巨大芽孢桿菌對江蘺植株瓊脂直接脫硫工藝的建立及優(yōu)化

宋陽，劉振，毛相朝

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266403）

瓊脂是紅藻細(xì)胞壁內(nèi)基質(zhì)的主要成分[1]，因其凝膠特性被廣泛應(yīng)用于食品、化工和醫(yī)療等行業(yè)[2-5]。在全球范圍內(nèi)，瓊脂年產(chǎn)量超過14 500 t，2015年產(chǎn)值達(dá)到約2.46 億美元[6]。瓊脂主要來源于石花菜屬（Gelidium）、江蘺屬（Gracilaria）的植株，只有少量來自其它物種[7-8]。石花菜瓊脂具有較好的品質(zhì)，是生產(chǎn)高品質(zhì)瓊脂的首選原料，但石花菜屬的產(chǎn)量較低，不能滿足生產(chǎn)需要[9]。江蘺瓊脂因硫含量高導(dǎo)致其凝膠強(qiáng)度較低，但江蘺屬的物種則具有藻體大、產(chǎn)量高等優(yōu)勢。目前，80%的瓊脂是以江蘺為原料進(jìn)行提取和加工的[10-11]。

瓊脂中存在的硫酸基團(tuán)是導(dǎo)致其凝膠性能下降的主要因素，因此需要對瓊脂進(jìn)行脫硫處理[12-13]。目前工業(yè)中最常用的瓊脂脫硫方法是化學(xué)法[14]，但其堿處理過程中存在反應(yīng)條件劇烈、環(huán)境污染嚴(yán)重等問題[15-16]。另一方面，以芳基硫酸酯酶進(jìn)行瓊膠脫硫具有環(huán)境友好、反應(yīng)條件溫和、得率高等優(yōu)點(diǎn)[17-18]，但該方法存在酶活較低、在催化過程中酶逐漸失活且酶制劑制備工藝流程復(fù)雜繁瑣的問題，因此成本高，僅停留在實(shí)驗室階段，未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。微生物瓊脂脫硫法是利用微生物自身生長的硫需求來進(jìn)行瓊脂脫硫的方法。在缺乏其它硫源的情況下，微生物要獲得供應(yīng)自身生長的硫元素，就必須連續(xù)不斷地進(jìn)行瓊脂脫硫，所以隨著微生物的生長，用于脫硫的微生物數(shù)量不斷增加，形成脫硫的正循環(huán)。微生物法可以有效解決酶法脫硫中需要較高加酶量的問題，將酶法瓊脂脫硫中酶的異源表達(dá)、純化制備、酶催化瓊脂脫硫幾個步驟簡化為一個步驟，工藝流程簡單，節(jié)約成本。

巨大芽孢桿菌能以瓊脂為唯一硫源且不以瓊脂為碳源，已被證實(shí)能夠用于瓊脂脫硫[19]?；诖?，已建立了兩種微生物瓊脂脫硫方法，包括瓊脂液體脫硫法和瓊脂平板脫硫法[19]。但以上兩種方法仍不成熟。其中，瓊脂液體脫硫法存在微生物細(xì)胞和高黏度的液態(tài)瓊脂難以分離的問題，瓊脂平板脫硫法微生物細(xì)胞與瓊脂接觸面積小、脫硫率較低，導(dǎo)致該方法難以工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。同時在上述兩種方法中所使用的脫硫底物是瓊脂粉，而目前工業(yè)中的生產(chǎn)原料則是以江蘺為主的紅藻。

本研究利用巨大芽孢桿菌建立以江蘺為原材料的瓊脂脫硫技術(shù)。由于江蘺植株是含有瓊脂且在自然環(huán)境下穩(wěn)定存在的，因此探究巨大芽孢桿菌直接對江蘺進(jìn)行脫硫的效果。植株直接脫硫法操作簡單、微生物與瓊脂接觸面積大，在生產(chǎn)應(yīng)用方面具有相對較高的可行性。本研究探究紫外、乙醇、臭氧和NaClO 等滅菌方法，并對培養(yǎng)基中的江蘺添加量、培養(yǎng)基碳源、氮源和緩沖鹽的濃度等進(jìn)行優(yōu)化，以期通過優(yōu)化該工藝提高微生物法瓊脂脫硫的效率，實(shí)現(xiàn)瓊脂脫硫工藝的革新和瓊脂產(chǎn)品的提質(zhì)升級。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

菌株為巨大芽孢桿菌，由中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院海洋食品生物技術(shù)與工程實(shí)驗室篩選獲得，已保藏至中國典型培養(yǎng)物保藏中心，儲存編號為CCTCC M 20221885，菌株名稱為OUC-Gel（QD）-w#DS#1-WMX，簡稱WMX。江蘺：綠新（福建）食品有限公司。產(chǎn)地為印度尼西亞，置于干燥通風(fēng)處儲藏。

蛋白胨、酵母粉：英國OXOID 公司；次氯酸鈉溶液、75%乙醇：上海麥克林生化科技股份有限公司；瓊脂粉：上海索萊寶生物科技有限公司；5×M9 基礎(chǔ)鹽、M9 微量元素：艾禮生物科技（上海）有限公司；D-葡萄糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鋇、氯化銨、明膠、硫酸鉀、碘酸鈉、鹽酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；余氯：美國哈希公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TMS-TOUCH 型質(zhì)構(gòu)儀：美國FTC 公司；Multiskan FC 酶標(biāo)儀：美國賽默飛世爾科技公司；V-5600（PC）紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司；PHS-25 酸度計：上海雷磁儀器有限公司；ZSZY-88CH 振蕩培養(yǎng)箱：知楚儀器有限公司；HFsafe-1200LC（A2）型超凈臺：力新儀器（上海）有限公司；PEM 電解式臭氧水機(jī)：武漢威蒙環(huán)保科技有限公司；SCIENTZ-10ND 冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 巨大芽孢桿菌發(fā)酵脫硫方法

自保藏的甘油管中取0.5 mL 巨大芽孢桿菌菌液接入5 mL LB 培養(yǎng)基（將1.0 g NaCl、0.5 g 酵母粉、1.0 g蛋白胨加入至100 mL 純水中，混勻后分裝5 mL 至試管中，密封后在115 ℃滅菌30 min）中，在37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h 后，吸取1 mL 的上述菌液至100 mL 的瓊脂片M9 培養(yǎng)基（在100 mL 的純水中加入1.5 g 的瓊脂粉振蕩混勻后，115 ℃滅菌30 min，隨后趁熱在超凈臺中倒入培養(yǎng)皿中，待冷卻凝固后切成約1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm 的薄片。在經(jīng)115 ℃、30 min 滅菌處理的錐形瓶中加入20 mL 的瓊脂片、20 mL 配好的5×M9 基礎(chǔ)鹽溶液、10 mL 200 g/L 葡萄糖溶液和100 μL 微量元素溶液，并用無菌水補(bǔ)足至100 mL）中，并在37 ℃、200 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，獲得種子液。

將洗凈的江蘺置于超凈臺中暴露于紫外條件下進(jìn)行30 min 的滅菌，隨后稱取15 g 濕重的江蘺植株轉(zhuǎn)移至無硫M9 培養(yǎng)基（20 mL 5×M9 基礎(chǔ)鹽溶液、10 mL 200 g/L 葡萄糖溶液和100 μL 的微量元素溶液，加入滅過菌的錐形瓶中并用無菌水補(bǔ)足至100 mL）中，并加入5 mL 的種子液，在37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，每12 h 測1 次OD600nm，待菌體生長至平穩(wěn)期后，分別收集培養(yǎng)基和江蘺植株，將江蘺植株在滅菌鍋中加熱提膠，趁熱用200 目濾布過濾，冷卻凝固后，轉(zhuǎn)移至-20 ℃冰箱8 h，使凝膠所含的水分結(jié)成冰。次日于室內(nèi)向陽處解凍脫水。待不再有水泌出后，將泌出的水分倒掉。用保鮮膜包裹泌水后的瓊脂并扎若干小孔后，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱2～3 h 后放入冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥。以上為接菌且有葡萄糖組。接菌且無葡萄糖組是指無硫M9 培養(yǎng)基中不加入10 mL 200 g/L 葡萄糖溶液，其它操作均與接菌且有葡萄糖組一致。未接菌且有葡萄糖組則是在培養(yǎng)過程中不加入種子液，其它操作均與接菌且有葡萄糖組一致。水組是指培養(yǎng)過程中不加入培養(yǎng)基而用純水代替，其它操作均與接菌且有葡萄糖組一致。

1.3.2 江蘺滅菌方法的優(yōu)化試驗

1.3.2.1 75%乙醇滅菌試驗

江蘺浸泡在75%乙醇45 min 后，轉(zhuǎn)移至潔凈的燒杯中，在超凈臺中紫外線照射30 min 后，稱量濕重為15 g 的江蘺至錐形瓶，后加入至無硫M9 培養(yǎng)基，并接入種子液后，放入37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)箱，24 h 后測定OD600nm。

1.3.2.2 臭氧水滅菌試驗

將江蘺置于2 mg/L 的臭氧水中45 min，其余步驟與1.3.2.1 中一致。其中2 mg/L 的臭氧水由臭氧水機(jī)制得，并采用中性碘化鉀法測定臭氧水濃度[20-21]。

1.3.2.3 次氯酸鈉滅菌試驗

將洗凈的江蘺置于0.025%、0.050%、0.100%、0.200% 和0.400% 有效氯的NaClO 中約25 min，后用純水沖洗3 遍，在超凈臺中紫外線照射30 min 后，再用純水沖洗3 遍，其余步驟與1.3.2.1 中一致。

除氯步驟為將上述第二次用無菌水沖洗后的樣品于220 r/min、37 ℃振蕩48 h，后再接入巨大芽孢桿菌種子液和原無硫M9 培養(yǎng)基中10 mL 200 g/L 葡萄糖溶液。

有效氯的測定使用碘量法，取5 mL 不同濃度梯度的碘酸鉀溶液并用余氯試劑振蕩混勻后，記錄在564 nm處的吸光度并制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測液經(jīng)過上述操作后的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算即得出有效氯濃度。

1.3.3 江蘺添加量的優(yōu)化試驗

將江蘺植株清洗后常溫晾干，獲得干江蘺。分別將0.50、0.75、1.00、1.25 g 干江蘺和100 mL 含有0.100% 有效氯的次氯酸鈉溶液加入錐形瓶中，在37 ℃條件下220 r/min 振蕩45 min。隨后，在超凈臺中將錐形瓶中的液體倒出，保留江蘺，并用純水多次沖洗江蘺至pH 中性。將清洗后的江蘺，加入至無糖無硫M9 培養(yǎng)基（20 mL 5×M9 基礎(chǔ)鹽溶液和100 μL 微量元素溶液，加入經(jīng)115 ℃、30 min 滅菌處理的錐形瓶中并用無菌水補(bǔ)足至100 mL），37 ℃、220 r/min 振蕩除氯48 h 后，在超凈臺中紫外線照射30 min，加入10 mL 的20%葡萄糖溶液和5 mL 種子液，放入37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)4 d，每天測定OD600nm。

1.3.4 培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗

1.3.4.1 添加微量元素濃度的試驗

將1 g 干江蘺和100 mL 含有0.1%有效氯的次氯酸鈉溶液加入錐形瓶中，封口后置于37 ℃、220 r/min搖床，充分浸泡45 min。隨后，在超凈臺中將錐形瓶中的液體倒出，并用純水多次沖洗江蘺至pH 為中性。將清洗后的江蘺，加入至無糖無硫M9 培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)箱除氯48 h 后，在超凈臺中紫外線照射滅菌30 min，加入10 mL 的20% 葡萄糖溶液和5 mL 種子液，放入37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天測定1 次OD600nm，共培養(yǎng)2 d，上述發(fā)酵為添加微量元素組。同時設(shè)置一個不添加微量元素的無糖無硫M9 培養(yǎng)基對照組，其它步驟與添加微量元素組一致，為不添加微量元素組。

1.3.4.2 添加緩沖鹽濃度的試驗

方法與碳氮源組一致，5×M9 基礎(chǔ)鹽中的Na2HPO4和KH2PO4分別設(shè)置成原濃度的0、0.10、0.25、0.50、1.00、1.50 倍，每天測定一次OD600nm，培養(yǎng)2 d。

1.3.4.3 添加葡萄糖濃度的試驗

方法與碳氮源組一致，且葡萄糖濃度設(shè)置成0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和3.0%，培養(yǎng)2 d。

1.3.4.4 添加NH4Cl 濃度的試驗

方法與碳氮源組一致，且5×M9 基礎(chǔ)鹽中NH4Cl濃度設(shè)置成0%、0.10%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.50%，培養(yǎng)2 d。

1.3.5 多次轉(zhuǎn)接的方法

在上述經(jīng)過優(yōu)化的條件發(fā)酵后，隔24 h 吸取200 μL 測OD600nm。OD600nm不再升高時，將江蘺植株轉(zhuǎn)接至新的無硫M9 培養(yǎng)基進(jìn)行再次發(fā)酵。重復(fù)3 次后，將菌液和江蘺用濾布分離，多次沖洗后在錐形瓶中加入100 mL 純水，在100 ℃下進(jìn)行提膠2 h。隨后趁熱用200 目的紗布過濾，獲得瓊脂膠液，在室溫下冷卻后，在-20 ℃冷凍約8 h，次日在室溫下解凍后，用保鮮膜封存，在-80 ℃預(yù)凍3 h 后凍干。

1.3.6 堿法脫硫的方法

將100 g 干江蘺加入1 500 mL 6% 的NaOH 溶液中，并在87 ℃水浴加熱3 h，再經(jīng)過4 次水洗后轉(zhuǎn)移至含有0.65 mL 濃硫酸、0.96 g 草酸的1 500 mL 溶液中酸化0.5 h、水洗后再用0.04% 的NaClO 漂白0.5 h[22]。煮膠、脫水和干燥等過程與1.3.5 中一致。

1.3.7 瓊脂性能測定

1.3.7.1 瓊脂硫酸基含量的測定

將0.1～0.3 g 瓊脂樣品加入50 mL 1 mol/L HCl 后在115 ℃酸解240 min，用0.45 μm 的濾膜過濾后，取5 mL上述酸解液送至青島菲優(yōu)特檢測有限公司檢測，使用HJ84—016《水質(zhì)無機(jī)陰離子（F-、Cl-、NO2-、Br-、NO3-、PO43-、SO32-、SO42-）的測定離子色譜法》進(jìn)行檢測。

脫硫率（Y，%）的計算公式如下。

式中：C1為脫硫前的硫酸基含量，%；C2為脫硫后的硫酸基含量，%。

1.3.7.2 凝膠強(qiáng)度的測定

將瓊脂樣品研磨成粉后，稱取1.5%的瓊脂并加入純水中，把上述樣品放入微波爐中加熱并振蕩至完全溶解，趁熱倒入直徑2 cm、高1.5 cm 的圓柱形容器中，冷卻后轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱靜置約8 h。次日使用質(zhì)構(gòu)儀測得瓊脂擠壓至破裂的最大力。質(zhì)構(gòu)儀的參數(shù)為檢測速度60 mm/min、穿刺深度5 mm。使用直徑6 mm 的圓柱形探針測量樣品。凝膠強(qiáng)度的計算公式如下。

式中：G為凝膠強(qiáng)度，g/cm2；F為瓊脂擠壓至破裂的最大力，N；g 為重力加速度，9.8 N/kg；S為截面積，cm2。

1.3.7.3 瓊脂得率的測定

將處理前江蘺樣品烘干至恒重，稱量干重，記質(zhì)量為G1（g）。稱量上述樣品處理后獲得的瓊脂，記質(zhì)量為G2（g）。得率（D，%）計算公式如下。

1.3.7.4 分子量的測定

瓊脂樣品加熱溶解后使用高效液相色譜法進(jìn)行多糖分子量的測定。使用TSK-Gel GMPWxL（7.5 mm×300 mm）色譜柱；流動相為0.1 mol/L 硫酸鈉，柱溫為35 ℃；流速為0.5 mL/min；檢測器為示差檢測器。根據(jù)已知分子量的葡聚糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-0.453 0x+12.971 1，R2=0.998 0。多糖樣品的分子量由保留時間代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算得出。

1.3.7.5 透明度的測定

將1.5%的瓊脂溶液加熱至完全溶化，趁熱倒入比色皿中，測定液體波長在750 nm 處的透光率即為透明度。

1.3.7.6 溶解溫度、熔化溫度、凝固溫度的測定

1）溶解溫度：將1.5%的瓊脂置于60 ℃水浴鍋中，并緩慢升溫，當(dāng)搖晃后無固體顆粒且溶液均一透明后，記該溫度為溶解溫度。

2）熔化溫度：將1.5%的瓊脂加熱至完全溶解后插入溫度計，待其冷卻形成凝膠后，在膠體表面放置1 顆玻璃珠，并緩慢升溫，當(dāng)玻璃珠下落至底面，記該溫度為熔化溫度。

3）凝固溫度：將1.5%的瓊脂加熱至完全溶解后插入溫度計，并緩慢降溫。當(dāng)試管傾斜90°瓊脂不發(fā)生流動，且溫度計拔出時液面沒有明顯變化時的溫度，記該溫度為凝固溫度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用Origin 軟件進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果與討論

2.1 基于紫外滅菌的江蘺植株直接脫硫方法

本試驗所采用的江蘺植株在吸水膨脹后其直徑在3～7 mm，使得其單位瓊脂的比表面積相對瓊脂平板涂布法大幅提高。該方法的脫硫示意圖及脫硫效果見圖1。

菌體濃度越高，其生長所需要的硫越多，該菌的脫硫效率越強(qiáng)。由圖1B 可知，對江蘺植株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，接菌且有葡萄糖組在24 h 時OD600nm達(dá)到3.7，較原平板法發(fā)酵微生物生長趨勢明顯提升。該培養(yǎng)條件下菌體生長狀態(tài)較好，因此推測江蘺植株直接脫硫法有相對較高的脫硫率。同時水處理的對照組OD600nm未有明顯提升，說明江蘺中所含有的雜質(zhì)對OD600nm影響較小。

由圖1C 可知，植株直接發(fā)酵培養(yǎng)的OD600nm隨著發(fā)酵次數(shù)的增加而降低，表明培養(yǎng)基中硫酸基含量限制了巨大芽孢桿菌的后續(xù)生長，間接說明脫硫有效果。圖1D 顯示，未接菌的組別硫酸基含量為2.75%，接菌1 次、2 次、3 次硫酸基含量分別為1.26%、0.97%、0.59%，隨著轉(zhuǎn)接次數(shù)的增加，凝膠的硫酸基含量下降，其在第3 次接菌后脫硫率達(dá)到78.54%，較平板脫硫法的脫硫率21% 提高了兩倍以上。說明該方法的確有良好的脫硫效果。

然而經(jīng)過處理的瓊脂凝膠強(qiáng)度低于檢測限，無法測出，即瓊脂中硫酸根的降低并未使得凝膠強(qiáng)度升高，說明有其它原因影響了凝膠強(qiáng)度。由圖1B 可知，未接菌且有葡萄糖組的OD600nm變化趨勢與接菌且有葡萄糖組的OD600nm變化趨勢一致，說明即便不接巨大芽孢桿菌，也有微生物能明顯生長，推測未接菌且有葡萄糖組中生長的微生物是因附著于江蘺植株表面而引入發(fā)酵體系的。另一方面，接菌且無葡萄糖組的OD600nm在48 h 后明顯上升，說明有微生物生長，而巨大芽孢桿菌是無法利用瓊脂為唯一碳源生長的細(xì)胞[19]，因此推測附著于江蘺植株而引入的雜菌中有能以瓊脂為碳源生長的微生物，即該微生物可以將瓊脂多糖鏈降解，降低其分子量，從而影響凝膠強(qiáng)度。綜上推測紫外線滅菌無法將江蘺植株表面的微生物全部殺滅，有必要對江蘺植株直接脫硫方法進(jìn)行滅菌方法的優(yōu)化。

2.2 滅菌方法的確定

2.2.1 乙醇或臭氧水滅菌的試驗

75% 乙醇和臭氧水常用于微生物滅菌，且易揮發(fā)容易去除[20-23]。乙醇、臭氧水對江蘺植株的滅菌效果見圖2。

圖2 75%乙醇或臭氧水處理后接巨大芽孢桿菌及未接菌發(fā)酵液的OD600 nmFig.2 OD600 nm of fermentation liquid with/without inoculation of Priestia megaterium after the treatment with 75%ethanol or O3 water

如果75%乙醇或臭氧水處理有良好的滅菌效果，則24 h 的未接菌組OD600nm應(yīng)接近于0。然而，由圖2可知，未接菌組24 h 的OD600nm與接菌組沒有明顯差異。說明在未接巨大芽孢桿菌種子液時，即使經(jīng)過75%乙醇或臭氧水處理，該體系仍然有其他微生物生長，因此上述兩種除雜菌方法與原來的紫外線滅菌法效果接近，不能有效地殺滅江蘺植株上附著的微生物，故不采用75%乙醇或臭氧水滅菌方法。

2.2.2 次氯酸鈉滅菌的試驗

NaClO 是日常生活中常見的消毒劑，在瓊脂的傳統(tǒng)堿法提取工藝中被用于瓊脂漂白，一定范圍內(nèi)NaClO濃度越高脫色效果越顯著[24-25]。不同有效氯濃度的次氯酸鈉溶液對江蘺植株的漂白及滅菌效果見圖3。

圖3 NaClO 對江蘺植株的漂白及滅菌效果Fig.3 Bleaching and sterilization effects of NaClO on the Gracilaria plant

由圖3A 與圖3B 可知，次氯酸鈉對江蘺植株有明顯的漂白作用。同時由圖3C 可知，在0.100%有效氯及以上濃度可觀察到其OD600nm最高值明顯低于0.050% 有效氯及以下的濃度，說明在0.100% 以上有效氯的濃度會有效殺滅江蘺植株上所附著的微生物。但與此同時隨著次氯酸鈉濃度的增高，其pH 值會變高，江蘺植株長時間在堿性過高的環(huán)境，會導(dǎo)致膠體自溶，使得瓊脂最終的得率下降。因此在保證滅菌效果的前提下，應(yīng)當(dāng)盡可能選取低濃度的NaClO?；诖?，滅菌劑次氯酸鈉的濃度確定為0.100%的有效氯。

由圖3C 可知，隨著次氯酸鈉的加入，巨大芽孢桿菌的細(xì)胞生長也由此受到抑制，因此需要對滅菌后的江蘺進(jìn)行余氯去除處理后再進(jìn)行接菌。對次氯酸鈉滅菌方法增加除氯步驟，結(jié)果見圖4。

圖4 NaClO 溶液處理并除氯后接菌及不接菌江蘺植株發(fā)酵3 d 后的OD600 nmFig.4 OD600 nm of fermentation liquid for 3 days with/without inoculation of Priestia megaterium after NaClO treatment and dechlorination

由圖4 可知，接菌組的OD600nm明顯高于未接菌組的OD600nm與水組的OD600nm，由此說明空轉(zhuǎn)除氯步驟的增加，使得脫硫微生物生長良好，該方法可以有效避免除氯過程中雜菌污染。綜上可知，在經(jīng)過0.100%次氯酸鈉處理后，再進(jìn)行48 h 的除氯，最后接入巨大芽孢桿菌種子液的條件下，巨大芽孢桿菌細(xì)胞能夠在該條件下進(jìn)行增殖從而脫硫。

2.3 培養(yǎng)基江蘺添加量優(yōu)化

巨大芽孢桿菌分別在添加不同質(zhì)量江蘺的100 mL 培養(yǎng)基中的生長情況見圖5。

圖5 巨大芽孢桿菌分別在添加不同質(zhì)量江蘺的100 mL 培養(yǎng)基中的生長情況Fig.5 Growth of Priestia megaterium in 100 mL of culture media with different weights of Gracilaria plant

由圖5 可知，巨大芽孢桿菌以1.25 g 和1.00 g 江蘺為唯一硫源時OD600nm的變化情況相似，表明其菌體密度也相似，而添加1.25 g 瓊脂時，單位瓊脂所能夠接觸的微生物更少，因此1.00 g 的瓊脂添加量比1.25 g更合適。同時0.50 g 的OD600nm在3 d 達(dá)到最大值，最高OD600nm約為1.00 g 時的1/2，單位瓊脂的微生物濃度是相同的，而在處理時1.00 g 能在單位培養(yǎng)基中處理更多瓊脂，1.00 g 培養(yǎng)基利用率更高。綜上選擇1.00 g 為最適的江蘺添加量。

2.4 培養(yǎng)基成分濃度優(yōu)化

培養(yǎng)基成分對巨大芽孢桿菌生長的影響見圖6。

圖6 培養(yǎng)基成分濃度對巨大芽孢桿菌在江蘺培養(yǎng)基中生長情況的影響Fig.6 Effect of component concentration on the growth of Priestia megaterium in culture medium with Gracilaria plant

由圖6A 可知，加微量元素或不加微量元素對于巨大芽孢桿菌在江蘺植株直接脫硫體系中生長情況影響不大。推測是由于江蘺植株中本身就富含多種礦物質(zhì)，為微生物提供了大量生長所需的微量元素。因此對于后續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)中均不再額外加入微量元素。在圖6B 中可以觀察到緩沖鹽濃度在其原濃度的0.50 倍和1.00 倍條件下，巨大芽孢桿菌長勢均明顯比其它濃度更好，其中1.00 倍的OD600nm在48 h 時較0.50 倍更高，故選1.00 倍緩沖液濃度。由圖6C 和圖6D 可知，葡萄糖濃度和NH4Cl 濃度分別在2.00%和0.75%時OD600nm最高，因此選取以上濃度為培養(yǎng)基最適宜的發(fā)酵濃度。

綜上，經(jīng)過對培養(yǎng)基的成分進(jìn)行類型的篩選和濃度的優(yōu)化，得出在植株直接脫硫體系中原濃度的緩沖液、2.0% 葡萄糖和0.75% 的NH4Cl，且不額外加微量元素是最適宜的培養(yǎng)基條件。

2.5 江蘺植株直接脫硫的效果

在最適條件下發(fā)酵前后瓊脂的得率、凝膠強(qiáng)度和硫酸基含量如表1所示，瓊脂的分子量、凝固溫度、溶解溫度、熔化溫度、透明度變化如圖7所示。

表1 江蘺植株直接脫硫后提取瓊脂的得率和性能結(jié)果Table 1 Yield and performance of agar extracted from Gracilaria plant after direct desulfation

圖7 江蘺植株微生物法瓊脂脫硫的效果Fig.7 Effect of agar desulfation of Gracilaria plant by microbial method

由表1 可知，江蘺植株直接脫硫工藝的得率為（24.381±1.746）%，工業(yè)常用的堿法提膠的得率在20%～30%，因此，該得率處于當(dāng)前工業(yè)瓊脂提取的中間水平。微生物處理后植株直接脫硫法的脫硫率達(dá)到37.985%，凝膠強(qiáng)度從低于檢測限（≤100 g/cm2）提升至（200.263±7.121）g/cm2，而堿法脫硫所得到的樣品凝膠強(qiáng)度為（749.602±16.113）g/cm2，微生物法脫硫后，獲得瓊脂的凝膠強(qiáng)度與現(xiàn)行產(chǎn)業(yè)化、成熟的工藝仍然存在一定差距，所獲得的產(chǎn)品品質(zhì)仍然有待進(jìn)一步提升。從表1 中37.985%的脫硫率看出江蘺植株瓊脂的硫酸基含量有效降低，同時凝膠強(qiáng)度有質(zhì)的提升；充分說明了該方法對江蘺植株的瓊脂進(jìn)行微生物脫硫有成效且有助于瓊脂凝膠強(qiáng)度的提升。

由圖7A 和圖7B 可知，經(jīng)脫硫后，瓊脂分子量由469 758 Da 變化至442 399 Da，有所下降但幅度并不大。同時脫硫前后的熔化、溶解、凝固溫度和透明度與水處理對照無明顯差別（圖7C），說明本文中建立的脫硫工藝在降低硫含量、提高凝膠強(qiáng)度的同時，對瓊脂各方面其它性質(zhì)并無不利影響。綜上所述，微生物法江蘺植株直接脫硫在提升瓊脂凝膠強(qiáng)度的同時，并不會對瓊脂熔化、溶解、凝固溫度和透明度等其它重要指標(biāo)有明顯影響。

3 結(jié)論

本研究建立了以巨大芽孢桿菌為脫硫主體的微生物江蘺植株直接脫硫工藝。紫外滅菌微生物江蘺植株直接脫硫法脫硫率能達(dá)到78.54%；但存在染菌、凝膠強(qiáng)度差的弊端?；诖吮狙芯績?yōu)化了滅菌方法，最終建立了有效氯濃度為0.100% 的次氯酸鈉滅菌工藝；同時優(yōu)化了微生物江蘺植株直接脫硫法最佳發(fā)酵條件，確定了在每100 mL 的微生物江蘺植株直接脫硫發(fā)酵體系中加入1.00 g 干重的江蘺植株，并確定在培養(yǎng)基中添加2.0%葡萄糖、6.72 g/L Na2HPO4、3.00 g/L KH2PO4、0.75%NH4Cl 且不需要額外加微量元素。江蘺植株通過優(yōu)化的直接脫硫處理后，樣品的脫硫率達(dá)到37.985%，凝膠強(qiáng)度從低于檢測限提升至（200.263±7.121）g/cm2，即通過微生物法脫硫提高了瓊脂的凝膠強(qiáng)度，且得率與堿處理得率相近，熔化溫度、溶解溫度、凝固溫度、透明度未因微生物法處理而發(fā)生顯著改變。