探索結(jié)直腸癌血清外泌體有效分子標志物

楊 釗，鄒魯飛

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是臨床中最為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率目前位居世界第3 位和第4 位[1]。目前針對CRC 主要篩查手段為糞便隱血檢查及電子結(jié)腸鏡，但糞便隱血檢查由于受到取樣等多種因素影響其準確度受限，而結(jié)腸鏡檢查常因耐受性等因素并未被大部分健康人群所接受。因此， 如何更為精準地篩查CRC 患者仍是臨床所面臨的難題。近年來飛速發(fā)展的液體活檢技術(shù)為臨床更為精準方便篩選腫瘤標志物帶來了巨大幫助[2～4]。 因此，基于液體活檢技術(shù)篩選CRC 有效的生物學標志物將可能極大的幫助CRC 患者的早期診斷。 筆者利用基于液體活檢技術(shù)的血清外泌體檢測尋找CRC 有效生物學標志物。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選擇外泌體數(shù)據(jù)庫exoRBase 2.0[5]（http://www.exorbase.org/） 和基因表達綜合集（gene expression omnibus，GEO） 網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）、腫瘤免疫評估資源（tumor immune estimation resource，TIMER）網(wǎng)站（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）。

1.2 方法

1.2.1 外泌體數(shù)據(jù)集和驗證數(shù)據(jù)集獲取

從外泌體數(shù)據(jù)庫exoRBase 2.0[5]（http://www.exorbase.org/）中下載健康人和CRC 患者的血清外泌體測序數(shù)據(jù)。 從GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）網(wǎng)站中獲取GSE192667 和GSE24549 數(shù)據(jù)集中基因表達譜表達數(shù)據(jù)及預后信息作為核心基因的外部驗證數(shù)據(jù)集，并據(jù)此構(gòu)建生存風險模型。

1.2.2 基于血清外泌體數(shù)據(jù)庫篩選結(jié)直腸癌患者高表達基因

利用外泌體數(shù)據(jù)庫中所包含的測序數(shù)據(jù)集，篩選共獲得19616 個基因， 其中有2520 個基因在CRC組無表達，1534 個基因在健康人群中無表達，1293基因在健康人群和CRC 患者中均無表達。 并利用R軟件篩選兩組之間的差異基因及其所涉及的基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析。

1.2.3 基于加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡篩選核心分子

加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）是一種近年來被廣泛使用的生物信息學篩選方法，其通過無序算法篩選有效的分子標志物， 其可以應用于腫瘤及其他疾病中[6]。首先利用R 軟件中的“WGCNA”包構(gòu)建WGCNA網(wǎng)絡模型，基于基因與基因之間關聯(lián)程度確定軟閾值大小[7，8]，并將基因表達矩陣轉(zhuǎn)化為拓撲重疊矩陣（topological overlap，TOM）[9，10]， 并對基因進行歸類分析， 將基于基因關聯(lián)關系劃分基因模塊屬性（module eigengene，ME），計算模塊中每個基因?qū)γ總€樣本貢獻度，并累加獲得每個模塊對樣本的貢獻度。 基于貢獻度絕對值最大模塊為核心模塊。同時，基于蛋白-蛋白互作用（protein-protein interact，PPI）分析核心模塊內(nèi)所有基因的互作關系，并利用Cytoscape 軟件中3 種算法Degree Score、MCODE Score 和Closeness Score 計算各基因的評分，篩選核心模塊中核心分子。 并基于核心模塊中差異基因確定核心分子。

1.2.4 基于外部網(wǎng)站驗證核心分子及其可能涉及機制

為驗證所篩選的核心分子是否能較好地區(qū)分CRC 患者預后，利用基因表達譜交互分析（Gene ExpressionProfilingInteractive Analysis，GEPIA）網(wǎng)站（http://gepia.cancer-pku.cn/）分析癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中核心基因在各個腫瘤及其正常組織中的表達情況。利用R2 平臺（https://hgserver1.amc.nl/cgi-bin/r2/main.cgi/）驗證核心基因預后。 利用CancerSEA 網(wǎng)站[11]（http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/）中所包含的CRC 單細胞數(shù)據(jù)集分析核心基因可能所涉及的功能。利用TIMER網(wǎng)站（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）分析核心基因與免疫細胞關聯(lián)性，進一步分析核心分子可能所涉及通路。

1.2.5 GSE192667 和GSE24549 數(shù)據(jù)集驗證核心分子并構(gòu)建生存風險模型

利用GEO 數(shù)據(jù)庫中的GSE192667 和GSE24549數(shù)據(jù)集，驗證核心分子在外部數(shù)據(jù)集中能否有效預測CRC 患者預后。 利用COX 多因素分析計算核心分子在GSE192667 數(shù)據(jù)集患者中風險評分， 并據(jù)此計算每個樣本的風險評分；基于風險評分將患者平均分為高風險組和低風險組。 同時利用該評分系統(tǒng)應用于GSE24549 數(shù)據(jù)集中，再進行后續(xù)分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 7.0、SPSS 24.0 和R（4.0.1）軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和作圖。 t 檢驗用來分析兩組間平均數(shù)的差異。X-tile 軟件基于生存分析結(jié)果對核心基因選取最佳截點，Kaplan-Meier（K-M）曲線分析患者預后。 P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 健康人群和結(jié)直腸癌患者差異基因及GO 功能和KEGG 分析

外泌體數(shù)據(jù)庫中共含有118 例健康人血清外泌體測序數(shù)據(jù)及35 例CRC 患者。 其中CRC 患者較健康人群上調(diào)基因有5078 個， 下調(diào)基因有13004 個，以P ＜0.05 及差異倍數(shù)大于1.5 篩選共獲得了上調(diào)基因有600 個，下調(diào)基因有1175 個（圖1A、B）。 對所有差異基因進行GO 功能和KEGG 通路分析， 發(fā)現(xiàn)CRC 患者其差異基因主要富集于細胞周期、RNA 可變剪接及RNA 修飾過程等（圖1 C、D）。

圖1 CRC 患者和健康人差異基因分析Fig.1 Differential gene analysis diagrams of CRC patients and healthy

2.2 基于WGCNA 篩選血清外泌體中核心模塊及核心基因并初步驗證

2.2.1 核心模塊與核心基因

基于WGCNA 獲得其軟閾值為3（圖2A、B），共獲得了7 個模塊及其相應模塊貢獻度（圖3A），并據(jù)此認為RED（紅色）模塊為最相關模塊。紅色模塊中共包含70 個基因，基于GO 和KEGG 分析了其可能涉及的功能和通路（圖3B），紅色模塊基因可能細胞凋亡階段負調(diào)控、受體活性負調(diào)控及核轉(zhuǎn)錄mRNA 的調(diào)控。

圖2 軟閾值篩選圖（A）和WGCNA 模式圖（B）Fig.2 Diagrams of soft threshold screening(A)and WGCNA pattern(B)

圖3 基因模塊熱圖（A）、紅色模塊GO 分析（B）和紅色模塊KEGG 分析（C）Fig.3 Diagrams of gene module thermography(A),red module GO analysis(B)and red module KEGG analysis(C)

紅色模塊中共有70 個基因（圖4A、B），從中篩選其差異基因，按照P ＜0.05，CRC 患者比健康人群上調(diào)有6 個、下調(diào)有10 個。為尋找紅色模塊中核心基因，基于PPI 分析及Cytoscape 軟件中自帶算法（圖4C），計算各基因之間DEGREE Score（≥4），同時計算MOCDE Score（≥1）和Closeness Score（≥10），最終共有15個基因位于核心位置（圖4D）。 并繼續(xù)與上調(diào)差異基因合并分析，發(fā)現(xiàn)甘油醛3-磷酸脫氫酶基因（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene，GAPDH）和微管蛋白α-1B 基因（tubulin alpha 1b gene，TUBA1B）兩個基因可能可以預測CRC 發(fā)生。因此，擬進一步探討并驗證上述基因在預測CRC 發(fā)生的有效性。

圖4 紅色模塊中健康人群和CRC 患者差異基因分析Fig.4 Diagrams of differential gene analysis in red module between CRC patients and healthy

2.2.2 初步驗證

為明確所篩選的基因是否在CRC 患者及健康人群中存在差異， 進一步分析了上述2 個基因在CRC患者與健康人群間差異（圖5），其中GAPDH 在健康人群中的表達值為636.60±13.68，在CRC 患者中表達值為815.50±40.88 （P ＜0.01）；TUBA1B 在健康人群中的表達值為1546.00±33.22， 在CRC 患者中表達值為1758.00±60.16（P ＜0.01）。同時，受試者工作特性（receiver operating characteristic，ROC）曲線被用于分析上述2 個基因能否預測CRC 的發(fā)生 （圖5），GAPDH 和TUBA1B 能較好地區(qū)分CRC 患者和健康人群[GAPDH：曲線下面積（area under curve，AUC） =0.69，P ＜0.01；TUBA1B：AUC = 0.73，P ＜0.01]。 上述結(jié)果證實，利用WGCNA 結(jié)合PPI 所篩選的基因能較好地區(qū)分CRC 和健康人群。

圖5 核心基因在CRC 和健康人群中驗證Fig.5 Diagrams of hub gene verified in CRC patients and healthy

2.3 外部數(shù)據(jù)庫驗證核心基因表達及預后

為驗證所篩選的核心基因是否在CRC 組織和癌旁組織中存在差異表達，利用TCGA 數(shù)據(jù)庫中所含有的多種腫瘤數(shù)據(jù)集驗證核心基因在不同腫瘤組織及其正常組織中表達差異 （圖6），GAPDH 和TUBA1B在CRC 和直腸癌中均較癌旁組織表達高（P ＜0.05）。同時在其他腫瘤中，也發(fā)現(xiàn)了GAPDH 和TUBA1B 在多個腫瘤中呈現(xiàn)高表達，該結(jié)果進一步佐證了試驗所篩選的基因具有較大的預測意義。為進一步明確核心基因GAPDH 和TUBA1B 是否與CRC 預后相關，對R2 分析平臺中CRC 患者數(shù)據(jù)分析（圖7C ～H），高表達GAPDH 和TUBA1B 患者其預后較低表達患者更差。上述結(jié)果進一步證實了實驗所篩選的基因具有較好的預測意義。

圖6 GAPDH（A）和TUBA1B（B）在TCGA 數(shù)據(jù)庫中不同腫瘤組織中癌組織和癌旁組織中表達差異Fig.6 Diagrams of differences expression between GAPDH(A) and TUBA1B(B) for different tumor tissues and adjacent tissues in TCGA database

圖7 外部數(shù)據(jù)庫驗證核心基因GAPDH 和TUBA1B 在R2 平臺與CRC 患者預后分析Fig.7 Diagrams of validation hub genes GAPDH and TUBA1B in R2 platform and prognosis analysis of CRC patients in external database

2.4 GSE192667 和GSE24549 數(shù)據(jù)集驗證核心基因并構(gòu)建生存風險模型

2.4.1 K-M 生存分析驗證

利用GEO 數(shù)據(jù)庫中GSE192667 和GSE24549 數(shù)據(jù)集所含有的CRC 患者基因表達譜數(shù)據(jù)及預后信息，對所獲得的基因GAPDH 和TUBA1B 驗證其與預后關聯(lián)。 其中GSE192667 數(shù)據(jù)集中含有89 例CRC患者數(shù)據(jù)，GSE24549 數(shù)據(jù)集中含有83 例CRC 患者數(shù)據(jù)。 依據(jù)X-tile 軟件選取基因最佳截點，并進行K-M生存分析。 結(jié)果顯示，在GSE24549 中，GAPDH 低表達患者較高表達患者無病生存期更長（P ＜0.01），TUBA1B 低表達患者較高表達患者無病生存期更長，但差異無統(tǒng)計學意義（P = 0.17）；在GSE192667 中，GAPDH 和TUBA1B 低表達患者較高表達患者無病生存期更長（P ＜0.01）。 見圖8。

圖8 核心基因在GSE24549 數(shù)據(jù)集和GSE192667 數(shù)據(jù)集中患者K-M 生存分析Fig.8 Patient K-M survival analysis curves of hub genes in GSE24549 dataset and GSE192667 dataset

2.4.2 生存風險分析

為更好地對CRC 患者進行分層管理，對GSE192667 患者進行多因素COX 分析并據(jù)此結(jié)果構(gòu)建生存風險模型（圖9），生存風險模型得分=GAPDH表達量×0.0015+TUBA1B 表達量×（-0.0002）。 據(jù)此獲得每例患者的評分，并依據(jù)上述評分將患者分為高風險組和低風險組。 據(jù)此對GSE192667 患者進行預后分析（圖10A），高風險組預后更差（P ＜0.01）。 同時，進一步驗證該模型，在GSE24549 數(shù)據(jù)集中，高風險組預后較低風險組差（圖10B。 P ＜0.01）。

圖9 基于核心基因構(gòu)建生存風險模型Fig. 9 Diagram of construction risk score model based on hub genes

圖10 生存風險模型在GSE192667 數(shù)據(jù)集和GSE24549 驗證Fig. 10 Curves of survival risk model verified on GSE192667 dataset and GSE24549

2.5 外部數(shù)據(jù)集及GSEA 探索核心基因可能涉及通路和功能

為探索核心基因GAPDH 和TUBA1B 可能所涉及的功能和通路， 用CancerSEA 網(wǎng)站中所包含的CRC 單細胞數(shù)據(jù)集分析核心基因與其相關細胞功能（圖11）。 TUBA1B 可能涉及了細胞周期、細胞增殖、DNA 修復及細胞干性；GAPDH 可能涉及了侵襲、DNA 修復及血管生成。 同時，利用基因集富集分析法（gene set enrichment analysis，GSEA）分析外泌體數(shù)據(jù)集中核心基因可能所涉及的通路。 其中TUBA1B 可能涉及藥物代謝酶P450、 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（nucleotide binding oligomerization domain，NOD）樣受體通路和膀胱癌通路（圖12）。GAPDH 可能涉及血管內(nèi)皮生長因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF） 信號通路、CRC 信號通路和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路（圖13）。 同時利用TIMER 網(wǎng)站分析核心基因與免疫細胞關聯(lián)性（圖14），GAPDH 可能涉及了B 細胞、巨噬細胞（P ＜0.05）。 而TUBA1B 在結(jié)腸癌和直腸癌中并未獲得一致結(jié)果（P ＞0.05）。

圖11 CancerSEA 網(wǎng)站探索核心基因可能相關細胞功能Fig.11 Diagrams of exploring hub genes possibly related cellular function in CancerSEA website

圖12 GSEA 分析TUBA1B 所涉及通路Fig.12 Diagrams of TUBA1B involved pathways by GSEA

圖13 GSEA 分析GAPDH 所涉及通路Fig.13 Diagrams of GAPDH involved pathways by GSEA

3 討論

近年來CRC 的發(fā)病率和死亡率在中國逐年提升[12]，由于CRC 患者前期無明顯典型癥狀，大部分患者發(fā)現(xiàn)時即為中晚期，導致了其預后較差[1，13]。目前國內(nèi)外指南推薦針對CRC 患者的篩查主要為糞便隱血檢查及電子結(jié)腸鏡。 但由于準確度及可接受度導致CRC 篩查難以推廣應用。 因此尋找更精準及無創(chuàng)的篩查方法將對CRC 早診做出巨大的貢獻。近年來，飛速發(fā)展的液體活檢技術(shù)為臨床對腫瘤患者的篩查提供了巨大的可能。其主要是基于腫瘤形成后分泌一部分特殊物質(zhì)，包括但不限于外泌體、細胞因子等?；跈z測上述特殊物質(zhì)，將可能使得針對普通人群可以進行快速而有效的篩查。 基于此，筆者利用血清外泌體數(shù)據(jù)庫中健康人群和CRC 患者的血清外泌體測序數(shù)據(jù)，結(jié)合WGCNA 和PPI 篩選基于血清外泌體的核心診斷標志物GAPDH 和TUBA1B。 同時利用了多個外部公共數(shù)據(jù)庫驗證了核心基因GAPDH 和TUBA1B在腫瘤組織中較正常組織高表達， 以及高表達GAPDH 和TUBA1B 基因與更差的預后相關。 同時，并分析了核心基因其可能所涉及的細胞功能和通路，為后續(xù)進一步研究打下了堅實的基礎。 綜上所述，所篩選獲得的GAPDH 和TUBA1B 基因可以有效地預測CRC 發(fā)生及預后，可以作為CRC 有效的血清外泌體分子標志物。

目前針對CRC 患者常用的腫瘤標志物是癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA），但不可否認的是，其由于受到多種因素的影響，準確度仍受限[14，15]。因此尋找更為精準的血清學標志物將為CRC 的診斷和隨訪提供較大的幫助。外泌體是一類直徑在30 ～100 nm的小囊泡，其通過胞膜內(nèi)陷形成囊泡，并將其釋放至細胞基質(zhì)中，達到傳遞信息的作用[16，17]。外泌體其內(nèi)包含mRNA、非編碼RNA、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)等多種成分，這些成分在外泌體磷脂雙分子層包裹下有更強的穩(wěn)定性[18，19]。 目前已有研究提示腫瘤細胞其可以通過釋放外泌體入血達到調(diào)控全身反應作用[20，21]，同時，也有研究提示血清外泌體可以作為有效的分子標志物預測多種腫瘤的發(fā)生和預后等[18，22，23]。 因此基于液體活檢技術(shù)檢測血清外泌體中某些特殊標志物將對篩查CRC 患者有重要的臨床意義。 筆者研究基于該思想，利用血清外泌體數(shù)據(jù)庫分析CRC 患者及健康人群的血清外泌體測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)GAPDH 和TUBA1B 可以作為有效的分子標志物。 同時，利用外部公共數(shù)據(jù)庫驗證了GAPDH 和TUBA1B 基因在TCGA 數(shù)據(jù)庫中不同腫瘤和癌旁組織中以高表達為主， 其中在結(jié)腸癌和直腸癌中均獲得了一致的結(jié)果， 同時在R2 生存平臺中也獲得了相應的驗證， 高表達GAPDH 和TUBA1B 基因患者預后更差。

甘油醛3-磷酸脫氫酶 （glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）是一種在糖酵解過程中關鍵的調(diào)控酶，參與了糖酵解過程中多個調(diào)控過程[24]。GAPDH 作為應用非常廣泛的管家基因， 常被用于基因表達水平分析的內(nèi)部控制。 現(xiàn)有較多研究提示，GAPDH 參與了體內(nèi)的一系列生物調(diào)控過程， 包括膜融合和運輸、細胞凋亡、DNA 修復、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、自噬等[18，25～29]。 現(xiàn)也有研究提示，GAPDH 表達失調(diào)可能與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關，如腎癌[30]、乳腺癌[31]和鼻咽癌[32]。筆者研究也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，GAPDH 在CRC患者血清外泌體中較健康人群高表達。同時在多個外部數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)了GAPDH 在CRC 患者中高表達，且高表達患者預后差。并基于單細胞數(shù)據(jù)庫及免疫細胞分析發(fā)現(xiàn)GAPDH 基因表達失調(diào)在CRC 患者中可能通過影響VEGF 信號通路、CRC 信號通路和MAPK信號通路導致了細胞周期、細胞增殖、DNA 修復等細胞功能發(fā)生異常，從而導致了腫瘤的發(fā)生和進展。

微管蛋白α-1B（tubulin alpha 1b，TUBA1B）是屬于微管蛋白的亞型之一，微管蛋白是細胞骨架的主要成分，有5 種不同形式，其是調(diào)節(jié)細胞形狀、細胞黏附、細胞運動、復制和分裂、驅(qū)動細胞內(nèi)有絲分裂和運輸?shù)募毎羌茉33，34]。 目前已有部分研究顯示，TUBA1B 作為癌基因參與調(diào)節(jié)了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后[35～38]。筆者研究結(jié)果也提示TUBA1B 在CRC中作為癌基因， 在CRC 患者血清外泌體及腫瘤組織中高表達， 同時高表達TUBA1B 與更差的CRC 患者預后相關。 基于單細胞數(shù)據(jù)庫及免疫細胞分析發(fā)現(xiàn)TUBA1B 基因表達失調(diào)在CRC 患者中可能通過影響藥物代謝酶P450、NOD 樣受體通路和膀胱癌通路導致了侵襲，DNA 修復及血管生成細胞功能發(fā)生異常，從而導致了腫瘤的發(fā)生和進展。 為更好地對CRC 患者進行分層管理， 筆者基于GSE192667 數(shù)據(jù)集利用了生存風險模型，并在內(nèi)部和外部均獲得了較好的驗證。 綜上所述，從內(nèi)部、外部，利用多種方法驗證了筆者所篩選的基因作為有效的分子標志物的可靠性，其可能為CRC 患者的早期篩查及預后隨訪提供較大的幫助。

據(jù)筆者所知， 目前基于血清外泌體篩選CRC 患者有效的分子標志物文獻報道較少。筆者利用血清外泌體數(shù)據(jù)庫分析了CRC 患者較健康人群在血清外泌體中主要涉及了細胞周期、RNA 可變剪接及RNA 修飾過程等。 基于WGCNA 和PPI 篩選獲得了GAPDH和TUBA1B，并利用內(nèi)部血清外泌體數(shù)據(jù)庫及外部多個公共數(shù)據(jù)庫從多角度驗證了上述基因在CRC 患者中的有效性。但筆者研究作為一項臨床前的探索性研究，其應用價值尚需進一步在多中心大樣本的臨床隨機試驗中獲得驗證。