雙酶協(xié)同增加青稞慢消化淀粉含量的工藝優(yōu)化

李巖，孫康娜，宋曉凡，陳富章，金蘇宇，韓麗娟，葉英，院珍珍，2*

（1.青海大學農(nóng)牧學院，青海西寧 810016；2.青海大學省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，青海西寧 810016）

青稞（highland barley）又被稱為裸大麥、米大麥或淮麥，在我國西藏、青海、云南及四川的甘孜州等高海拔地區(qū)大面積種植[1]，具有高蛋白、高纖維、高維生素、低脂肪、低糖的“三高兩低”成分結(jié)構(gòu)特性[2]。研究表明，與其他谷物相比，青稞的血糖生成指數(shù)較低[3]，其所具有降血糖的功效可能是通過誘導氨基酸、生物胺以及有機酸的分布改變，從而改善胰島素敏感性[4-5]，臨床研究也驗證了這一發(fā)現(xiàn)，畢銘鑫等[6]開展的為期3個月的臨床研究也認為青稞麥片有顯著改善空腹血糖受損患者的糖脂代謝的效果。

淀粉是人們膳食中所需能量的最多來源，對于維持人體的正常生理和活動具有重要的作用[7]。Englyst等[8]將淀粉按照其在人體中的消化狀態(tài)分類，將淀粉劃分為快消化淀粉（rapidly digestible starch，RDS）、慢消化淀粉（slowly digestible starch，SDS）和抗性淀粉（resistant starch，RS）。研究表明，SDS 可以持續(xù)提供能量，并有助于控制血糖和胰島素水平，不會使血糖短時間出現(xiàn)大幅度起伏，因此，增加慢消化淀粉的含量，有助于心血管疾病、糖尿病及肥胖病人病情的調(diào)控[9-10]。

β-淀粉酶又稱為麥芽糖苷酶，是一種能夠破壞淀粉末端的α-1，4 糖苷鍵的外切酶，淀粉經(jīng)β-淀粉酶處理后，α-1，6 糖苷鍵的數(shù)量相對增加，短鏈淀粉增多，同時提高了分支密度，使得淀粉中SDS 含量升高，從而起到延緩葡萄糖釋放速率的作用[11]。α-葡萄糖苷酶，又被稱作α-D-葡萄糖苷水解酶，它可以從低聚糖類底物的非還原末端切開α-1，4 糖苷鍵，或者將葡萄糖殘基（游離出）轉(zhuǎn)移到另一糖類底物形成α-1，6 糖苷鍵，生成低聚異麥芽糖等[12]。高群玉等[13]通過試驗發(fā)現(xiàn)處理普通玉米淀粉采用β-淀粉酶協(xié)同葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶，使慢消化淀粉的含量可以得到有效提高，淀粉的消化性能也得到了一定的改善。肖瑀等[14]通過β-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶協(xié)同處理普通紅薯淀粉，結(jié)果表明，復合酶處理后紅薯淀粉短鏈的比例有很明顯的增多，平均鏈長也變得很低，分支密度有了明顯增加。Shi 等[15]β-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶協(xié)同處理豌豆淀粉，結(jié)果顯示慢消化淀粉提高了10%左右，處理后的淀粉表現(xiàn)出較小數(shù)量的長支鏈，較大數(shù)量的短支鏈和更高的分支分數(shù)，分支率大約提高了10%。本試驗主要采用酶法，通過β-淀粉酶協(xié)同α-葡萄糖苷酶來研究青稞快消化淀粉，以期為后續(xù)應用開發(fā)低糖青稞食品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-葡萄糖苷酶（700 000 U/mL）：上海吉至生化科技有限公司；β-淀粉酶（700 000 U/mL）：滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司；糖化酶（100 000 U/mL）：江蘇銳陽生物科技有限公司；豬胰α-淀粉酶（455 000 U/g）：合肥博美生物科技有限責任公司；對硝基苯-α-D-葡萄糖苷（4-nitrophenyl β-D-glucopyranoside，PNPG）：上海麥克林生化科技有限公司；萌芽黑青稞粉：青海漢和生物科技有限公司；淀粉試劑盒（50T/48S）、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）：Solarbio 生物科技有限公司；氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉（分析純）：天津市河東區(qū)紅巖試劑廠。

1.2 儀器與設備

恒溫振蕩水浴鍋（HH-6）：常州國華電器有限公司；紫外可見分光光度計（UV-1780）：日本島津公司；大容量冷凍離心機（LR-10M）：湖南赫希儀器裝備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶改性青稞粉的制備

用蒸餾水將一定量的青稞粉溶解攪拌，之后加入5 mL 的乙酸鈉緩沖溶液（1 mol/L，pH5.0）攪拌均勻，加入α-葡萄糖苷酶及β-淀粉酶溶液各857 μL[16-18]，蓋上塞子并立即放入50 ℃的恒溫振蕩水浴鍋（150 r/min）中反應4 h。反應結(jié)束后將盛有樣品的錐形瓶放入90 ℃的恒溫水浴鍋中滅酶10 min，每隔2 min 搖1 次，防止滅酶不均勻。將錐形瓶放入冷水中冷卻至常溫，將錐形瓶中樣品裝入離心管中，設置離心機轉(zhuǎn)速為5 000 r/min 離心10 min 后棄上清液留沉淀，用蒸餾水洗滌后再次離心，將沉淀物放在平皿里，于60 ℃烘箱烘干。烘干后樣品在粉碎機中粉碎，得到酶改性青稞粉，密封保存。

1.3.2 總淀粉含量的測定

采用淀粉含量檢測試劑盒法測定酶改性青稞粉總淀粉含量。通過試驗得到標準曲線方程為Y=12.192x+0.002，R2=0.999 2?？偟矸酆浚═，mg/g）計算公式如下。

式中：x為標準曲線的濃度，mg/mL；n為所需的稀釋倍數(shù)，1 000；V為試驗提取的總體積，1.7 mL；W為樣品的質(zhì)量，0.1 g。

1.3.3 體外模擬消化法測定青稞粉中慢消化淀粉含量參照繆銘等[19]的方法，并作修改。利用體外模擬消化法測定消化性能：準確稱量0.2 g 淀粉的樣品于測試管中，加入3 個潔凈玻璃珠，15 mL 醋酸鈉緩沖液（0.2 mol/L，pH5.2），加入現(xiàn)配的混合酶（豬胰α-淀粉酶和糖化酶）溶液10 mL，搖勻后立即置于37 ℃恒溫振蕩器水浴振蕩，于20、120 min 分別取2 mL 水解液，沸水浴滅酶，在4 500 r/min 的條件下離心15 min，吸取上清液100 μL 加入900 μL 水和提前配制好的2 mL二硝基水楊酸顯色劑，沸水浴5 min 進行顯色后，進行冷卻，冷卻后加入12 mL 去離子水后用紫外分光光度計于540 nm 處測定其葡萄糖含量。此步驟設置空白對照組。按下面公式計算慢消化淀粉含量（S，%）。

式中：T為總淀粉含量，mg/g；G20為酶解反應20 min 后的葡萄糖含量，mg/g；G120為酶解反應120 min后葡萄糖的含量，mg/g；G為葡萄糖當量，mg/g；At為吸光值；D為稀釋倍數(shù)，1 500；Wt為青稞粉質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗

分別改變青稞粉濃度（6%、8%、10%、12%、14%）、α-葡萄糖苷酶添加量（140、145、150、155、160 U/g 青稞粉）、β-淀粉酶添加量（140、145、150、155、160 U/g青稞粉）、酶解時間（6、7、8、9、10 h）和酶解溫度（48、49、50、51、52 ℃），考察各因素對青稞粉酶改性效果的影響。

1.3.5 響應面試驗

以單因素試驗結(jié)果為基礎，以酶解青稞粉濃度、酶解溫度和α-葡萄糖苷酶添加量為考察因素，以酶解后的慢消化淀粉含量為響應值，采用Design-Expert 8.0.6進行響應面設計。因素水平見表1。

表1 響應面分析因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.6 酶解青稞粉體外降血糖活性測定

1.3.6.1 α-淀粉酶抑制率測定

α-淀粉酶抑制率測定參照梁宗瑤等[20]的方法并稍做修改。將樣品液稀釋至0.312 5 mg/mL 并吸取150 μL 于試管中，再向試管中加入0.5 U/mL 的α-淀粉酶液150 μL，將放有樣品的試管置于37 ℃恒溫箱中反應10 min，結(jié)束后在試管中加入1% 的可溶性淀粉250 μL，再將試管放入37 ℃恒溫箱反應10 min 后加入顯色劑DNS 500 μL，置于沸水浴反應5 min，流水冷卻后在540 nm 處測吸光值。反應體系中采用0.05 mol/L PBS（pH6.8）作為溶液及待測樣品的空白對照，按下面公式計算α-淀粉酶抑制率（m，%）。

式中：a為待測樣品組的測定吸光值；b為空白組的測定吸光值；c 為對照組的測定吸光值。

1.3.6.2 α-葡萄糖苷酶抑制率測定

α-葡萄糖苷酶抑制率測定參照賴曉樺等[21]的方法并稍做修改。在試管中加入一定量的酶改性青稞粉，分別加入一定量的PBS（pH6.8，0.05 mol/L）和PNPG（20 mol/L）溶液，將其混勻后置于37 ℃恒溫箱中反應10 min 后加入0.2 U/mL 的α-葡萄糖苷酶溶液，繼續(xù)在恒溫箱中反應20 min 后加入反應終止液0.1 mol/L Na2CO3。反應終止后于405 nm 處測吸光值。反應體系中采用0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH6.8）作為溶液及待測樣品的空白對照。α-葡萄糖苷酶抑制率（p，%）按下式計算。

式中：a為待測樣品組的測定吸光值；b為空白組的測定吸光值；c為對照組的測定吸光值；d為PBS 的測定吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗重復3 次，采用Excel 軟件和Design-Expert 8.0.6 對試驗數(shù)據(jù)進行分析處理及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 青稞粉濃度對慢消化淀粉含量的影響

青稞粉濃度對慢消化淀粉含量的影響如圖1所示。

圖1 青稞粉濃度對慢消化淀粉含量的影響Fig.1 Effect of concentration of highland barley powder on slowly-digestible starch

由圖1 可知，SDS 含量隨著青稞粉濃度的增加而增加，當青稞粉濃度為10% 時，慢消化淀粉含量達到最大值24.43%，在青稞粉濃度大于10%后，可能是因為溶液過于黏稠使酶和底物接觸不方便，導致慢消化淀粉含量減小。

2.1.2 α-葡萄糖苷酶添加量對慢消化淀粉含量的影響

α-葡萄糖苷酶添加量對慢消化淀粉含量的影響如圖2所示。

圖2 α-葡萄糖苷酶添加量對慢消化淀粉含量的影響Fig.2 Effect of α-glucosidase addition on slowly-digestible starch

由圖2 可知，SDS 含量隨α-葡萄糖苷酶添加量的增加，先增大后減小，當α-葡萄糖苷酶添加量為150 U/g 青稞粉時，慢消化淀粉含量達到最高值33.65%，當α-葡萄糖苷酶添加量大于150 U/g 青稞粉時，可能是因為青稞粉酶解所需要的酶已經(jīng)飽和，底物中沒有過多的非還原性末端被切開，從而使得葡萄糖含量減少，形成的非發(fā)酵性糖變少，所以慢消化淀粉含量下降。

2.1.3 β-淀粉酶添加量對慢消化淀粉含量的影響

β-淀粉酶添加量對慢消化淀粉含量的影響如圖3所示。

圖3 β-淀粉酶添加量對慢消化淀粉含量的影響Fig.3 Effect of β-amylase addition on slowly-digestible starch

從圖3 可知，β-淀粉酶添加量為150 U/g 青稞粉時，慢消化淀粉含量達到最大值20.78%，當β-淀粉酶添加量小于150 U/g 青稞粉時，可能是因為β-淀粉酶增加，底物青稞粉斷開α-1，4 糖苷鍵得到的麥芽糖增加，從而進行轉(zhuǎn)化得到慢消化淀粉，所以慢消化淀粉含量呈上升趨勢，而當β-淀粉酶添加量大于150 U/g 青稞粉時，青稞粉酶解所需要的β-淀粉酶已經(jīng)飽和，慢消化淀粉含量下降。

2.1.4 酶解時間對慢消化淀粉含量的影響

酶解時間對慢消化淀粉含量的影響如圖4所示。

圖4 酶解時間對慢消化淀粉含量的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on slowly-digestible starch

由圖4 可知，在其他酶改性條件一定的情況下，當酶解時間為8 h 時，慢消化淀粉含量達到最大值為22.84%，當酶解時間小于8 h，慢消化淀粉含量會隨著酶解時間的延長而變大，大于8 h 后由于酶解過程逐漸結(jié)束，慢消化淀粉含量趨于平穩(wěn)。

2.1.5 酶解溫度對慢消化淀粉含量的影響

酶解溫度對慢消化淀粉含量的影響如圖5所示。

圖5 酶解溫度對慢消化淀粉含量的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on slowlydigestible starch

由圖5 可知，隨著酶解溫度的上升，隨慢消化淀粉含量逐漸增加，當酶解溫度達到50 ℃時，慢消化淀粉含量達到最高值28.34%，隨后可能是因為酶解溫度過高影響酶的活性，所以慢消化淀粉含量下降。

2.2 響應面優(yōu)化及分析

2.2.1 模型的建立與顯著性檢驗

基于單因素試驗進行響應面優(yōu)化分析，以酶解溫度（A）、青稞粉濃度（B）和α-葡萄糖苷酶添加量（C）為響應面的影響因素，以慢消化淀粉含量為響應值，試驗結(jié)果見表2。未將β-淀粉酶濃度作為考察因素，是因為其與α-葡萄糖苷酶具有相同的酶活力并且在單因素試驗中表明，當酶添加量均為150 U/g 青稞粉時，慢消化淀粉含量最高，因此為了節(jié)約成本及時間，選擇了其中一種酶作為考察因素。

表2 響應面分析方案及試驗結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology

對表2 試驗數(shù)據(jù)利用Design-Expert 軟件進行多元回歸擬合?？偨Y(jié)出慢消化淀粉含量與酶解溫度（A）、青稞粉濃度（B）和α-葡萄糖苷酶添加量（C）的二次多項回歸模型為Y=32.42-1.13A+0.44B+0.68C-0.23AB+0.36AC+0.68BC-3.47A2-1.77B2-3.81C2。

對上述的回歸模型進行方差分析，結(jié)果如表3所示。

表3 慢消化淀粉含量方差分析Table 3 Variance analysis of slowly-digestible starch

從表3 可知，該模型P＜0.000 1，且F值為30.29，結(jié)果表明擬合模型具有高度的顯著性。失擬項體現(xiàn)出了模型中的數(shù)據(jù)變異，失擬項的F值為1.23，P值為0.407 0，說明失擬項不顯著，無失擬因素在該回歸方程中存在，回歸模型與實測值能得到很好的擬合。從結(jié)果可以得到3 個因素對慢消化淀粉含量的影響因素大小為酶解溫度＞α-葡萄糖苷酶添加量＞青稞粉濃度。A、A2、C2對青稞慢消化淀粉含量的影響極顯著，C、B2對青稞慢消化淀粉含量的影響顯著，AB、AC、BC對慢消化淀粉含量的影響不顯著，因此試驗因素對響應值Y的影響不是簡單的線形關系，二次項對響應值也有很大影響。以上均說明該模型可用于增加青稞慢消化淀粉含量的工藝優(yōu)化。

2.2.2 響應面優(yōu)化

等高線越圓表示兩因素交互作用越不顯著，反之兩因素交互作用越顯著；響應面圖中，曲線越彎曲，坡度越大，則表明因素對結(jié)果影響較大。各要素之間的交互作用的響應面和等高線圖如圖6所示。

由圖6 可知，青稞粉濃度和α-葡萄糖苷酶添加量的等高線呈橢圓，響應面曲面坡度最大，說明青稞粉濃度和α-葡萄糖苷酶添加量的交互作用最顯著，與方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 最佳提取工藝條件的驗證

響應面試驗結(jié)果得出雙酶酶解增加慢消化淀粉的理論條件為青稞粉濃度9.8%、α-葡萄糖苷酶添加量為150.5 U/g 青稞粉、酶解溫度49.6 ℃，預測在該條件下青稞慢消化淀粉含量為32.58%?？紤]到實際操作的局限性，將試驗條件調(diào)整為青稞粉濃度為10%，α-葡萄糖苷酶添加量150 U/g 青稞粉，酶解溫度為50 ℃，重復3 次試驗進行驗證試驗，所得平均SDS 含量為33.62%，該結(jié)果與理論值接近，表明最優(yōu)工藝參數(shù)準確可靠，該模型可以較好地預測青稞慢消化淀粉含量。

2.3 降糖活性分析

在人體內(nèi)，淀粉等碳水化合物先被α-淀粉酶水解為雙糖，再被α-葡萄糖苷酶水解成單糖，之后才會被小腸吸收，因此α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性如果得到了抑制，就可以達到餐后血糖降低的目的。青稞原粉及酶改性青稞粉的降糖活性如表4所示。

表4 降糖活性分析Table 4 Analysis of hypoglycemic activity

由表4 可知，與原粉相比酶改性青稞粉的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率分別增加了62.97% 和52.46%，可能是因為在酶解過程中破壞了青稞粉的結(jié)構(gòu)，使其與消化酶的接觸減少，而且在試驗過程中進行了水洗離心棄上清液這一步驟，使部分水溶性的麥芽糖、葡萄糖等隨上清液被移除，因此α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率增加。

3 結(jié)論

基于雙酶協(xié)同技術(shù)增加青稞慢消化淀粉含量，在單因素試驗結(jié)果的基礎上采用響應面優(yōu)化設計，結(jié)果表明最佳酶解方案為青稞粉濃度10%、酶解溫度50 ℃、α-葡萄糖苷酶添加量150 U/g 青稞粉。經(jīng)驗證后酶改性青稞粉中SDS 含量為33.62%，分析得到理論預測值為32.58%，相對誤差為1.04%，與驗證試驗結(jié)果相符。在體外降糖活性方面，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率與原粉相比分別增加了62.97% 和52.46%。本試驗研究結(jié)果可為青稞的深度開發(fā)利用及青稞低血糖生成指數(shù)食品的研發(fā)提供參考。