證明PPAR的所有亞型通過抑制促炎細胞因子如TNF-α、IL-1和IL-6的基因表達發(fā)揮抗炎作用,從而改善炎癥介導的疾病。大量研究還表明PPAR介導的EETs的作用,在炎癥相關疾病中至關重要[42-44]。因此本試驗結果提示產后急性子宮內膜炎的發(fā)生還可能與氧化脂質介導的PPAR信號通路的變化相關。

3.5 產后急性子宮內膜炎血管平滑肌收縮的變化

富集結果顯示,在產后急性子宮內膜炎奶牛下調的14,15-EET還參與了血管平滑肌收縮通路。血管平滑肌細胞具有顯著的可塑性,可在復雜的炎癥過程中與內皮細胞和免疫細胞的細胞間串擾中發(fā)揮作用,并且血管平滑肌細胞的收縮能力在維持血管張力方面發(fā)揮著關鍵作用,其收縮能力的減弱、異常的增殖和遷移參與了多種疾病發(fā)生與發(fā)展的病理過程[45-46]。EETs被假設為內皮衍生的超極化因子,因為它們通過Ca2+依賴性K+通道的激活來超極化和松弛血管平滑肌細胞,而且EETs可增加血管平滑肌細胞的細胞內鈣濃度,14,15-EET在一定條件下誘導的細胞外Ca2+流入與血管收縮有關[47]。本試驗結果顯示試驗組奶牛血漿中14,15-EET的含量均顯著低于對照組,提示產后急性子宮內膜炎奶牛血管平滑肌細胞的細胞內鈣濃度較健康牛低。因此產后急性子宮內膜炎的發(fā)生還可能與氧化脂質介導的血管平滑肌收縮的變化相關。

4 結 論

本試驗采用脂質組學技術分析產后7 d 急性子宮內膜炎奶牛血漿氧化脂質的變化特征,結果表明產后7 d 急性子宮內膜炎奶牛血漿氧化脂質代謝輪廓發(fā)生了顯著變化,10種氧化脂質發(fā)生了顯著變化,其中6種上調,4種下調。研究結果提示氧化脂質可以通過調節(jié)花生四烯酸代謝通路、TRP通道的炎癥介質調節(jié)、PPAR信號通路、血管平滑肌收縮等代謝通路參與產后急性子宮內膜炎的發(fā)生與發(fā)展。