雙孢蘑菇中一種4R型MYB轉(zhuǎn)錄因子的基因克隆和生物信息學分析

劉翔，趙紫璇，趙月盈，趙詩睿，賈子怡，姜含越，袁帥，孟德梅

（天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457）

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TF）是一類DNA 結(jié)合蛋白，可以特異性地與基因啟動子中DNA 特定序列發(fā)生相互作用，對其進行轉(zhuǎn)錄表達的調(diào)控[1]。V-myb 禽成髓細胞病病毒癌基因同源物（V-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog，MYB）是重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，通常包含4 個結(jié)構(gòu)功能域[2-3]，其中，靠近氨基N 端的一段高度保守的氨基酸序列稱為DNA 結(jié)合域，該區(qū)域一般由1～4 個不完全重復(fù)的R 序列串聯(lián)組成[4-5]。根據(jù)R 結(jié)構(gòu)特征可將MYB 轉(zhuǎn)錄因子分為1RMYB、R2R3-MYB、3R-MYB 和4R-MYB 4 個亞家族[6-7]，它們廣泛存在于植物、動物以及真菌中。R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子是植物MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族中最大的成員[8-9]，在調(diào)控植物生長發(fā)育、參與調(diào)節(jié)生物或非生物脅迫的過程中具有重要作用[10]。例如，Sun 等[11]研究發(fā)現(xiàn)R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子CaMYB108 沉默會負向調(diào)控雄蕊的發(fā)育；R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子OsMYB30 可轉(zhuǎn)錄上調(diào)OsPAL6和OsPAL8基因的表達，誘導(dǎo)水稻對褐飛虱的抗性增強[12]；Fang 等[13]發(fā)現(xiàn)楊樹中存在PtrMYB94基因，該基因參與楊樹中脫落酸依賴的正向干旱脅迫調(diào)控。目前，雖然R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子的功能研究較多，但是有關(guān)4R-MYB 轉(zhuǎn)錄因子的研究甚少且作用尚不清晰。MYB 轉(zhuǎn)錄因子的分類及功能[14-15]如表1所示。

表1 MYB 轉(zhuǎn)錄因子的分類及功能Table 1 Classification and functions of MYB transcription factors

此外，與植物相比，食用菌中轉(zhuǎn)錄因子的研究十分有限，對MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族的研究更是少之又少。目前，已有研究從基因組水平對香菇（Lentinula edodes）[16]、金針菇（Flammulinavelutipes）[17]、靈芝（Ganodermalucidum）[18]和平菇（Pleurotusostreatus）[19]中的MYB 類轉(zhuǎn)錄因子進行了生物信息學分析和鑒定，但關(guān)于雙孢蘑菇中MYB 轉(zhuǎn)錄因子的研究鮮見。前期研究通過轉(zhuǎn)錄組學從雙孢蘑菇子實體中發(fā)現(xiàn)了一個MYB 編碼基因（gene3947），為了更好地了解和分析其特性以及探尋可能的生物學功能，本研究對該基因進行了克隆，對其理化性質(zhì)、信號肽、保守結(jié)構(gòu)域以及二、三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，將其保守結(jié)構(gòu)域與其他物種中4R型MYB 的氨基酸保守結(jié)構(gòu)域序列進行了比對和親緣關(guān)系分析，之后對其亞細胞定位與啟動子序列進行了分析，為后續(xù)深入研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢蘑菇子實體：江蘇裕灌現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技有限公司；pGEX-6P-1 載體：天津科技大學食品營養(yǎng)與安全重點實驗室保存；T4 DNA 連接酶：Thermo Fisher Scientific；EcoR I 限制性內(nèi)切酶和Escherichiacoli（E.coli）DH5α：北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；XhoI 限制性內(nèi)切酶：美國NEB 公司；膠回收試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。

含有卡那霉素的（luria-bertani，LBK）固體培養(yǎng)基的配制：分別稱取5.0 g 酵母提取物，10.0 g 胰蛋白胨，10.0 g 的NaCl，15.0 g 瓊脂粉，用蒸餾水充分溶解，調(diào)pH 值至7.0 后，定容至1.0 L，在121 ℃的條件下高壓蒸汽滅菌20 min，待培養(yǎng)基冷卻至60 ℃，向培養(yǎng)基中加入1 mL（100 mg/mL）的卡那霉素，搖勻后分裝至無菌培養(yǎng)皿中，凝固后于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

Veriti9902 PCR 儀：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)有限公司；Champ Gel 5000 凝膠成像儀：賽智科技有限公司；ZXDPB2120 電熱恒溫箱：上海智誠分析儀器制造公司。

1.3 RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄及引物設(shè)計

參考Wang 等[20]的方法提取雙孢蘑菇總RNA，消化RNA 中殘留的基因組，檢測消化后RNA 的純度和質(zhì)量，最終反轉(zhuǎn)錄得到互補DNA（complementary DNA，cDNA）樣品。根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組學測序中MYB 編碼基因（gene3947）的序列，設(shè)計Ab4RMYB擴增所需特異性引物（F：5′CGCAAAGAACGGAAGGTGAT 3′和R：5′GCCAGAAGCAACAATAGTCGC 3′）。

1.3.1 基因的克隆及測序

以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 為模板，利用設(shè)計的特異性引物，進行聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增，PCR 擴增的反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min 30 s，以此條件擴增35 個循環(huán)；72 ℃終延伸15 min。反應(yīng)結(jié)束后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR 擴增產(chǎn)物進行檢測，并用膠回收試劑盒將條帶大小正確的PCR 產(chǎn)物進行回收。

將pGEX-6P-1 空載質(zhì)粒和經(jīng)PCR 回收的目的片段分別用限制性酶EcoR I 和XhoI 在37 ℃恒溫條件下雙酶切3 h，利用T4 DNA 連接酶于4 ℃反應(yīng)8～12 h，將酶切后的PCR 片段連接至pGEX-6P-1 載體，構(gòu)建pGEX-Ab4RMYB重組質(zhì)粒。利用化學轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)?；D(zhuǎn)入E.coliDH5α 感受態(tài)細胞，并涂布于LBK 固體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)8～12 h。使用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，用限制性酶EcoR I 和XhoI 做雙酶切驗證，酶切正確的質(zhì)粒進一步送檢進行測序驗證。

1.3.2 生物信息學分析軟件

通過在線工具對Ab4RMYB 轉(zhuǎn)錄因子的理化性質(zhì)、蛋白信號肽、核定位信號、蛋白結(jié)構(gòu)等進行分析，所用工具如表2所示。

表2 生物信息學分析工具Table 2 Tools used in bioinformatics analysis

1.3.3 多序列比對和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

將Ab4RMYB 的保守結(jié)構(gòu)域序列與高等植物、低等植物和真菌中已知的4R 型MYB 轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域序列通過DNAMAN6.0 進行多序列比對；不同物種的MYB 蛋白保守結(jié)構(gòu)域序列通過Clustal W 進行多序列比對后導(dǎo)入MEGA11.0 以鄰位相近法（neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。上述氨基酸序列信息均來自于NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），保守結(jié)構(gòu)域序列均通過表2 中SMART 在線工具尋找。

1.3.4 基因啟動子序列分析

從NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載Ab4RMYB基因的啟動子序列（起始密碼子上游2 000 bp），將基因的啟動子序列提交到PlantCARE 工具中（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/），同時使用TBtools 軟件對順式元件進行可視分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)由GSDS、SignalP-4.1、UCLA-DOE LAB—SAVES v6.0、DNAMAN6.0 分析得出，并采用Origin 2018 制圖，由MEGA11.0 以NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，由iTOL 進行美化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的克隆及序列分析

Ab4RMYB基因編碼區(qū)的擴增結(jié)果見圖1。

圖1 基因的擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification product

由圖1 可知，得到了片段大小1 200 bp 左右的PCR 產(chǎn)物，與預(yù)期基本一致。

重組載體的雙酶切驗證見圖2。

根據(jù)圖2 瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果表明，得到了大小分別為1 200 bp 和6 600 bp 左右的基因片段。質(zhì)粒測序結(jié)果表明，成功克隆出大小為1 209 bp 的基因片段。用DNAMAN6.0 對測序結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組測序基因編碼區(qū)進行序列比對，結(jié)果表明序列相似性為100%。

將測序后的序列提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫，查詢到該基因位于基因組的1601735-1603347 區(qū)域，mRNA 全長為1 613 bp。通過GSDS 基因結(jié)構(gòu)顯示器將目的基因當中的外顯子和內(nèi)含子相對位置進行可視化，基因的外顯子和內(nèi)含子分析如圖3所示。

圖3 Ab4RMYB 基因的外顯子和內(nèi)含子分析Fig.3 Exons and introns of Ab4RMYB

由圖3 可知，其序列包含9 個外顯子（1～184 bp、239～315 bp、363～456 bp、506～620 bp、673～791 bp、843～996 bp、1 048～1 131 bp、1 185～1 336 bp、1 384～1 613 bp）和8 個內(nèi)含子（185～238 bp、316～362 bp、457～505 bp、621～672 bp、792～842 bp、997～1 047 bp、1 132～1 184 bp、1 337～1 383 bp）。

2.2 Ab4RMYB 轉(zhuǎn)錄因子基本性質(zhì)分析

該基因翻譯的氨基酸為402 個，將氨基酸序列進行一級結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果如表3所示。

表3 Ab4RMYB 轉(zhuǎn)錄因子的基本性質(zhì)Table 3 Basic properties of Ab4RMYB

由表3 可知，其蛋白分子大小為45.95 kDa，理論等電點為9.17，不穩(wěn)定系數(shù)58.38，脂肪指數(shù)為72.34，親水性平均值為-0.784，屬于親水性蛋白。

2.3 Ab4RMYB 轉(zhuǎn)錄因子信號肽預(yù)測

部分分泌蛋白依靠N 端存在的一小段有特定結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基序列穿過細胞質(zhì)膜，這段特殊序列稱為信號肽或分泌信號序列[21]。Ab4RMYB 轉(zhuǎn)錄因子的信號肽預(yù)測結(jié)果如圖4所示。

圖4 Ab4RMYB 轉(zhuǎn)錄因子的信號肽預(yù)測Fig.4 Prediction of signal peptides of 4RAbMYB

由圖4 預(yù)測的結(jié)果中可見，切割位點的最大值為0.110，位于17 位氨基酸；合并切割位點最大值為0.110，位于17 位氨基酸；信號肽分數(shù)的最大值為0.148，位于13 位氨基酸。信號肽分數(shù)平均值0.111，其預(yù)測的剪切點在1～16 位氨基酸。信號肽分數(shù)平均值遠遠小于0.5，說明Ab4RMYB 轉(zhuǎn)錄因子不含信號肽結(jié)構(gòu)，不是分泌蛋白。

2.4 二級結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

用Prabi SOPMA 預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5所示。

圖5 Ab4RMYB 的二級結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.5 Secondary structure and predicted conserved domains of Ab4RMYB

由圖5A 可知，Ab4RMYB 轉(zhuǎn)錄因子二級結(jié)構(gòu)中含有大量的α-螺旋和無規(guī)則卷曲，少量的β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈結(jié)構(gòu)，從數(shù)量上看，主要以無規(guī)則卷曲（47.26%）和α-螺旋（45.52%）結(jié)構(gòu)為主。

使用SMART 數(shù)據(jù)庫預(yù)測Ab4RMYB 蛋白含有的保守結(jié)構(gòu)域，由圖5B 可知，Ab4RMYB 蛋白分布著4 個SANT 重復(fù)保守序列，分別處于第66～140 位、143～190 位、195～254 和261～316 位的氨基酸之間，從結(jié)構(gòu)上預(yù)測Ab4RMYB 屬于4R 類型MYB 轉(zhuǎn)錄因子。

2.5 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測及模型質(zhì)量評估

將Ab4RMYB 轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域（66～316aa）序列提交到I-TASSER 服務(wù)中通過從頭建模法獲取蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)模型如圖6所示。

圖6 Ab4RMYB 轉(zhuǎn)錄因子三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 Predicted tertiary structure of Ab4RMYB

由圖6 可知，Ab4RMYB 轉(zhuǎn)錄因子蛋白在N、C 兩端存在兩條向外延伸的無規(guī)則卷曲長鏈，其內(nèi)部存在4 個主要的不完全重復(fù)螺旋結(jié)構(gòu)（R），結(jié)構(gòu)中存在較多的α-螺旋和無規(guī)則卷曲，這與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符。InterPro 工具預(yù)測Ab4RMYB 轉(zhuǎn)錄因子存在2 個MYB DNA-binding domain，分別定位于R2（W147-G197）和R3（P198-W248）序列。

通過UCLA-DOE LAB—SAVES v6.0 中提供的ERRAT、WHATCHECK、PROCHECK 工具分別對三級結(jié)構(gòu)模型的不同原子間的非鍵相互作用、立體化學參數(shù)和立體化學質(zhì)量進行分析，結(jié)果圖7所示。

圖7 三級結(jié)構(gòu)的質(zhì)量評估Fig.7 Quality assessments of the predicted tertiary structure

原子間的非鍵相互作用力結(jié)果顯示，Ab4RMYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域的Overall Quality Factor 為87.310，大于85；立體化學參數(shù)結(jié)果顯示，Ab4RMYB 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域模型評估的48 個指標中21 個指標通過，17 個指標警告，10 個指標錯誤（圖7B）；立體化學質(zhì)量結(jié)果顯示，94.1%氨基酸殘基落在最佳區(qū)和允許區(qū)，說明該模型的構(gòu)象符合立體化學的規(guī)則（圖7C）。3 個工具獲取的評估結(jié)果均顯示預(yù)測模型質(zhì)量較好。

2.6 保守區(qū)域的多序列比對和關(guān)鍵氨基酸分析

將雙孢蘑菇中Ab4RMYB 的保守結(jié)構(gòu)域（66～316aa）與高等植物、低等植物以及真菌中的MYB 轉(zhuǎn)錄因子的SANT 保守結(jié)構(gòu)域進行序列比對。我們選取了高等植物中的MYBs 包括：蘋果（Malusdomestica，XP_008393534.1）、杜梨（Pyrusbetulifolia，APY20264.1）、桃（Prunuspersica，XP_007210492.1）、可可樹（Theobromacacao，XP_007036689.1）、蕓薹（Brassicarapa，XP_009145933.1）；低等植物中MYBs 包括：萊茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii，XP_042914591.1）、團藻（Volvoxcarteri，XP_002952676.1）、衣藻（Chlamydomonasschloesseri，KAG2450615.1）；真菌中MYBs 包括：白環(huán)蘑（Leucoagaricus，KXN89584.1）、紋緣盔孢傘（Galerinamarginata，KDR83959.1）、隆紋黑蛋巢菌（Cyathus striatus，KAF9006580.1）。Ab4RMYB 轉(zhuǎn)錄因子的多序列比對和保守氨基酸分析結(jié)果如圖8所示，其中B 圖為Ab4RMYB 轉(zhuǎn)錄因子氨基酸同源性百分比，序列的高度表示序列在該位置上的保守性。

從圖8 可看出，11 個來自不同物種的4R-MYB 轉(zhuǎn)錄因子的保守域都是由4 個不完全重復(fù)序列（R）即R1、R2、R3、R4 組成，通過氨基酸序列比對可以發(fā)現(xiàn)共有20 個100%保守的氨基酸殘基（如圖8A 黑色標注），其中9 個位于螺旋區(qū)域（α），11 個位于非螺旋區(qū)域中。20 個保守的氨基酸殘基中包含6 個100%保守的色氨酸，分布于4 個R 區(qū)中，并且R2 和R3 區(qū)域中規(guī)律存在著2 個100% 保守的色氨酸殘基，更為重要的是它們間隔20～30 個氨基酸，分別位于相鄰的兩個螺旋之間，共同形成一個疏水核心，對維持空間結(jié)構(gòu)具有重要的意義[22]。不僅如此，每個保守的色氨酸前后都存在75%保守性的其他氨基酸殘基（如圖8A 深灰色標注），共同形成保守域。這些保守的氨基酸殘基對于螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）結(jié)構(gòu)的維持也具有至關(guān)重要的作用。

在75%保守性的氨基酸殘基（圖8A 深灰色標注）中，相比于低等植物，雙孢蘑菇與其他真菌和高等植物的相似度更高，比如真菌和高等植物α4 中的丙氨酸（A），α5 中的第一個谷氨酸（E），α7 前端的精氨酸（R）以及內(nèi)部的半胱氨酸（C）、酪氨酸（Y）在低等植物中分別被甘氨酸（G），天冬氨酸（D），苯丙氨酸（F），纈氨酸（V）和色氨酸（W）所替代。此外Ab4RMYB 保守結(jié)構(gòu)域中147W、175R、176M、178S、179D、181R、182D、183R、185R、186N、187H、240G、241R、242Q、243Q、244C 共16 位氨基酸被預(yù)測為DNA 結(jié)合位點。研究表明[23-24]，AACNG 是植物中R2R3-MYB 結(jié)合的重要順式作用元件，其中擬南芥R2R3-MYB 中的K-55、N-106、K-109、N-110 被報道是識別與結(jié)合AACNG 基序至關(guān)重要的氨基酸[25]。但是，我們通過氨基酸序列分析并未在Ab4RMYB 序列中發(fā)現(xiàn)上述能夠識別和結(jié)合該順式作用元件的4 個氨基酸，說明4R 型MYB 轉(zhuǎn)錄因子可能與R2R3 型MYB 轉(zhuǎn)錄因子識別和結(jié)合的順式作用元件不同。

2.7 親緣關(guān)系分析

為更好地了解雙孢蘑菇中Ab4RMYB 轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，將雙孢蘑菇中Ab4RMYB 與植物、動物和真菌中MYB 蛋白的保守域進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，生物NCBI 號均來自NCBI 數(shù)據(jù)庫。用MEGA11.0 以NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，設(shè)置bootstrap 值為1 000。不同物種中MYB 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果如圖9所示。

圖9 不同物種中MYB 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.9 Phylogenetic tree of MYB proteins in different species

由圖9 可知，進化樹結(jié)果表明，同一類別的MYB轉(zhuǎn)錄因子親緣關(guān)系更近，本文研究的雙孢蘑菇中的Ab4RMYB 轉(zhuǎn)錄因子與白環(huán)蘑中的LeMYB 轉(zhuǎn)錄因子相似度最高，親緣關(guān)系最近。

2.8 Ab4RMYB 轉(zhuǎn)錄因子核定位信號和亞細胞定位分析

通過多種在線軟件預(yù)測Ab4RMYB 的核定位信息，結(jié)果如表4所示。

表4 Ab4RMYB 轉(zhuǎn)錄因子亞細胞定位分析Table 4 Subcellular localization of Ab4RMYB

由表4 可知，Novo Pro 預(yù)測核定位信號位于347～354 位氨基酸，PSORT Ⅱ預(yù)測核定位信號位于348～351 位氨基酸，兩種在線預(yù)測軟件均顯示其具有核定位序列（Nuclear localization sequence，NLS），可以進入細胞核。隨后，我們利用多種在線工具對Ab4RMYB亞細胞定位進行預(yù)測，結(jié)果均顯示其定位于細胞核。

2.9 Ab4RMYB 基因啟動子序列分析

真核生物基因的啟動子由核心啟動子和上游啟動子兩部分組成，是一類重要的DNA 序列。其作為基因表達的關(guān)鍵調(diào)控元件，具有控制基因轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)基因表達水平的功能[26]。為了探究Ab4RMYB 轉(zhuǎn)錄因子在雙孢蘑菇中可能參與或調(diào)控的生物過程，進一步通過PlantCARE 啟動子序列分析工具對Ab4RMYB基因的啟動子序列進行分析，結(jié)果如表5所示。

表5 Ab4RMYB 基因啟動子順式元件預(yù)測表Table 5 The cis-acting elements in Ab4RMYB promoter

Ab4RMYB基因啟動子序列中除含有2 個A-box，6 個CAAT-box 基本元件外，還含有13 個光反應(yīng)元件（1 個GTGGC-motif、1 個GATA-motif、1 個GA-motif、1 個chs-CMA2a、2 個I-box、1 個LAMP-element、1 個TCCC-motif、2 個Sp1 和3 個G-box）和1 個晝夜節(jié)律控制元件（circadian），此類元件的存在說明Ab4RMYB基因有可能在雙孢蘑菇的生長發(fā)育環(huán)節(jié)發(fā)揮著重要的作用[27]。與此同時，還含有1 個參與低溫響應(yīng)元件（LTR）、1 個參與干旱應(yīng)答的元件（MBS），3 個厭氧誘導(dǎo)所必需元件（1 個ARE 和2 個GC-motif）。這些說明Ab4RMYB基因在響應(yīng)生物抗逆應(yīng)答方面可能具有一定的調(diào)控機制。除此之外，發(fā)現(xiàn)其中還包含多種激素響應(yīng)的順式作用元件，如10 個茉莉酸甲酯誘導(dǎo)元件（5 個CGTCA-motif 和5 個TGACG-motif），2 個生長素響應(yīng)元件（TGA-element）、2 個脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）、3 個赤霉素響應(yīng)元件（1 個P-box 和2 個GARE-motif），這些元件的存在說明Ab4RMYB基因可能在特定的信號通路中發(fā)揮作用。通過以上分析表明，Ab4RMYB基因可能在雙孢蘑菇生長發(fā)育環(huán)節(jié)、抗非生物脅迫以及病原防御中具有重要的調(diào)控功能。

3 討論與結(jié)論

本研究首次從雙孢蘑菇中克隆到了一種4R型MYB轉(zhuǎn)錄因子編碼基因（Ab4RMYB），該基因編碼區(qū)長1 209 bp，編碼402 個氨基酸；其蛋白序列含有4 個保守的SANT-MYB 結(jié)構(gòu)域和規(guī)律性分布的色氨基酸殘基，屬于MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族中的4R-MYB 型，與白環(huán)蘑中的4R-MYB 轉(zhuǎn)錄因子親緣關(guān)系最近。結(jié)合信號肽分析和亞細胞定位預(yù)測分析，顯示其可在細胞核中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的功能。氨基酸序列分析顯示，該基因編碼蛋白序列中不含有植物R2R3-MYB 識別和結(jié)合AACNG 順式作用元件所需的氨基酸殘基[28-30]，說明Ab4RMYB 轉(zhuǎn)錄因子可識別和結(jié)合的順式作用元件可能與植物中R2R3-MYBs 轉(zhuǎn)錄因子不同。因此，后續(xù)研究中可通過酵母單雜、凝膠阻滯遷移、雙熒光素酶等實驗對其可結(jié)合的順式作用元件及可轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因進行進一步研究。此外，啟動子序列分析結(jié)果表明，該基因啟動子區(qū)域具有多個響應(yīng)生物抗逆應(yīng)答和響應(yīng)激素調(diào)控的元件，說明Ab4RMYB 可能與植物中R2R3-MYBs 轉(zhuǎn)錄因子有類似功能[31-32]，能夠參與調(diào)控雙孢蘑菇的逆境脅迫反應(yīng)及茉莉酸等激素信號的調(diào)控過程。但是，Ab4RMYB 能夠通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控哪些基因或代謝過程進而參與調(diào)控這些生物過程，以及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的具體分子機制還需后續(xù)的詳細研究。

綜上所述，本研究對雙孢蘑菇中Ab4RMYB 轉(zhuǎn)錄因子進行基因克隆及生物信息學分析鑒定，為今后進一步深入解析該轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征和相關(guān)功能，及后續(xù)雙孢蘑菇中的生物學功能的驗證奠定了基礎(chǔ)。