ESD 對(duì)結(jié)直腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者療效的影響及Akt/mTOR 信號(hào)途徑參與機(jī)制研究

牛振楠，梁冬紅，劉 壯，孟嫦娟

神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（neuroendocrine neoplasm，NEN）作為異質(zhì)性腫瘤，起源于神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，發(fā)病率較低，但隨著影像學(xué)和臨床診斷技術(shù)不斷提高，其檢出率和發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加趨勢(shì)， 常見(jiàn)于結(jié)直腸等部位[1，2]。 NEN 的發(fā)病較為復(fù)雜[3，4]，可能與遺傳、飲食和生活習(xí)慣相關(guān)，主要臨床癥狀為局部腫塊、頭痛、視野模糊等壓迫癥狀及肌無(wú)力、 醛固酮增多等神經(jīng)內(nèi)分泌癥狀，嚴(yán)重威脅患者生命安全。 現(xiàn)階段臨床治療NEN 以手術(shù)、化學(xué)治療、放射治療及靶向治療為主，并根據(jù)腫瘤分型、分期、發(fā)生部位等選擇適宜手段，且手術(shù)為首選方案[5]。 常規(guī)開(kāi)腹切除因切口大、術(shù)后恢復(fù)慢，已逐漸被臨床摒棄[6]；內(nèi)鏡切除術(shù)，如內(nèi)鏡下黏膜切除術(shù)（endoscopic mucosal resection，EMR）可有效切除病灶，阻止癌變病灶的進(jìn)展或轉(zhuǎn)移，但其在切除直徑＞2 cm 病灶方面存在一定局限性[7]。 內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)（endoscopic submucosal dissection，ESD）是在EMR 的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的手術(shù)方式， 可完整切除病灶，降低復(fù)發(fā)率[8]，且已用于胃腸NEN 患者[9]，但具體應(yīng)用于結(jié)直腸部位腫瘤研究及作用機(jī)制相對(duì)較少。因此筆者選擇146 例結(jié)直腸NEN 患者， 采用隨機(jī)信封法， 研究ESD 和常規(guī)內(nèi)鏡切除術(shù)對(duì)患者臨床療效及作用機(jī)制，為臨床控制疾病進(jìn)展、延長(zhǎng)生存期等提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2014 年1 月至2019 年10 月在邢臺(tái)市第三醫(yī)院收治的146 例結(jié)直腸NEN 患者， 其中男性92例，女性54 例；年齡42 ～65 歲，平均年齡53.49 歲（標(biāo)準(zhǔn)差5.42 歲）；病灶直徑1.15 ～1.85 cm，平均直徑1.50 cm（標(biāo)準(zhǔn)差0.18 cm）；病理分級(jí)[10]，G132 例，G251 例，G363 例；直腸99 例，結(jié)腸47 例。 按隨機(jī)信封法將患者分成觀察組和對(duì)照組，每組73 例。對(duì)照組患者行EMR，觀察組行ESD。 觀察組男性49 例，女性24 例；年齡42 ～65 歲，平均年齡53.15 歲（標(biāo)準(zhǔn)差5.50 歲）；病灶直徑1.16 ～1.82 cm，平均直徑1.47 cm（標(biāo)準(zhǔn)差0.18 cm）； 病理分級(jí)，G114 例，G224 例，G335 例；直腸47 例，結(jié)腸26 例。 對(duì)照組男性43 例，女性30 例；年齡44 ～62 歲，平均年齡52.87 歲（標(biāo)準(zhǔn)差4.52 歲）；病灶直徑1.16 ～1.84 cm，平均直徑1.49 cm（標(biāo)準(zhǔn)差0.20 cm）； 病理分級(jí)，G118 例，G227 例，G328 例；直腸52 例，結(jié)腸21 例。

選擇標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理組織檢查確診為NEN，且發(fā)病部位為結(jié)直腸[11]；②年齡18 ～75 歲；③均符合手術(shù)治療診斷，首次應(yīng)用內(nèi)鏡切除術(shù)或ESD；④入院前未經(jīng)放化療等治療；⑤患者首次發(fā)病，病歷資料齊全，能正常溝通和交流；⑥知情同意研究方案。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并惡性腫瘤者；②凝血功能障礙、出血性疾病者；③紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫疾病者；④肝、腎、心等重要臟器衰竭者；⑤不配合者。

兩組患者性別、年齡、病理分級(jí)、病灶部位及病灶直徑比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2/t=1.058、0.336、1.454、0.784、0.635，P ＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 治療方法

手術(shù)由同一手術(shù)團(tuán)隊(duì)進(jìn)行，所有患者術(shù)前均進(jìn)行手術(shù)指征確認(rèn)。 術(shù)前禁飲、禁食至少6 h，并于術(shù)前給予鎮(zhèn)靜劑和解痙劑，在靜脈麻醉下行相應(yīng)手術(shù)治療。

觀察組：給予常規(guī)ESD 治療。 具體步驟如下：采用日本Olympus CF-H260AI 型電子腸鏡判斷、 勾畫病灶， 并應(yīng)用DUAL 刀在病灶區(qū)域0.5 cm 外沿電凝法標(biāo)記；在病灶周邊注射混合液，主要為甘油果糖、腎上腺素和由美藍(lán)， 每次注射3 mL， 等待病灶肌層分離；再次應(yīng)用DUAL 刀沿著標(biāo)記點(diǎn)邊緣逐步切開(kāi)，在鉤刀的輔助下在黏膜下層沿著原有基層剝離病灶黏膜，將完整瘤體送檢，同時(shí)確認(rèn)基底和邊沿是否有腫瘤殘留物；徹底剝離后，應(yīng)用熱活檢鉗充分止血，降低活動(dòng)性出血事件發(fā)生。

對(duì)照組：給予常規(guī)EMR 治療。 在內(nèi)鏡的輔助下充分暴露病灶基底，并探查病灶。 在病灶周邊注射混合液，主要為甘油果糖、腎上腺素和由美藍(lán)，關(guān)注病灶的抬舉征是否為陽(yáng)性，選用適宜大小的圈套器對(duì)陽(yáng)性病灶圈套，并應(yīng)用電凝刀切除，針對(duì)體積較大的病灶可分批次切除，最后應(yīng)用熱活檢鉗行相應(yīng)創(chuàng)面關(guān)閉處理，以發(fā)揮止血功能。

術(shù)后24 h 密切監(jiān)測(cè)患者生命體征，并給予止血、抑酸及抗感染等，于術(shù)后3、6、12 個(gè)月定期復(fù)查。

1.2.2 觀察指標(biāo)

病變切除情況：記錄兩組患者治愈性切除、整塊切除及基底病灶殘余等情況。

手術(shù)情況：記錄兩組患者術(shù)中出血量、手術(shù)時(shí)間、住院時(shí)間、治療費(fèi)用、病變組織直徑及病變組織厚度等。

生存質(zhì)量：于術(shù)前和術(shù)后7 d 應(yīng)用生存質(zhì)量量表評(píng)估兩組患者生存質(zhì)量[12]。 該量表包括食欲、精神、睡眠、生活能力、疲倦及疼痛等6 個(gè)維度，除生活能力每個(gè)維度滿分為5 分， 生活能力滿分為20 分。 分值越高，患者生存質(zhì)量越差，該量表Cronbach’α 為0.789，信效度較好。

免疫功能：分別于術(shù)前和術(shù)后7 d 采集空腹肘靜脈外周血4 mL，流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組患者CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD4+/CD8+等免疫指標(biāo)。

蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）：分別術(shù)前和術(shù)后7 d 采集空腹肘靜脈外周血4 mL，采用德國(guó)Hettich MIKRO220 型離心機(jī)，參數(shù)：3000 r/min，半徑8 cm，時(shí)間10 min，溫度-4 ℃；上清液為目標(biāo)產(chǎn)物，應(yīng)用美國(guó)Bio 公司Tek Synergy H1MF 型號(hào)全自動(dòng)酶標(biāo)儀，波長(zhǎng)為450 nm，測(cè)定血清Akt 和mTOR 水平，所有操作均嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

并發(fā)癥： 記錄兩組患者圍術(shù)期并發(fā)癥發(fā)生情況，如術(shù)中穿孔、皮下氣腫及術(shù)后遲發(fā)性出血等情況。

復(fù)發(fā)情況：隨訪1 年，記錄兩組患者術(shù)后1 年復(fù)發(fā)情況。

診斷效能分析：以術(shù)后7 d 血清Akt 和mTOR 為檢驗(yàn)變量，以術(shù)后是否復(fù)發(fā)為狀態(tài)標(biāo)量，繪制受試者工作特性（receiver operating characteristic，ROC）曲線，繪制曲線下面積（area under curve，AUC），分析Akt 診斷、mTOR 診斷和二者聯(lián)合診斷的靈敏度、特異度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，治療前后行配對(duì)t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。 P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P ＜0.01 為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者病變切除情況比較

術(shù)后觀察組患者治愈性切除率和整塊切除率明顯高于對(duì)照組[83.56 %（61/73） vs 60.27 %（44/73）。χ2=9.801，P=0.002。 97.26%（71/73）vs 73.97%（54/73）。 χ2=16.074，P=0.000]，而兩組患者基底病灶殘余率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[1.37%（1/73）vs 5.48%（4/73）。χ2=1.864，P=0.172]。

2.2 兩組患者手術(shù)情況比較

觀察組患者手術(shù)時(shí)間和治療費(fèi)用明顯高于對(duì)照組，而術(shù)中出血量和住院時(shí)間明顯低于對(duì)照組（P ＜0.05）。 兩組患者病變組織直徑和病變組織厚度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。 見(jiàn)表1。

2.3 兩組患者手術(shù)前后生存質(zhì)量比較

術(shù)前兩組患者食欲、精神、睡眠、生活能力、疲倦及疼痛等生存質(zhì)量各維度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＞0.05）；術(shù)后7 d 兩組患者生存質(zhì)量各維度水平明顯降低（P ＜0.05），且觀察組患者食欲、精神、睡眠、生活能力、疲倦及疼痛等生存質(zhì)量評(píng)分明顯低于對(duì)照組（P ＜0.05）。 見(jiàn)表2。

2.4 兩組患者手術(shù)前后免疫功能比較

術(shù)前兩組患者CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD4+/CD8+等免疫指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。 術(shù)后7 d，兩組患者CD3+CD4+和CD4+/CD8+水平明顯提高，CD3+CD8+水平明顯降低（P ＜0.05）；且觀察組患者CD3+CD4+和CD4+/CD8+水平明顯高于對(duì)照組，CD3+CD8+水平明顯低于對(duì)照組（P ＜0.05）。 見(jiàn)表3。

表3 兩組患者手術(shù)前后免疫功能比較Tab.3 Comparison of immune function before and after treatment between 2 groups before and after operation

2.5 兩組患者手術(shù)前后Akt 和mTOR 比較

術(shù)前兩組患者血清Akt 和mTOR 水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；術(shù)后7 d，兩組患者血清Akt和mTOR 明顯降低（P ＜0.05），且觀察組患者血清Akt和mTOR 明顯低于對(duì)照組（P ＜0.05）。 見(jiàn)表4。

表4 兩組患者手術(shù)前后血清Akt 和mTOR 比較ng/mLTab.4 Comparison of Akt and mTOR between 2 groups before and after operationng/mL

2.6 兩組患者術(shù)后并發(fā)癥比較

觀察組術(shù)后遲發(fā)性出血1 例（1.37%），穿孔2 例（2.74%），皮下氣腫1 例（1.37%）。 對(duì)照組術(shù)后遲發(fā)性出血4 例（5.48%），穿孔4 例（5.48 %），皮下氣腫5例（6.85%）。 兩組患者均出現(xiàn)術(shù)后遲發(fā)性出血、穿孔及皮下氣腫等并發(fā)癥，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.864、0.695、2.781，P=0.172、0.404、0.095）。

2.7 兩組術(shù)后復(fù)發(fā)情況比較

隨訪1 年，失訪3 例。觀察組患者復(fù)發(fā)率為4.17%（3/72），明顯低于對(duì)照組的22.54%（16/71），差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.469，P=0.001）。

2.8 單獨(dú)和聯(lián)合診斷效能比較

血清Akt 臨界值為1.33 ng/mL，Akt 診斷的靈敏度為68.42%，特異度為70.16 %，AUC 為0.765[95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）0.706 ～0.813]；血清mTOR 臨界值為0.049 ng/mL，mTOR 診斷的靈敏度為73.68%， 特異度為59.89%，AUC 為0.808 （95%CI0.749 ～0.851）；二者聯(lián)合診斷，其靈敏度為84.21 %，特異度為75.00%，AUC 0.878（95%CI 0.832 ～0.911）。見(jiàn)圖1。

圖1 Akt 診斷、mTOR 診斷和二者聯(lián)合診斷的ROC 曲線Fig. 1 ROC curves of Akt diagnosis, mTOR diagnosis and combined diagnosis

3 討論

NEN 起源于彌散神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)， 可分布于全身不同器官和組織，以胃腸道等消化系統(tǒng)最為常見(jiàn)，以低血糖、皮膚潮紅、胰高糖素瘤及生長(zhǎng)抑素瘤等為主要臨床癥狀，其生長(zhǎng)緩慢、惡性程度低，若早期及時(shí)發(fā)現(xiàn)并對(duì)癥治療，將會(huì)明顯改善患者預(yù)后[13，14]?，F(xiàn)階段[15]，NEN 未見(jiàn)有效預(yù)防措施，手術(shù)是根治NEN 最有效的方式，傳統(tǒng)息肉切除術(shù)完全切除率僅為30%～50%，不僅存在較高復(fù)發(fā)率，而且具有創(chuàng)傷大、恢復(fù)慢等缺點(diǎn)，患者依從性較低。隨著內(nèi)鏡技術(shù)應(yīng)用于外科手術(shù)，EMR 的腫瘤清除率明顯高于傳統(tǒng)開(kāi)腹手術(shù)， 術(shù)中損傷、侵襲小，術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率低，其安全性和有效性已得到臨床廣泛證實(shí)，但其在切除大體積病灶方面存在不足[16]。ESD 是在內(nèi)鏡直視下應(yīng)用專用醫(yī)療器械將病灶剝離正常黏膜，以徹底清除病灶、遏止疾病復(fù)發(fā)[17]，二者在NEN 治療中均有一定作用，但在治療效果、優(yōu)勢(shì)和缺點(diǎn)等方面臨床尚未得出統(tǒng)一結(jié)論。有研究[18]證實(shí)，NEN 患者3 年生存率僅為52.64 %，預(yù)后較差。因而研究治療方式的作用機(jī)制，對(duì)疾病復(fù)發(fā)、預(yù)后的改善具有重要臨床意義。

ESD 在治愈性切除率、整塊切除率、生存質(zhì)量和免疫功能提高等方面獨(dú)具優(yōu)勢(shì)， 但ESD 手術(shù)時(shí)間和治療費(fèi)用高于EMR。 Dinc S 等[19]大鼠實(shí)驗(yàn)表明，ESD后創(chuàng)面比EMR 損傷大，手術(shù)時(shí)間較長(zhǎng)。 ESD 可在內(nèi)鏡的幫助下， 應(yīng)用專用醫(yī)療器械完全剝離病灶組織，而病灶的完全剝離與疾病復(fù)發(fā)、免疫功能和生存質(zhì)量明顯相關(guān)。 賀德志等[20]證實(shí)，ESD 可有效提高病理組織切除率， 降低并發(fā)癥， 但術(shù)后復(fù)發(fā)率仍較高，為23.64%，略高于筆者研究，可能與樣本量、手術(shù)方式相關(guān)。Akt 是高度保守的蛋白激酶，是磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）的下游因子；mTOR 是Akt 信號(hào)下游作用靶點(diǎn)， 可直接磷酸化或者阻滯結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物， 以激活mTOR信號(hào)通路，Akt/mTOR 信號(hào)通路的激活與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化密切有關(guān)[21]。筆者研究結(jié)果表明，兩組患者血清Akt 和mTOR 明顯降低，且觀察組患者血清Akt和mTOR 明顯低于對(duì)照組（P ＜0.05），即臨床切除結(jié)直腸NEN，提高臨床療效、改善患者生存質(zhì)量與降低Akt/mTOR 信號(hào)通路相關(guān)，且Akt 和mTOR 單獨(dú)和二者聯(lián)合檢測(cè)可應(yīng)用于預(yù)測(cè)結(jié)直腸NEN 術(shù)后復(fù)發(fā)，臨床可通過(guò)術(shù)后Akt 和mTOR 指標(biāo)預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)。

綜上所述，ESD 應(yīng)用于治療結(jié)直腸NEN 患者可有效提高治愈性切除率和整塊切除率，改善患者生存質(zhì)量，恢復(fù)免疫功能，降低術(shù)后1 年復(fù)發(fā)率，且血清Akt 和mTOR 單獨(dú)和二者聯(lián)合診斷可應(yīng)用于預(yù)測(cè)結(jié)直腸NEN 術(shù)后復(fù)發(fā)。