丹參酰-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯單晶的制備及其結構表征

胡婭琪 ，魏媛媛，楊寬 ，楊莉寧，余麗麗，秦蓓*

1.西安醫(yī)學院 西安市多靶協(xié)同抗高血壓創(chuàng)新藥物研制重點實驗室 西安市智創(chuàng)抗高血壓藥物國際科技合作基地，陜西西安 710021

2.西安醫(yī)學院 藥物研究所，陜西 西安 710021

3.西安醫(yī)學院 藥學院，陜西 西安 710021

目前在高血壓的治療方面，血管緊張素轉化酶抑制劑（ACEI）類抗高血壓藥物是一種普遍使用的藥物[1-2]，該類藥物不僅降壓效果良好，還具有擴張冠脈血管、增加心肌供血量以及有效改善腎臟血流量的作用，但存在偶發(fā)刺激性干咳的問題[3]?；谝陨蠁栴}，本課題組設計合成了以卡托普利為母核，以冰片為初始原料，引入丹參素，采用組合分子化學的策略，通過縮合酯化、脫保護、酰胺化、脫保護、酰胺化合成了由丹參酚、冰片和ACEI 母核組成的創(chuàng)新實體分子丹參酰-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯（圖1），并進行了相關研究[4-5]，結果表明目標分子丹參酰-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的安全性好，具有與卡托普利相當?shù)慕祲盒Ч团K器保護作用，能夠減緩普利類藥物普遍存在的干咳反應[5]。由于藥物理化性質受立體化學結構如分子結構的構型、構象、分子作用力等各種因素的影響，因此確定其立體結構尤其重要[6]。丹參酰-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的結構經(jīng)1H-NMR、13C-NMR、高分辨質譜確證，質量分數(shù)大于99.5%，但是其立體構型尚未確證。X 射線單晶衍射技術可以提供藥物分子的三維立體結構信息，確定手性藥物分子絕對構型、分子立體結構中差象異構體[7-8]。通過對不同培養(yǎng)條件的摸索和考察，培養(yǎng)該藥物的單晶，并進行X 射線單晶衍射測試，可以確定其立體構型。本文根據(jù)丹參酰-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的理化性質，通過常溫溶劑揮發(fā)法，在醋酸乙酯-水雙溶劑體系中獲得透明度較高、形狀較規(guī)則的單晶，并解析其空間結構，進行了晶型分析和熱穩(wěn)定性分析。

圖1 丹參酰-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的化學結構Fig.1 Chemical structure of tanshinol acyl-L-alanyl-Lproline bornyl ester

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Bruker D8 VENTURE 單晶衍射儀（德國Bruker公司），N-125 生物顯微鏡（永新光學股份有限公司），Bruker D8 Advance X 射線衍射儀（德國Bruker公司），同步熱分析儀（瑞士Mettler TGA/DSC3+）。

1.2 試劑

丹參酰-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯由實驗室自制，樣品經(jīng)HPLC 法測定質量分數(shù)為99.73%，產(chǎn)品批號 220615；水為超純水，醋酸乙酯、正己烷、石油醚、甲苯等均為天津市天力化學試劑有限公司提供的分析純試劑。

2 方法與結果

2.1 單晶的培養(yǎng)

根據(jù)丹參酰-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的理化性質，參考溶解度試驗結果，由于單溶劑培養(yǎng)體系未得到理想的晶體，因此對良溶劑/不良溶劑雙溶劑培養(yǎng)體系進行了考察，見表1。

表1 單晶培養(yǎng)條件Table 1 Culturing condition of single crystal

良溶劑選擇醋酸乙酯，不良溶劑選擇正己烷、水、甲苯、石油醚。良溶劑和不良溶劑體積比例為1∶2，藥物質量濃度范圍為5～50 mg/mL。將上述各溶液置于室溫條件下緩慢揮發(fā)，比較不同溶劑體系中單晶培養(yǎng)的結果。發(fā)現(xiàn)醋酸乙酯-正己烷體系揮發(fā)5 d 所得結晶為白色毛狀固體。醋酸乙酯-水體系18 d 析出結晶為無色透明晶體，可用于X 射線單晶衍射檢測。

2.2 單晶的結構確證

丹參酰-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯晶體呈現(xiàn)無色透明針狀，衍射分析所用晶體為0.13 mm×0.12 mm×0.1 mm，Cu Kα 輻射為光源，在204 K 溫度下進行衍射數(shù)據(jù)收集，檢測到衍射點為35 960 個（3.772°≤2θ≤179.29°），獨立衍射點為9 530 個，最終的R1＝0.089[I＞2σ(I)]，wR2＝0.268 8。

如表2 所示，最終確定該單晶屬于單斜晶系，空間群為P21，晶胞參數(shù)：a＝14.385 5(15) nm，b＝7.836 8(8) nm，c＝23.452(3) nm，α＝90°，β＝92.578(9)，γ＝90°，晶胞體積V＝2 641.2(5) nm3，晶胞內(nèi)分子數(shù)Z＝4。不對稱單位化學計量式為C27H38N2O7，計算單個分子的相對分子質量為502.59，計算結晶密度為1.264 g/cm3。原子坐標和等價各向同性位移參數(shù)見表2，扭轉角數(shù)據(jù)見表3，鍵長數(shù)據(jù)見表4，單晶分子立體結構見圖2，分子晶胞堆積圖見圖3。

表2 原子坐標參數(shù)和等價各向同性位移參數(shù)Table 2 Atomic coordinates and equivalent temperature factor

表3 成鍵原子的扭轉角數(shù)據(jù)Table 3 Torsion angles data of bonded atoms

表4 成鍵原子的鍵長數(shù)據(jù)Table 4 Bond lengths of bonded atoms

圖2 丹參酰-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的立體結構Fig.2 Stereostructure of tanshinol acyl-L-alanyl-L-proline bornyl ester

圖3 丹參酰-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的晶胞堆積圖Fig.3 Cell stacking diagram of tanshinol acyl-L-alanyl-Lproline bornyl ester

通過單晶表征結果可見1 個晶胞由4 個分子組成，如表5 所示，氫鍵主要存在于分子間，以常見的O—H·····O 相連，1 個分子的丹參酰結構的酚羥基與另1 個分子丹參酰結構的羰基氧頭尾相接形成氫鍵作用（O1—H1·····O42，O8—H8·····O113），1 個分子的丹參酰結構的醇羥基和另1 個分子的L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的羰基氧頭尾相接形成氫鍵作用（O3—H3·····O54，O10—H10·····O121），形成了一維鏈。一維鏈通過分子間氫鍵形成二維鏈，進一步通過二維鏈分子間氫鍵作用形成三維空間網(wǎng)狀結構。

表5 氫鍵的鍵長和鍵角Table 5 Data of hydrogen bond

單晶解析結果表明分子中存在6 個手性碳原子，分別為C8、C10、C16、C18、C20和C23，其中C8、C20和C23絕對構型為R構型，C10、C16和C18絕對構型為S構型，F(xiàn)lack 參數(shù)為0.00(13)，繼而證明絕對構型正確，并與實際預想結果一致。

2.3 粉末X 射線衍射分析

對丹參酰-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的晶體粉末采用X 射線粉末衍射進行晶型分析，X 射線粉末衍射儀以石墨單器的Cu Kα 輻射為光源，管壓40 kV，管流100 mA，2θ掃描范圍5°～50°，掃描速率9°/min。圖4 為該藥物的實測粉末衍射圖，特征峰位置分別在6.7°、10.6°、11.6°、13.4°、15.1°、16.7°、21.2°，與理論衍射峰大致相同，只是衍射強度稍有差異，因此，該藥物的晶型與采用醋酸乙酯-水雙溶劑體系培養(yǎng)的單晶的晶型基本符合。

圖4 丹參酰-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯X 射線粉末衍射圖Fig.4 X-ray powder diffraction of tanshinol acyl-L-alanyl-L-proline bornyl ester

2.4 熱重分析法（TGA）-差示掃描量熱法（DSC）分析

通過TGA-DSC 進行熱穩(wěn)定性分析，見圖5、6。溫度范圍為30～800 ℃，升溫速率為10 K/min，參比物為Al2O3，氣氛為N2。TGA 結果表明該藥物在30～254 ℃為直線，說明本樣品為非水合物和低沸點溶劑合物，熱穩(wěn)定性較好[9]。當溫度高于254 ℃，樣品發(fā)生分解，峰頂溫度為314 ℃，開始失重，約有79.998 7%的失重。

圖5 丹參酰-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的TGA 圖Fig.5 TGA graph of tanshinol acyl-L-alanyl-L-proline bornyl ester

圖6 丹參酰-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的DSC 圖Fig.6 DSC graph of tanshinol acyl-L-alanyl-L-proline bornyl ester

DSC 結果顯示在146.5～152.3 ℃出現(xiàn)1 個明顯的尖銳吸熱峰，吸收熱量為646.7 mJ，對應該藥物的晶型轉換。在170.4～174.2 ℃出現(xiàn)較弱的吸熱峰，吸收熱量為370.4 mJ，為該藥物熔化形成的吸熱峰，在260.8～305.2 ℃吸收熱量約1 776.5 mJ，出現(xiàn)較強的吸熱峰，對應該藥物的樣品分解峰。與TGA 圖結果一致，為熱失重過程。

3 討論

本實驗采用溶劑揮發(fā)法制備了丹參酰-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的單晶。通過考察單晶培養(yǎng)實驗中體系溶劑的揮發(fā)或擴散速率，使其緩慢析晶，在醋酸乙酯-水雙溶劑體系中能夠得到透明度較高、形狀較規(guī)則的晶體。通過單晶X 射線衍射儀分別對丹參酰-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯晶體空間結構進行了解析。結果表明分子中存在6 個手性碳原子，R、S型各有3 個碳原子。分子間存在氫鍵，晶體分子以氫鍵作用維持其空間排列。丹參酰-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯單晶衍射預測的X 射線粉末衍射與實際測得的圖譜一致，熱分析技術對其進行了穩(wěn)定性和晶型表征，為丹參酰-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的進一步開發(fā)提供了參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突