分離自Mahewu中乳酸菌的體外益生潛力評(píng)估

Meluleki Hungwe，閆夢(mèng)娜，許婷婷，李妍，王鑫弛，王艷萍，耿偉濤

（天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津市食品質(zhì)量與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類代謝碳水化合物產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌，它們通常被用作益生菌培養(yǎng)物或發(fā)酵食品的發(fā)酵劑[1]。競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)、性能高的乳酸菌菌株可以通過益生菌潛力測(cè)試來篩選，選中的可用作益生菌[2]。益生菌是一種活的生物體，如果足量食用，可以對(duì)宿主人體產(chǎn)生一定的健康益處。益生菌的分離和應(yīng)用所考慮的主要特征是它們?cè)谌祟愂秤煤蟊还J(rèn)為安全（generally recognized as safe，GRAS），并且在食用后能夠在體內(nèi)保證足夠數(shù)量[3]。目前已有大量關(guān)于在動(dòng)物中使用乳酸菌來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和黏附上皮細(xì)胞的研究，證明了發(fā)酵過程中用作發(fā)酵劑培養(yǎng)物的乳酸菌可以作為益生菌的重要來源[4]。因此，近年來，人們對(duì)從不同來源的發(fā)酵食品和產(chǎn)品中分離和表征具有益生功能的乳酸菌產(chǎn)生了極大的研究興趣[5]。

Mahewu 是一種在南部非洲廣泛食用的由乳酸菌和酵母菌發(fā)酵玉米糊制得的天然發(fā)酵飲料[6-7]。這種發(fā)酵飲料不僅可以供成年人和幼兒飲用，在貧困地區(qū)甚至被用作嬰兒的斷奶食品[8]。Mahewu 的主要原料為玉米面和水，經(jīng)煮沸滅菌并放置至冷卻后，加入高粱麥芽作為發(fā)酵劑[9]。高粱麥芽是制作Mahewu 的關(guān)鍵因素，其可提供發(fā)酵過程所需的乳酸菌、酵母菌和β-淀粉酶。已經(jīng)有研究表明，乳酸菌的發(fā)酵作用是賦予Mahewu 眾多營(yíng)養(yǎng)和健康功能的主要原因之一[10]。因此，Mahewu 中分離獲得的乳酸菌有潛力作為功能性發(fā)酵谷物中的發(fā)酵菌種或者作為重要的益生菌進(jìn)行深入的開發(fā)。

乳酸菌作為一種益生菌，需要能夠承受胃液的酸性條件，并具有抵抗膽鹽的能力，可存活并定殖于或作用于腸道[11-12]。因此，具有益生功能的細(xì)菌被用作益生菌之前，必須通過體外評(píng)估進(jìn)行益生特性、安全性的測(cè)試[13]。本研究對(duì)來自津巴布韋的發(fā)酵劑制備的Mahewu 中8 株潛在益生菌進(jìn)行分離、分子生物學(xué)鑒定和益生特性評(píng)估，以期為非洲傳統(tǒng)發(fā)酵食品中益生菌資源開發(fā)和功能評(píng)價(jià)提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高粱麥芽：津巴布韋Meso 企業(yè)（私人）有限公司；硫酸亞鐵（FeSO4，分析純）：天津市化學(xué)試劑一廠；人工胃液（無菌，pH1.5）：福州飛凈生物科技有限公司；豬膽汁鹽：上海生威科技有限公司；MRS 瓊脂、MRS 液體培養(yǎng)基：北京奧博興生物科技有限公司；過氧化氫（H2O2，分析純）：上海源葉生物科技有限公司；二甲苯、水楊酸、無水甲醇（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技有限公司；高糖DMEM 培養(yǎng)基[含10% 胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）]：武漢普諾賽生命科技有限公司；胰蛋白酶（250 U/mg）、青霉素、鏈霉素、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、聚乙二醇辛基苯基醚（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司；DNA 提取試劑盒、Taq PCR Mix 預(yù)混液（2×，含藍(lán)染料）：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Eclipse E200 顯微鏡：日本尼康公司；Multiskan GO全波長(zhǎng)讀數(shù)儀/超微量分光光度計(jì)、150i 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：賽默飛世爾科技公司；Sigma 3-18K 離心機(jī)：北京博華儀器有限公司；Delta 320 pH 計(jì)：梅特勒托利多科技（中國(guó)）有限公司；Gel Doc XR+全自動(dòng)凝膠成像儀：美國(guó)BIO-RAD 公司；DYY-Ⅲ-6B 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：北京六一儀器廠；YP-N 普通藥物天平：上海精科天平廠；SQL810C/1010C 高壓滅菌器：日本YAMATO 公司；DY-2 型厭氧培養(yǎng)箱：浙江冷凍機(jī)總廠；UV-9600 型紫外可見分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器公司；Mastercycler?X50-PCR 熱循環(huán)儀：艾本德（中國(guó)）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Mahewu 的制備

將蒸餾水與玉米粉按100∶5（mL/g）混合，煮沸15 min，冷卻至40 ℃，加發(fā)酵劑高粱麥芽，充分?jǐn)嚢?，室溫發(fā)酵48 h，監(jiān)測(cè)發(fā)酵物的pH 值和可滴定酸度（titratable acidity，TTA），參照Onyango 等[14]的方法進(jìn)行?？傻味ㄋ岫龋═，%）計(jì)算公式如下。

式中：A為滴定所需的NaOH 體積，mL；V為測(cè)試的樣品的體積，mL；0.009 為乳酸換算系數(shù)。

1.3.2 乳酸菌的分離與篩選鑒定

取Mahewu 樣品，用MRS 液體培養(yǎng)基梯度稀釋，將各梯度的稀釋液涂布于MRS 瓊脂固體培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。挑取平板上符合乳酸菌特征的白色圓形菌落，純化傳代培養(yǎng)3 代后保存于4 ℃?；诒硇秃蜕卣鲗?duì)挑取的菌落進(jìn)行初步的篩選和鑒定。

使用細(xì)菌DNA 提取試劑盒提取乳酸菌菌株的全基因組DNA。使用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）擴(kuò)增16S rRNA 基因。對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，依據(jù)16S rRNA 基因測(cè)序結(jié)果，利用MEGA 11 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 菌株耐酸和耐膽鹽能力的測(cè)定

參考Li 等[15]測(cè)定菌株對(duì)模擬胃液和膽鹽的耐受性。各個(gè)菌株接種到MRS 液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，將離心（4 ℃，8 000 r/min，10 min）獲得的菌體沉淀經(jīng)磷酸鹽緩沖溶液（phosphate belanced solution，PBS）洗滌兩次后用pH1.5 的模擬胃液（simulated gastric juice，SGJ）懸浮。37 ℃孵育3 h，收集0 h 和3 h 的樣品各100 μL，接種至5 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8 h 后測(cè)量OD600，分別記為A1、A2。菌株在模擬胃液下的存活率（W，%）使用以下公式進(jìn)行計(jì)算。

配制含有豬膽汁鹽濃度分別為0%、0.1%、0.3%和0.5% 的MRS 液體培養(yǎng)基后，以1% 接種量接種各乳酸菌，培養(yǎng)4 h 后，測(cè)量培養(yǎng)物的OD600，試驗(yàn)組記為A1，對(duì)照組記為A0。不同濃度膽鹽條件下的存活率（D，%）使用以下公式進(jìn)行計(jì)算。

1.3.4 細(xì)胞表面疏水性和自聚集能力測(cè)定

將待測(cè)菌株的培養(yǎng)物經(jīng)4 ℃、8 000 r/min 離心10 min，收集菌體細(xì)胞，參照Rokana 等[16]的方法進(jìn)行細(xì)胞表面疏水性的測(cè)定，參照Zommiti 等[17]的方法進(jìn)行自聚集能力測(cè)定。

將菌體細(xì)胞在PBS 中洗滌兩次后重懸于PBS 中，測(cè)量600 nm 處吸光度（A0）。將1 mL 二甲苯與3 mL細(xì)胞懸液混合后，37 ℃孵育1h 確保有機(jī)相和水相分離。隨后，取1 mL 水相在600 nm 處測(cè)量吸光度（A1）。細(xì)胞疏水性（X，%）利用以下公式計(jì)算。

將收集的各個(gè)菌株的菌體細(xì)胞在PBS 中洗滌兩次后，重懸在PBS 中至OD 值在0.3 左右，并置于厭氧培養(yǎng)箱中37 ℃孵育。于2、6、12、24 h 后，測(cè)定上層懸浮液在600 nm 處吸光度。自聚集能力（Z，%）利用以下公式計(jì)算。

式中：A1為2、6、12、24 h 后的吸光度；A0為0 h 時(shí)的初始吸光度。

1.3.5 DPPH 自由基清除活性測(cè)定

各個(gè)菌株對(duì)DPPH 自由基的清除活性參照Halliwell 等[18]的方法進(jìn)行。將1 mL 過夜培養(yǎng)的離心（4 ℃、6 000 r/min、20 min）獲取的菌液上清液分別與1 mL DPPH 溶液（0.2 mmol/L，無水乙醇溶解）或1 mL 無水乙醇混合，靜置30 min 后，6 000 r/min 離心20 min 取上清，于517 nm 處測(cè)量吸光度，記錄為As或Ab。同樣，1 mL 發(fā)酵液上清與1 mL DPPH 溶液混合后，經(jīng)反應(yīng)后于517 nm 處測(cè)量吸光度作為空白對(duì)照（Ac），DPPH 自由基清除活性（P，%）計(jì)算公式如下。

1.3.6 羥基自由基清除活性測(cè)定

羥基自由基清除活性的測(cè)定參照Halliwell 等[18]的方法，并略作修改。在試管中依次加入1 mL FeSO4溶液（5 mmol/L）、1 mL 水楊酸-乙醇溶液（5 mmol/L）以及1 mL H2O2（3 mmol/L），混合均勻后，加入各菌株發(fā)酵液上清1 mL，加入去離子水定容到10 mL。混勻后37 ℃水浴30 min，6 000 r/min 離心20 min 后所得的上清液于510 nm 處測(cè)吸光度。同上述處理相同，空白培養(yǎng)基代替發(fā)酵液上清進(jìn)行吸光度的測(cè)量，羥基自由基清除活性（Q，%）計(jì)算公式如下。

式中：Ac為空白培養(yǎng)基參與反應(yīng)后在510 nm 處的吸光度；As為各發(fā)酵液上清參與反應(yīng)后在510 nm 處的吸光度。

1.3.7 Caco-2 細(xì)胞黏附能力測(cè)試

按照占萌等[19]的方法，Caco-2 細(xì)胞在含10% FBS和雙抗（100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素）的DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d 換液1 次，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)為單層細(xì)胞后，加入0.5 mL 0.25% 的胰酶消化后進(jìn)行傳代。經(jīng)計(jì)數(shù)后，以每孔1 mL（1×106個(gè)/mL Caco-2 細(xì)胞）接種于12 孔板中，于37 ℃、5%CO2的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中再次培養(yǎng)至單層貼壁，無菌PBS 洗滌細(xì)胞3 次后用于黏附試驗(yàn)。

待測(cè)菌株接種于MRS 液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后，8 000 r/min 離心5 min 收集菌體，PBS 洗滌3 次后，利用PBS 進(jìn)行重懸，制備濃度約為108CFU/mL 的菌體懸液。

取1 mL 制備好的乳酸菌菌體懸液，分別加入單層Caco-2 細(xì)胞的12 孔板中，37 ℃、5%CO2條件下共孵育3 h。隨后，棄去孔中的菌懸液，并利用無菌PBS 清洗3 次除去未黏附的乳酸菌細(xì)胞。利用1 mL 的1% 聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）裂解細(xì)胞20 min，稀釋涂布MRS 平板，對(duì)黏附在Caco-2 細(xì)胞上的乳酸菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，記為x，接種的細(xì)胞數(shù)記為y。乳酸菌菌株對(duì)Caco-2 細(xì)胞的黏附能力通過黏附率進(jìn)行表征，黏附率（N，%）計(jì)算公式如下。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析使用SPSS 26.0 軟件，所有試驗(yàn)均進(jìn)行3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。在p＜0.05 的水平上有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mahewu 的pH 值和可滴定酸度

Mahewu 利用高粱麥芽中的乳酸菌和酵母菌對(duì)煮沸的玉米糊進(jìn)行發(fā)酵制備。其中，酸度是Mahewu 發(fā)酵過程中的重要指標(biāo)。Mahewu 的pH 值和可滴定酸度的變化如圖1所示。

圖1 Mahewu 發(fā)酵過程中的pH 值和可滴定酸度變化Fig.1 pH and titratable acidity during Mahewu fermentation

由圖1 可知，在發(fā)酵開始10 h 內(nèi)pH 值迅速下降，48 h 后pH 值降至3.33。同時(shí)，初始為0.29% 的可滴定酸度在20 h 內(nèi)迅速上升，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)增加到1.53%。pH 值和可滴定酸度的變化符合Mahewu 生產(chǎn)過程中的發(fā)酵特征[20]。

2.2 Mahewu中乳酸菌的分離和鑒定

將發(fā)酵48 h 的Mahewu 經(jīng)MRS 液體培養(yǎng)基梯度稀釋，于MRS 瓊脂上培養(yǎng)48 h 后，獲得大量乳酸菌菌落。隨后，通過形態(tài)觀察過氧化氫酶試驗(yàn)和革蘭氏染色，選取了8 株（菌株編號(hào)分別為H-1、H-3、H-4、H-7、H-9、H-11、H-14 和H-17）顯示具有典型乳酸菌特征的菌株進(jìn)行后續(xù)研究。其中，H-1、H-3、H-7、H-14 和H-17 為桿菌，而H-4 和H-9 為球菌。

對(duì)分離獲得的菌株進(jìn)行基于16S rRNA 的菌種鑒定?？寺〔y(cè)序獲得相應(yīng)菌株的16S rRNA 序列后，BLAST 進(jìn)行序列比對(duì)初步獲得相關(guān)菌株的種屬信息。選取若干參考菌株的16S rDNA 序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的繪制，結(jié)果如圖2所示。

圖2 分離菌株與參考菌株共同繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of isolated strains and reference strains

由圖2 可知，菌株H-1、H-3、H-7、H-11、H-14 和H-17 與植物乳植桿菌（Lactiplantibacillusplantarum）最為相似，而菌株H-4 和H-9 與腸膜狀明串珠菌（Leuconostocmesenteroides）或假腸膜狀明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）最為相似。上述類群均已被列入歐洲食品安全局資格認(rèn)定名單的推薦生物制劑列表以及國(guó)際乳品聯(lián)合會(huì)公報(bào)的“在發(fā)酵食品中證明安全的微生物品種目錄”[21]。

2.3 對(duì)模擬胃液和膽鹽的耐受性

對(duì)嚴(yán)苛的胃腸道環(huán)境的耐受性是乳酸菌發(fā)揮益生菌功能的基礎(chǔ)[22]，因此本研究對(duì)Mahewu 中分離的乳酸菌進(jìn)行了模擬胃液和膽鹽的耐受性研究。模擬胃液主要由稀酸、胃蛋白酶等組成，經(jīng)無菌處理，其組分和pH 值與胃液一致。各個(gè)菌株對(duì)模擬胃液的耐受性如圖3所示。

圖3 乳酸菌菌株對(duì)模擬胃液的耐受性Fig.3 Tolerance of lactic acid bacteria to simulated gastric juice

由圖3 可知，所有分離的菌株的存活率均在60%以上。菌株H-9 具有最高的存活率（99.62%），菌株H-1 和H-4 的存活率略低于菌株H-9，分別為99.30%和95.15%。菌株H-14 對(duì)模擬胃液的耐受性最低，存活率僅為66.30%。

菌株對(duì)不同濃度的膽鹽的耐受性如圖4所示。

圖4 乳酸菌菌株對(duì)不同濃度膽鹽的耐受性Fig.4 Tolerance of lactic acid bacteria to different concentrations of bile salts

由圖4 可知，所有菌株對(duì)0.1% 膽鹽具有耐受性，存活率超過60%，菌株H-7 和H-11 的存活率甚至超過了70%；當(dāng)膽鹽濃度為0.3%時(shí)，所有菌株存活率均超過45%，H-11 的存活率最高。膽鹽濃度為0.5%時(shí)，所有菌株的生長(zhǎng)均受到很強(qiáng)的抑制，其中菌株H-3 對(duì)膽鹽的耐受性最高，達(dá)到了51.4%。

2.4 分離菌株的細(xì)胞表面疏水性和自聚集能力

細(xì)菌的疏水性和自聚集能力是一種細(xì)胞表面特性，有助于實(shí)現(xiàn)乳酸菌菌株在消化道自身的保護(hù)和對(duì)腸道的黏附。自聚集的體外測(cè)試有助于評(píng)估益生菌在胃腸道黏附和定殖的潛在能力[23]。分離菌株的細(xì)胞表面疏水性如圖5所示。

圖5 菌株的細(xì)胞表面疏水性Fig.5 Cell surface hydrophobicity of the bacteria

由圖5 可知，疏水性最高的菌株為H-4，達(dá)到了79.00%；除此以外，菌株H-3、H-7 和H-11 也具有較高的疏水性（74.80%、68.06% 和70.65%）。疏水性最低的為菌株H-9，其疏水性僅為49.35%。

圖6 為各乳酸菌菌株的自聚集能力。

圖6 菌株的自聚集能力Fig.6 Auto aggregation of the bacteria

由圖6 可知，各個(gè)菌株隨著時(shí)間的延長(zhǎng)自聚集的現(xiàn)象逐漸加強(qiáng)。其中，菌株H-1、H-4 和H-17 在各個(gè)時(shí)間段均表現(xiàn)出較強(qiáng)的自聚集能力，并且菌株H-4 和H-17 在24 h 表現(xiàn)出較強(qiáng)的自聚集能力，分別為68.89%和68.81%。

2.5 對(duì)Caco-2 細(xì)胞的黏附能力

進(jìn)一步利用人結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2 細(xì)胞株測(cè)試本研究所分離的乳酸菌對(duì)腸道上皮細(xì)胞的黏附能力。Caco-2 細(xì)胞是一種體外培養(yǎng)的腸上皮細(xì)胞，可以經(jīng)體外培養(yǎng)表現(xiàn)出成熟的腸上皮細(xì)胞的特性，并作為細(xì)胞模型來進(jìn)行益生菌在腸道表皮黏附的模擬試驗(yàn)[24]。經(jīng)過3 h 的共孵育使得各個(gè)菌株菌體細(xì)胞充分與Caco-2細(xì)胞黏附，對(duì)黏附有乳酸菌的Caco-2 細(xì)胞進(jìn)行裂解處理，并對(duì)黏附的乳酸菌進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，結(jié)果見圖7。

圖7 各菌株對(duì)Caco-2 細(xì)胞的黏附性Fig.7 The adhesion ability of the bacteria

由圖7 可知，各組的乳酸菌數(shù)目均為106CFU/孔左右，計(jì)算黏附效率得到全部菌株的黏附效率在0.068%～0.620% 之間。其中，菌株H-3 的黏附率最高（0.620%），而表面疏水性和自聚集能力均為最強(qiáng)的菌株H-4 具有0.58% 的黏附率。菌株H-1 的黏附率最低，僅為0.068%。

2.6 分離菌株的抗氧化能力

抗氧化能力指的是對(duì)于氧自由基和其他形成自由基的物質(zhì)的消除或減少作用。菌株的抗氧化能力是評(píng)價(jià)益生菌品質(zhì)時(shí)需要考慮的關(guān)鍵特征之一。DPPH 自由基清除活性的測(cè)定是一種常用的篩選與測(cè)定樣品抗氧化性能的有效和直接的方法[18]。DPPH 自由基清除活性與羥基自由基清除活性見圖8 和圖9。

圖8 不同菌株對(duì)DPPH 自由基清除活性Fig.8 DPPH radical scavenging activity of different strains of bacteria

圖9 不同菌株對(duì)羥基自由基清除活性Fig.9 Hydroxyl radical scavenging activity of different strains of bacteria

圖8 顯示，所有菌株的DPPH 自由基清除活性均在63% 以上，其中，菌株H-4 的DPPH 自由基清除活性最高，為73.43%；其次是菌株H-7，為73.12%。羥基自由基是體內(nèi)芬頓反應(yīng)的主要產(chǎn)物之一，是一種生物體內(nèi)重要的活性自由基[25]。在圖9 中，本試驗(yàn)測(cè)定的8 株菌株的發(fā)酵液上清對(duì)羥基自由基的清除活性在16.00%～19.33% 之間，均表現(xiàn)出一定的羥基自由基清除活性。其中，菌株H-9 的清除活性最強(qiáng)，為19.33%，其次是菌株H-7，具有19.11%的羥基清除活性。

3 結(jié)論

在本研究中，對(duì)來自津巴布韋的發(fā)酵劑制備的Mahewu 中篩選得到的8 株乳酸菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定、發(fā)酵性能測(cè)定和潛在的益生功能分析。生理生化試驗(yàn)和16S rRNA 測(cè)序的結(jié)果表明，8 株乳酸菌菌株中的H-1、H-3、H-7、H-11、H-14 和H-17 屬于植物乳植桿菌（Lactiplantibacillusplantarum），菌株H-4 和H-9 屬于腸膜狀明串珠菌或假腸膜狀明串珠菌。這8 株菌株都具有一定的模擬胃液和膽鹽耐受性、較高的細(xì)胞表面疏水性和自聚集能力、一定的Caco-2 細(xì)胞的吸附能力、DPPH 自由基和羥基自由基清除活性，表現(xiàn)出較好的益生菌特征。本研究證明，從Mahewu 分離的乳酸菌具有良好的益生菌潛能，它們有可能適合用作功能性發(fā)酵食品的發(fā)酵劑、輔助發(fā)酵劑或額外添加菌株。本研究為深入開發(fā)非洲傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的益生菌資源提供研究基礎(chǔ)。