吊干杏杏仁蛋白功能特性和結(jié)構(gòu)特性

李舒婷，齊薇燕，白鵬麗，閆興，周志強(qiáng)，陸健康*，艾明艷

（1.塔里木大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300；3.塔里木大學(xué)分析測(cè)試中心，新疆阿拉爾 843300；4.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北武漢 430207）

吊干杏又稱樹上干杏，屬薔薇科（Rosaceae）李亞科（Prunoideae）杏屬（Prunus）植物，因其熟后不落，在樹上風(fēng)干而得名。吊干杏杏肉甘甜細(xì)膩，富含抗氧化物；杏仁風(fēng)味獨(dú)特，富含蛋白質(zhì)、糖、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)[1]，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。含有人體必需的8 種氨基酸，其配比接近1973年修正聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）/世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）標(biāo)準(zhǔn)必需氨基酸模式，此外，甜杏仁中富含的微量元素硒高達(dá)27.6 μg/100 g[2]，對(duì)防癌抗癌有良好的醫(yī)療輔助作用，是優(yōu)良的藥食兼用植物蛋白源。

當(dāng)前，國內(nèi)外對(duì)杏的研究多集中于杏仁的藥用價(jià)值、精深加工以及產(chǎn)品的開發(fā)等，如杏仁蛋白的有效血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽的鑒定[3]、杏仁蛋白功能和結(jié)構(gòu)特性與pH 值關(guān)系[4]、杏仁豆腐的研發(fā)[5]以及生物活性等。目前，植物組分蛋白方面的研究較為廣泛，例如，韓海濤等[6]發(fā)現(xiàn)核桃清蛋白對(duì)DPPH 自由基清除能力最高，清除率可達(dá)97.15%，且具有較高的體外消化率；封小龍[7]研究花生球蛋白的制備工藝及谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（glutamine transaminase，TG）改性對(duì)花生球蛋白結(jié)構(gòu)特性的影響。李述剛[8]對(duì)SC-1 扁桃仁2S-清蛋白的純化、氨基酸組成和結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行了分析。然而，目前關(guān)于吊干杏杏仁分離蛋白及組分蛋白的營養(yǎng)價(jià)值、功能和結(jié)構(gòu)特性的研究較少，極大制約了吊干杏杏仁蛋白產(chǎn)品的開發(fā)及生產(chǎn)加工過程中品質(zhì)的有效控制。為滿足食品工業(yè)中特定的應(yīng)用條件，對(duì)吊干杏杏仁組分蛋白的研究十分必要。

本研究以新疆阿克蘇地區(qū)吊干杏為原料，采用Osborne 分級(jí)分離法和傳統(tǒng)堿溶酸沉法分別提取清蛋白、球蛋白和分離蛋白，研究這3 種蛋白的氨基酸組成以及功能和結(jié)構(gòu)特性，揭示3 種蛋白的異同點(diǎn)，以期為提高吊干杏杏仁的綜合利用和組分蛋白的精深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

吊干杏：采自新疆阿克蘇地區(qū)，取杏仁，去皮后于0～4 ℃下貯藏備用。石油醚、氯化鈉、氫氧化鈉、氯化鉀：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；硼酸：天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；甲基紅、甘氨酸：上海山浦化工有限公司；碳酸鈉、甲基橙、溴甲酚綠、溴酚藍(lán)：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；磷酸氫二鈉：洛陽市化學(xué)試劑廠；磷酸二氫鈉：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）：天津博迪化工股份有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍干燥機(jī)（FD-1D-80）：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；酸度計(jì)（pHS-3C 型）：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；電子天平（JA5003）、紫外可見分光光度計(jì)（752）：上海箐海儀器有限公司；半自動(dòng)凱氏定氮儀（K1301）：北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司；超聲波清洗機(jī)（SB-3200DTDN）：寧波新芝生物科技股份有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HHS-S4）：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；高速冷凍離心機(jī)（GL-22LM）：湖南星科科學(xué)儀器有限公司；高速臺(tái)式離心機(jī)（E20K）：長沙鑫奧儀器儀表有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀（Frontier）：美國PE 公司；L-8900 全自動(dòng)氨基酸分析儀：日本日立公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

1.3.1.1 脫脂粉的制備

采用李述剛[8]的方法，并稍作改動(dòng)。吊干杏核去殼，浸泡20 min 手工去內(nèi)皮，冷凍干燥后，選取顆粒飽滿、色澤均勻的吊干杏杏仁在粉碎機(jī)中粉碎5 s，重復(fù)3 次。將粉碎后的杏仁粉過18 目篩，以石油醚為有機(jī)溶劑，采用索氏提取法脫脂24 h，通風(fēng)干燥后，再次粉碎過60 目篩，繼續(xù)脫脂12 h，在通風(fēng)處放置約24 h，待石油醚完全揮發(fā)后，過60 目篩得吊干杏杏仁脫脂粉，放置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 分離蛋白和組分蛋白的制備

1）組分蛋白的制備

清蛋白和球蛋白的制備[9]：準(zhǔn)確稱取吊干杏杏仁脫脂粉45 g，以料液比1∶10（g/mL）溶于蒸餾水，用2 mol/L NaOH 溶液調(diào)pH 值至7.0，在室溫下磁力攪拌1 h，在4 ℃、8 000 r/min 條件下離心10 min 取上清液，抽濾后，透析72 h；除去上清液后在所得沉淀中加入2% NaCl 溶液，在室溫條件下磁力攪拌1 h，相同條件下離心后，取上清液抽濾后，進(jìn)行透析72 h。透析結(jié)束后將樣品冷凍干燥分別得到清蛋白和球蛋白。

2）分離蛋白的制備

分離蛋白的制備[7]：稱取脫脂粉45 g，以料液比1∶10（g/mL）溶于蒸餾水中，用2 mol/L NaOH 溶液調(diào)pH值至9.0，室溫下磁力攪拌1 h，在4 ℃、6 000 r/min 離心15 min 后取上清液，復(fù)提3 次后合并上清液，用2 mol/L HCl 溶液調(diào)節(jié)pH 值至4.5。靜置后取底層渾濁蛋白，在4 ℃、6 000 r/min 條件下離心15 min，取出蛋白沉淀，使其分散于少量蒸餾水中，用2 mol/L NaOH 溶液調(diào)pH 值至7.0，真空冷凍干燥后得到分離蛋白，置于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蛋白含量的測(cè)定

參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》，用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，蛋白質(zhì)換算系數(shù)F 為5.18。

1.3.3 蛋白功能特性的研究

1.3.3.1 溶解性的測(cè)定

參照Horax 等[10]的方法并適當(dāng)修改。稱取0.5 g杏仁分離蛋白，用1 mol/L NaOH 溶液和1 mol/L HCl溶液將磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L）的pH 值調(diào)為7，溶解杏仁分離蛋白，在25 ℃磁力攪拌40 min 后，在4 ℃條件下3 000 r/min 離心20 min，過濾并稀釋上清液，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，根據(jù)下列公式計(jì)算蛋白的溶解性。

式中：X為溶解性，%；C1為上清液中總蛋白含量，mg/mL；C2為樣品中總蛋白含量，mg/mL。

1.3.3.2 持油性的測(cè)定

參考彭倩[11]的方法并適當(dāng)修改。稱取0.2 g 樣品，放入干燥的10 mL 離心管中，加入5 mL 食用油，充分振蕩混勻后，置于40 ℃水浴中保溫30 min，在4 500 r/min條件下離心20 min。去除離心管中未吸附的大豆油，稱重。按照如下公式計(jì)算持油性。

式中：X為持油性，g/g；m1為空離心管質(zhì)量，g；m2為離心管、樣品及吸附油的總質(zhì)量，g；m0為蛋白樣品的質(zhì)量，g。

1.3.3.3 不同pH 值下起泡性及泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定

參考Thaiphanit 等[12]的方法測(cè)定。將蛋白樣品充分分散于磷酸鹽緩沖液（pH 值為3、5、7、9，0.01 mol/L）中，在25 ℃攪拌40 min 后，在4 ℃、6 000 r/min 條件下離心15 min，取上清液，用磷酸鹽緩沖液稀釋，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，用磷酸鹽緩沖液稀釋，使得上清液中蛋白質(zhì)濃度達(dá)到1 mg/mL。取1 mg/mL 蛋白溶液10 mL 置于50 mL 塑料量筒中，以17 600 r/min 均質(zhì)2 min，將均質(zhì)后的泡沫面高度記為V0，靜置60 min后再次記錄泡沫面高度，記為V60，依次類推靜置到90 min。起泡性公式如下。

式中：Y為起泡性，%；V0為均質(zhì)后的泡沫體積，mL；V60為靜置60 min 后泡沫體積，mL。泡沫穩(wěn)定性公式如下。

式中：P為泡沫穩(wěn)定性，%；V0為均質(zhì)后的泡沫體積，mL；V60為靜置60 min 后泡沫體積，mL。

1.3.4 蛋白結(jié)構(gòu)特性的研究

1.3.4.1 氨基酸組成分析

氨基酸含量測(cè)定參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》，利用全自動(dòng)氨基酸分析儀對(duì)吊干杏杏仁中3 種蛋白進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4.2 表面疏水性的測(cè)定

參考代曉凝等[13]的方法并稍作修改。充分分散蛋白樣品于磷酸鹽緩沖液（pH7.0，0.01 mol/L）中，在25 ℃磁力攪拌40 min 后，4 ℃條件下6 000 r/min 離心15 min，取上清液，用磷酸鹽緩沖液稀釋后，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，用磷酸鹽緩沖液稀釋上清液，使得蛋白質(zhì)濃度達(dá)到5 mg/mL。取5 mg/mL 蛋白待測(cè)液1 mL 和1 mg/mL 溴酚藍(lán)200 μL 加入5 mL 離心管中，室溫下渦旋振蕩30 s，混合均勻，以無蛋白樣品的磷酸鹽緩沖溶液（pH7.0，0.01 mol/L）為空白對(duì)照。在4 ℃、6 000 r/min 條件下，離心15 min，取上清溶液稀釋10 倍，于595 nm 波長下測(cè)得吸光度。按如下公式計(jì)算表面疏水性。

式中：Y為表面疏水性；A0為空白對(duì)照的吸光度；A1為樣品上清溶液稀釋10 倍后的吸光度。

1.3.4.3 巰基和二硫鍵含量的測(cè)定

參照齊寶坤等[14]的方法測(cè)定蛋白巰基含量，并作適當(dāng)修改。

游離巰基的測(cè)定：將蛋白粉末溶于磷酸鹽緩沖液（pH7.0，0.01 mol/L）中，使蛋白溶液濃度為5 mg/mL。取2 mL 蛋白溶液，加入5 mL Tris-甘氨酸緩沖溶液（0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L 甘氨酸，4 mmol/L 乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），混勻后調(diào)pH8.0）中，再加入0.1 mL 濃度為4 mg/mL 5，5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）[5，5′-dithio bis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB]的Ellman 試劑。在渦旋振蕩混勻后，于25 ℃條件下水浴20 min，用分光光度計(jì)測(cè)定412 nm 波長下的吸光度，以不加Ellman 試劑的溶液作為對(duì)照，每個(gè)樣品做3 組平行取均值。

總巰基的測(cè)定：將上述游離巰基的測(cè)定中加入5 mL Tris-甘氨酸緩沖溶液換為5 mL Tris-甘氨酸-8 mol/L 尿素-0.5%SDS 緩沖液，其他步驟如上文所述。巰基含量和二硫鍵含量計(jì)算公式如下。

式中：X為巰基含量，μmol/g；Y為二硫鍵含量，μmol/g；P為總巰基含量，μmol/g；Q為游離巰基含量，μmol/g；A412為加Ellman 試劑時(shí)樣品的吸光度與不加Ellman 試劑時(shí)樣品的吸光度的差值；D為樣品稀釋系數(shù)；73.53=106/（1.36×104），其中1.36×104為Ellman 試劑的摩爾消光系數(shù)，L/（mol·cm）；C為蛋白樣品溶液的濃度，mg/mL。

1.3.4.4 傅里葉變換紅外吸收光譜測(cè)定

參考Yan 等[15]的方法并作適當(dāng)調(diào)整。取干燥的蛋白樣品和溴化鉀，按1∶100 質(zhì)量比混合，研磨均勻并壓片，以純溴化鉀為空白對(duì)照，使用紅外光譜儀進(jìn)行掃描。掃描范圍為4 000～400 cm-1，以4 cm-1的分辨率共掃描32 次。通過紅外光譜儀掃描可得到紅外光譜圖譜，蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是對(duì)蛋白質(zhì)特征吸收峰波數(shù)為1 700～1 600 cm-1的紅外光譜譜圖進(jìn)行基線校正、去卷積、二階求導(dǎo)及曲線擬合處理，根據(jù)蛋白中各二級(jí)結(jié)構(gòu)的波段位置和對(duì)應(yīng)特征吸收峰的面積大小，可以反映蛋白質(zhì)分子中各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的變化規(guī)律。

1.3.4.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定

參照Fang 等[16]的方法測(cè)定凝膠電泳，并作適當(dāng)調(diào)整。利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）測(cè)定分離蛋白、清蛋白和球蛋白的分子量分布。使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13% 分離膠和5.0% 濃縮膠，將蛋白樣品溶于磷酸鹽緩沖液（pH7.0、0.01 mol/L）中，并使其濃度達(dá)到0.5 mg/mL，每種蛋白溶液與加樣緩沖液渦旋混勻后在100 ℃加熱5 min，待溫度降為室溫后，在還原狀態(tài)下測(cè)定，加樣量為20 μL，電泳緩沖液為Tris-甘氨酸（0.125 mol/L Tris，1.25 mol/L 甘氨酸，0.5%SDS），于25 mA 下恒流進(jìn)行，將凝膠電泳儀的電壓設(shè)定為40 V，待樣品進(jìn)入分離膠后調(diào)高電壓至85 V，3 h 左右電泳結(jié)束。用0.25% 考馬斯亮藍(lán)（R-250）染色6 h 后，用脫色劑反復(fù)脫色至條帶清晰，然后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析處理。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

每組試驗(yàn)均進(jìn)行3 次后取平均值，數(shù)據(jù)經(jīng)Excel處理，采用Origin 9.0、PeakFitv 4.12 軟件作圖，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS Statistics 26 進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離蛋白和組分蛋白的分析

吊干杏杏仁分離蛋白及2 種組分蛋白含量如圖1所示。

圖1 3 種提取蛋白的含量Fig.1 Contents of three extracted proteins

杏仁脫皮粉碎后，以石油醚為有機(jī)溶劑脫脂，用索氏提取法得到杏仁脫脂粉，通過Osborne 分級(jí)分離法和堿溶酸沉法分別提取得到清蛋白、球蛋白和分離蛋白。由圖1 可知，清蛋白、球蛋白和分離蛋白含量依次為97.08%、75.84% 和88.61%。清蛋白較其他2 種樣品的粗蛋白質(zhì)含量差異顯著（P＜0.05）。

2.2 蛋白功能特性的分析

2.2.1 溶解性分析

吊干杏杏仁分離蛋白及2 種組分蛋白溶解性見圖2。

圖2 吊干杏杏仁中3 種蛋白溶解性Fig.2 Solubility of three proteins in almond kernel of hanging dried apricot

蛋白質(zhì)的溶解性是指蛋白質(zhì)表面極性基團(tuán)與水分子相互作用后，蛋白質(zhì)在水中分散的程度[17]。良好的溶解性通常具有良好的蛋白質(zhì)加工特性，而在食品加工中不溶性蛋白的應(yīng)用價(jià)值有限，溶解性是其他功能性質(zhì)的基礎(chǔ)前提[18]。由圖2 可知，在pH 值為7 的條件下，3 種蛋白的溶解性大小依次為清蛋白（50%）＞分離蛋白（43%）＞球蛋白（39%）。清蛋白溶解性顯著高于其他兩種蛋白（P＜0.05）。3 種蛋白的溶解性結(jié)果與彭倩[11]分級(jí)提取的澳洲堅(jiān)果蛋白研究結(jié)果一致。表面疏水性被認(rèn)為是影響溶解度和許多功能性質(zhì)的重要因素[19]，表面疏水性越大，溶解度越小，說明球蛋白表面含有的疏水性殘基較多，會(huì)與水分子產(chǎn)生斥力，導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集和沉淀[20]，從而降低蛋白質(zhì)的溶解度。因此，吊干杏杏仁清蛋白在食品輔料的應(yīng)用潛力更大，可作為一種新型食品添加劑應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域中。

2.2.2 持油性分析

持油性是指蛋白質(zhì)與油相互作用時(shí)吸附油脂的能力。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的非極性側(cè)鏈可以與油脂結(jié)合，保留油脂在食品中的風(fēng)味，此外，持油性可改善食品的適口性，并延長食品的保質(zhì)期[21]。優(yōu)良的持油性是減少油脂損失，穩(wěn)定食品的關(guān)鍵，多用于肉制品、烘焙食品、奶制品的生產(chǎn)。吊干杏杏仁分離蛋白及2 種組分蛋白持油性測(cè)定結(jié)果如圖3所示。

圖3 吊干杏杏仁中3 種蛋白持油性Fig.3 Oil holding capacity of three proteins in almond kernel of hanging dried apricot

由圖3 可知，3 種蛋白的持油性大小依次為清蛋白（16.06 g/g）＞分離蛋白（5.37 g/g）＞球蛋白（3.15 g/g）。3 種蛋白持油性之間具有顯著性差異（P＜0.05）。其中，清蛋白的持油性顯著高于其他兩種蛋白，此結(jié)論與彭倩[11]的研究結(jié)果一致。清蛋白的持油性和溶解性優(yōu)良，屬于兩親性蛋白；分離蛋白與葵花籽蛋白（4.12 g/g）[22]的持油性大小接近，球蛋白與豇豆蛋白（3.56 g/g）[23]的持油性大小相近。吊干杏杏仁中清蛋白的持油性較好，能夠應(yīng)用于高油脂食品的生產(chǎn)加工中，如餅干、素肉、糖果等，對(duì)產(chǎn)品的研發(fā)具有一定的研究價(jià)值。

2.2.3 不同pH 值下起泡及起泡穩(wěn)定性分析

起泡性是指蛋白質(zhì)經(jīng)過外界作用力高速攪打，使蛋白質(zhì)分子部分展開，吸附至水-空氣界面，形成一層薄而堅(jiān)韌的膜，從而形成泡沫；通過觀察，若泡沫體積發(fā)生變化，說明泡沫穩(wěn)定性發(fā)生變化[24]。蛋白質(zhì)的起泡性與泡沫穩(wěn)定性與pH 值變化的結(jié)果，如圖4所示。

圖4 吊干杏杏仁中3 種蛋白起泡性及泡沫穩(wěn)定性Fig.4 Foaming properties and foam stability of three proteins in almond kernel of hanging dried apricot

由圖4 可知，3 種蛋白在pH3～9 時(shí)，起泡性為80%～160%；起泡性隨著pH 值的增加均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。3 種蛋白均在pH5 左右起泡能力最差，之后隨著pH 值增大，起泡能力明顯提高，在pH 值為9 時(shí)起泡性達(dá)到最大，其中分離蛋白的起泡性最好。分析原因可能是pH 值在5 附近時(shí)溶解度較低，只有少量的可溶性蛋白吸附至氣-液界面，導(dǎo)致起泡量少。而偏離pH5 時(shí)，酸/堿性增加，蛋白的溶解性增大，甚至帶來更多的靜電荷，增加靜電斥力，降低蛋白的疏水相互作用，利于可溶性蛋白快速吸附至氣-液界面，發(fā)揮出更加優(yōu)良的界面性質(zhì)[25]，利于蛋白質(zhì)起泡能力的增強(qiáng)。在pH 值為7 時(shí)，3 種蛋白的起泡性大小依次為清蛋白＞分離蛋白＞球蛋白，與圖2 溶解性結(jié)論一致，表明清蛋白可更好地與水產(chǎn)生相互作用，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子展開，增強(qiáng)包裹空氣的能力，從而促進(jìn)泡沫的形成。

清蛋白和球蛋白的泡沫穩(wěn)定性變化趨勢(shì)相似，均在pH5 附近泡沫穩(wěn)定性最好，并隨著pH 值的增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性呈不同程度下降，與起泡能力剛好呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)。這是由于pH5 附近蛋白質(zhì)的泡沫量少，未溶解的蛋白質(zhì)粒子增強(qiáng)了泡沫表面的黏度[26]，從而提高了泡沫穩(wěn)定性。此外，在90 min 后，球蛋白的泡沫穩(wěn)定性高于清蛋白，說明球蛋白隨著靜置時(shí)間延長，泡沫體積下降更緩慢，蛋白質(zhì)分子之間的表面活性更強(qiáng)。分離蛋白泡沫穩(wěn)定性與清蛋白、球蛋白相反，均隨pH 值的增大出現(xiàn)先減小后增大趨勢(shì)，與李超[17]的花椒籽仁分離蛋白結(jié)果一致。

2.3 蛋白結(jié)構(gòu)特性的分析

2.3.1 氨基酸組成

分析蛋白質(zhì)中氨基酸的組成能有效評(píng)估蛋白的營養(yǎng)價(jià)值，吊干杏杏仁3 種蛋白的氨基酸組成結(jié)果如表1所示。

表1 吊干杏杏仁蛋白的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition in almond kernel of hanging dried apricot%

蛋白質(zhì)是人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)之一，能維持機(jī)體的健康和生理功能。外源性食物攝入后，會(huì)被水解，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成氨基酸并被人體識(shí)別，合成人體所需的蛋白質(zhì)。由表1 可知，3 種蛋白質(zhì)富含16 種氨基酸，組成比較全面，都含有人體8 種必需氨基酸中的7 種（甲硫氨酸未檢測(cè)出），各含量之間具有明顯差異。3 種蛋白質(zhì)的氨基酸總量大小依次為清蛋白（97.75 g/100 g）＞分離蛋白（89.83 g/100 g）＞球蛋白（80.39 g/100 g）。球蛋白的必需氨基酸含量/氨基酸總量的比例最高，達(dá)33.08%，其次為分離蛋白30.24%，與大豆蛋白（34.00%）[23]接近，表明吊干杏杏仁蛋白可作為一種優(yōu)良的氨基酸膳食資源，具有一定的研究價(jià)值。

由表1 還可以看出，吊干杏杏仁的3 種蛋白富含多種必需氨基酸，從氨基酸的評(píng)價(jià)角度分析，吊干杏杏仁的3 種蛋白第一限制性氨基酸為甲硫氨酸，其余氨基酸均滿足FAO/WHO 的成人攝取量標(biāo)準(zhǔn)。3 種蛋白均只有甲硫氨酸不能滿足攝入量標(biāo)準(zhǔn)，與扁桃仁[8]、堅(jiān)果蛋白[11]、豆類蛋白[23]等必需氨基酸研究結(jié)果一致。與FAO/WHO 的兒童（2～5 歲）攝取量標(biāo)準(zhǔn)相比，3 種蛋白的纈氨酸、異亮氨酸、組氨酸含量均高于攝入標(biāo)準(zhǔn)，此外，清蛋白和分離蛋白的亮氨酸含量也高于FAO/WHO 的兒童（2～5 歲）攝入標(biāo)準(zhǔn)，均可作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑應(yīng)用于嬰幼兒食品中。綜上所述，吊干杏杏仁清蛋白、球蛋白和分離蛋白的必需氨基酸含量豐富，氨基酸組成接近FAO/WHO 推薦的氨基酸模式。

吊干杏杏仁的3 種蛋白中，谷氨酸含量最高，其次為天冬氨酸和精氨酸，這與張清安等[2]和Lin 等[27]研究的結(jié)果一致。由于天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸都是極性氨基酸，因此導(dǎo)致3 種蛋白的非極性氨基酸含量較低。清蛋白中非極性氨基酸比例最低，僅為0.29。

2.3.2 表面疏水性分析

吊干杏杏仁3 種蛋白的表面疏水性結(jié)果如圖5所示。

圖5 吊干杏杏仁中3 種蛋白表面疏水性Fig.5 Surface hydrophobicity of three proteins in almond kernel of hanging dried apricot

表面疏水性反映疏水簇暴露在蛋白質(zhì)分子表面上的程度，是與其界面活性有關(guān)的性質(zhì)，樣品蛋白的疏水性可用溴酚藍(lán)與蛋白質(zhì)分子中的疏水性殘基相結(jié)合來測(cè)定。從圖5 可以看出，吊干杏杏仁中3 種蛋白的表面疏水性從大到小依次為球蛋白（119.33 μg）＞分離蛋白（101.54 μg）＞清蛋白（86.54 μg）。球蛋白較清蛋白和分離蛋白差異顯著（P＜0.05）。蛋白質(zhì)的表面疏水性與非極性氨基酸含量有關(guān)[28]，由表1 可知，球蛋白中非極性氨基酸比例最高（0.32），因此表現(xiàn)出最高的表面疏水性。此外，根據(jù)許晶等[29]研究表明，蛋白分子內(nèi)部的疏水性殘基越多，溶解性越差，說明表面疏水性是決定蛋白溶解性的重要因素，這也從一定程度上證明了清蛋白的溶解性大于球蛋白的溶解性。

此外，蛋白質(zhì)的表面疏水性與游離巰基含量相關(guān)，當(dāng)游離巰基含量較高時(shí)，蛋白分子的折疊程度較高，更多的疏水性殘基被暴露出來，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中親水和疏水氨基酸殘基之間的平衡是影響蛋白質(zhì)溶解度的一個(gè)重要因素，這又與蛋白質(zhì)的起泡性有關(guān)。與齊寶坤等[14]研究結(jié)果一致。

2.3.3 巰基和二硫鍵含量分析

巰基和二硫鍵含量分析結(jié)果如圖6所示。

圖6 吊干杏杏仁中3 種蛋白巰基和二硫鍵含量Fig.6 Sulfhydryl groups and disulfide bonds of three proteins in almond kernel of hanging dried apricot

巰基和二硫鍵是維系蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵，對(duì)肽鏈的空間結(jié)構(gòu)起穩(wěn)定作用[14]。由圖6 可知，吊干杏杏仁中分離蛋白、球蛋白和清蛋白的游離巰基含量依次為（1.07±0.07）、（0.67±0.06）、（0.92±0.18）μmol/g；二硫鍵含量依次為（0.56±0.05）、（0.69±0.04）μmol/g 和（0.45±0.10）μmol/g。3 種蛋白之間各含量均差異性顯著（P＜0.05）。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的折疊程度可由游離巰基/總巰基的含量反映，蛋白分子含量越高，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)暴露出的疏水性基團(tuán)越多[30]，所以疏水力維持蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)[31]。由圖6 可知，清蛋白的游離巰基/總巰基值最大，分離蛋白次之，球蛋白最小，表明清蛋白暴露的疏水性基團(tuán)最多，疏水性最強(qiáng)，也驗(yàn)證了清蛋白擁有較好的溶解性。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)變性后，二硫鍵易發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成游離巰基，蛋白結(jié)構(gòu)變疏松，即二硫鍵越多，蛋白結(jié)構(gòu)越緊密。因此，可推測(cè)出蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密程度為球蛋白＞分離蛋白＞清蛋白。

2.3.4 傅里葉變換紅外吸收光譜分析

圖7 吊干杏杏仁中3 種蛋白酰胺I 帶高斯擬合紅外圖譜Fig.7 Gauss fitting of three protein amide I bands in almond kernel of hanging dried apricot

根據(jù)PeakFit v 4.12 軟件導(dǎo)出的積分面積分布表，對(duì)分離蛋白、清蛋白和球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中各含量進(jìn)行峰譜歸屬判定，結(jié)果如圖8所示。

圖8 吊干杏杏仁中3 種蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Fig.8 Secondary structure of three proteins in almond kernel of hanging dried apricot

由圖8 可知，3 種蛋白質(zhì)均含4 種結(jié)構(gòu)：β-轉(zhuǎn)角、α-螺旋、無規(guī)則卷曲和β-折疊。其中，β 折疊和β 轉(zhuǎn)角所占比例最大，是主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)。球蛋白的β-折疊含量高于其他兩種蛋白，清蛋白的β 轉(zhuǎn)角含量較其他兩種蛋白高。黎衛(wèi)[33]研究結(jié)果表明，在蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中，β-折疊和α-螺旋是有序的蛋白結(jié)構(gòu)，其穩(wěn)定性較好，無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角是無序結(jié)構(gòu)，其穩(wěn)定性較差。對(duì)比3 種蛋白的無序結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，清蛋白明顯比分離蛋白、球蛋白的無序結(jié)構(gòu)含量高，說明清蛋白較其他兩種蛋白更易受溫度影響而導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變。

此外，疏水性與蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)。當(dāng)無規(guī)則卷曲含量較高時(shí)，分子相對(duì)伸展，暴露出更多的疏水性殘基，導(dǎo)致疏水性較高，因此表面疏水性與無規(guī)則卷曲含量存在線性正相關(guān)[34]，這可能是清蛋白疏水性較高的原因。

2.3.5 SDS-PAGE 分析

吊干杏杏仁中3 種蛋白的SDS-PAGE 電泳圖譜如圖9所示。

圖9 吊干杏杏仁中3 種蛋白SDS-PAGE 分析圖譜Fig.9 SDS-PAGE of three proteins in almond kernel of hanging dried apricot

聚丙烯酰胺凝膠電泳是將蛋白質(zhì)按不同的亞基分子量，進(jìn)行梯度分離，因此蛋白質(zhì)的分子量分布范圍可對(duì)照Marker 來表征[35]。由圖9 可知，3 種蛋白的亞基分布范圍均較廣，分子量范圍約為11～63 kDa，其中分離蛋白的條帶主要集中在11、20、21、30、35 kDa，清蛋白的條帶集中在20、21、30、35 kDa，球蛋白主要集中在20、21、34、38 kDa。3 種蛋白在20、21 kDa 這兩個(gè)條帶的灰度值較高，說明在此范圍內(nèi)蛋白的分子量含量豐富。在11 kDa 亞基低分子量條帶處，分離蛋白和清蛋白的區(qū)域染色較深，球蛋白幾乎沒有，這應(yīng)該是球蛋白較其他兩種蛋白溶解性具有差異的主要原因。

3 結(jié)論

吊干杏杏仁分離蛋白及組分蛋白的營養(yǎng)價(jià)值、功能和結(jié)構(gòu)特性之間有明顯差異。采用Osborne 分級(jí)分離法和堿溶酸沉法提取得到的吊干杏杏仁清蛋白、球蛋白和分離蛋白的含量依次為97.08%、75.84% 和88.61%。清蛋白的持油性最高（16.06 g/g），與目前研究較多的其他植物蛋白的持油性相當(dāng)，有向應(yīng)用于食品工業(yè)發(fā)展的潛力。在pH 值為7 的條件下，3 種蛋白的溶解性大小依次為清蛋白＞分離蛋白＞球蛋白，與疏水性呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。在pH3～9 時(shí)，吊干杏杏仁蛋白起泡能力為80%～160%，pH 值在5 附近時(shí)，3 種蛋白質(zhì)均表現(xiàn)出最低的起泡性；球蛋白、清蛋白的泡沫穩(wěn)定性與起泡性趨勢(shì)相反。3 種蛋白的亞基分子主要集中在11～38 kDa，分離蛋白和球蛋白主要由中、小分子量亞基構(gòu)成，其中球蛋白在大于41 kDa 也有少量分布，說明球蛋白二硫鍵含量較多，分子結(jié)構(gòu)較緊密；清蛋白、球蛋白和分離蛋白的疏水性大小依次為：球蛋白（119.33 μg）＞分離蛋白（101.54 μg）＞清蛋白（86.54 μg）；二級(jí)結(jié)構(gòu)均以β 折疊和β 轉(zhuǎn)角為主。

綜上所述，吊干杏杏仁分離蛋白和2 種組分蛋白均存在一些優(yōu)良性質(zhì)，如清蛋白持油性高，在pH3～9時(shí)蛋白質(zhì)總體起泡性高，可以作為一種天然的食品發(fā)泡劑。但其本身也存在著大多數(shù)植物蛋白都不可避免的缺點(diǎn)，蛋白質(zhì)溶解性不高，對(duì)此可采用合適的改性方法對(duì)吊干杏杏仁蛋白進(jìn)行改性，以克服其本身溶解性較低的缺點(diǎn)，獲得更優(yōu)秀的功能特性，為吊干杏杏仁蛋白的開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。