酶水解柴胡皂苷B1 制備稀有前柴胡皂苷A 的研究

徐天真，吳夢茹，邵佳麗，常 悅，朱燁婷，陳季璇，陳璐陽，陳登艷，楊 歡，夏國華*

（1.如皋市人民醫(yī)院藥劑科，江蘇 如皋 226500； 2.南通大學附屬如皋醫(yī)院藥劑科，江蘇 如皋 226500；3.江蘇大學藥學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

中藥柴胡是傘形科植物柴胡BupleurumchineseDC.或狹葉柴胡B.scorzonerifoliumWilld.的干燥根，分別習稱“北柴胡” 和“南柴胡”［1］，用藥歷史悠久，始載于《神農本草經(jīng)》，性辛、苦，微寒，具有疏散退熱，疏肝解郁，升舉陽氣等功效。柴胡皂苷是柴胡的主要有效成分，具有抗腫瘤、抗炎等藥理作用［2-5］，其齊墩果烷型分子結構較大，限制了其通過口服吸收進入體循環(huán)。前柴胡皂苷A 是柴胡皂苷B1脫除一分子葡萄糖基后的次級苷［6-8］。現(xiàn)代藥理研究表明，前柴胡皂苷的藥理活性高于其原生苷［9］，且更易被小腸吸收，因此研究者圍繞該類中藥活性成分的制備技術開展了一些研究，主要有化學法、微生物轉化法［10-12］。但是由于其在原植物中的含量很低，傳統(tǒng)色譜分離手段難以大量制備； 化學法的副產(chǎn)物較多且廢水污染嚴重； 微生物轉化法亦存在副產(chǎn)物較多、反應條件難以控制等不足；而酶水解法反應條件溫和，特異性強，已被廣泛地應用于多種中藥苷類活性成分的轉化反應［13-16］。因此，本文通過酶水解柴胡皂苷B1獲取前柴胡皂苷A，進而采用單因素和響應面實驗對水解條件進行考察及優(yōu)化，建立了關鍵技術，從而為大量制備前柴胡皂苷系列成分以開展藥理藥效研究奠定基礎。

1 材料

HP1100 型高效液相色譜儀（HPLC，美國Agilent 公司）； HRQ-3110 型渦旋混勻器（美國Silentshake 公司）；85-2 型控溫磁力攪拌儀（江蘇金怡儀器科技有限公司）；AL-104 型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）； LXQ型電噴霧質譜（ESI-MS，美國Thermo Fisher Scientific 公司）； Advance Ⅱ型核磁共振儀（NMR，400 MHz，德國Bruker 公司）。

柴胡皂苷B1（純度≥98.0%，批號18041708）由成都普非德生物技術有限公司提供。乙腈為色譜純（美國Omni公司）； 甲醇、乙酸、乙酸鈉均為分析純（國藥集團上海化學試劑有限公司）。β-葡聚糖苷酶（活力≥20 000 U／g）購自江蘇金穗生物科技有限公司； β-葡萄糖苷酶（活力100 U／g）購自江蘇銳陽生物科技有限公司； 纖維素酶（活力≥15 000 U／g，批號20190719）購自國藥化學試劑有限公司； 柚苷酶（活力100 000 U／g，批號208008）由河南百康化工產(chǎn)品有限公司提供； 蝸牛酶（批號S20200421）購自合肥博美生物科技有限責任公司。

2 方法

2.1 色譜條件 Kromasil-C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0 ～10 min，35% ～50% A； 10 ～20 min，50% ～60% A； 20 ～25 min，60% ～35% A）； 體積流量1.0 mL／min； 柱溫30 ℃； 檢測波長250 nm； 進樣量20 μL。

2.2 標準曲線 精密稱取柴胡皂苷B1對照品9.840 mg，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，得到質量濃度0.984 0 mg／mL 的對照品儲備液。按照二倍稀釋法制備得到一系列對照品溶液，0.20 μm PTFE 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，在“2.1” 項色譜條件下測定。以柴胡皂苷B1質量濃度為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得方程為Y＝42.343X＋8.615 9 （R2＝0.999 1），在0.120 1～123.0 μg／mL 范圍內線性關系良好。

2.3 酶水解柴胡皂苷B1分別吸取柴胡皂苷B1溶液和酶溶液（0.20 mol／L HAc-NaAc 緩沖液）置于離心管中，在一定溫度下孵育一段時間。待反應結束后，向水解液中加入等體積甲醇，渦旋混勻。12 000 r／min 高速離心10 min，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液用于HPLC 分析，以不加酶的反應體系為空白對照。

2.4 單因素試驗 以柴胡皂苷B1轉化率為指標，采用單因素實驗考察了水解酶（β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖苷酶、纖維素酶、蝸牛酶）、緩沖液pH （3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）、酶-底物質量比（0.5 ∶1、1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1、5 ∶1、10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1）、反應溫度 （30、40、50、60、70 ℃）和反應時間（12、24、36、48、60、72 h）對酶水解柴胡皂苷B1轉化率的影響。

2.5 Box-Behnken 響應面法 在單因素試驗的基礎上，以柴胡皂苷B1轉化率為響應值，進行響應面實驗設計（Design-Expert v8.0.6.1）； 此外，對預測所得最佳反應條件進行驗證，并考察實際值與預測值的相對誤差。響應面實驗設計因素及水平見表1，模型回歸方程為Y＝β0＋。式中Y為柴胡皂苷的轉化率，β0為攔截系數(shù)，βi為線性項，βii為二次項，βij為交互項，Xi、Xj為自變量編碼值（i≠j，i，j＝1，2，3，……，k）。

表1 因素水平

2.6 酶解產(chǎn)物的結構鑒定 酶水解結束后，通過反相柱層析對酶解產(chǎn)物進行純化，并采用LC-MS、1H-NMR 和13CNMR 對其化學結構進行鑒定。

3 結果

3.1 HPLC 色譜圖 按“2.1” 項下HPLC 分析條件對前柴胡皂苷A、柴胡皂苷B1及其酶解液進行分析。如圖1 所示，柴胡皂苷B1及其水解產(chǎn)物前柴胡皂苷A 均能得到較好地分離（R＞1.5）。

圖1 柴胡皂苷B1 對照品（A）、前柴胡皂苷A 對照品（B）和柴胡皂苷B1 酶解液（C）的HPLC 色譜圖（250 nm）

3.2 單因素試驗結果

3.2.1 水解酶 如圖2 所示，4 種酶均可以選擇性地脫去柴胡皂苷B1末端的葡萄糖，生成前柴胡皂苷A，其中蝸牛酶所得的轉化率遠高于其他3 種酶。這可能是由于蝸牛酶含有纖維素酶、β-D-葡糖糖苷酶、淀粉酶、蛋白酶等20 多種酶，其中的一些酶對葡萄糖苷鍵具有較強的水解作用。相比單一酶來說，蝸牛酶這種復合酶對于葡萄糖苷鍵的水解更有優(yōu)勢。因此，在后續(xù)實驗中選擇了蝸牛酶。

圖2 不同濃度水解酶對柴胡皂苷B1 轉化率的影響

3.2.2 酶／底物質量比 如圖3A 所示，當質量比由4 ∶1提高到30 ∶1 時，轉化率從94%增加至99%，繼續(xù)提高質量比，則轉化率變化不明顯。因此，最佳酶／底物質量比為30 ∶1。

圖3 單因素對柴胡皂苷B1 轉化率的影響

3.2.3 緩沖液pH 如圖3B 所示，在pH3.0～4.5 范圍內，隨著緩沖液pH 升高，轉化率逐漸升高，并在pH4.5 時達到最高值99.5%，但是將pH 進一步提高至5.5 后，轉化率明顯下降，當pH 為6.5 時，轉化率僅為81.2%。因此，最佳緩沖液pH 值為4.5。

3.2.4 反應溫度 如圖3C 所示，蝸牛酶對柴胡皂苷B1的轉化效果隨著溫度的升高呈現(xiàn)先增加后減弱的趨勢，并在60 ℃時達到最大值； 當溫度繼續(xù)升高時，酶蛋白開始變性失活，導致轉化率下降。因此，最佳反應溫度為60 ℃。

3.2.5 反應時間 如圖3D 所示，柴胡皂苷B1被蝸牛酶水解12 h 之后，轉化率可達95%，延長水解時間至24 h，轉化率可進一步提高到99%； 此后，轉化率保持平穩(wěn)。綜合考慮柴胡皂苷B1轉化率和節(jié)約時間，選擇24 h 作為最佳酶水解時間。

3.3 響應面試驗結果

3.3.1 回歸方程及顯著性分析 通過Box-Behnken 響應面實驗設計考察了緩沖液pH （X1）、反應溫度（X2）和反應時間（X3）對柴胡皂苷B1轉化率的影響，實驗結果見表2。

表2 響應面實驗設計與結果

將以上所得數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得到擬合方程Y＝97.76 ＋0.36X1- 2.20X2＋1.12X3＋5.51X1X2- 0.17X1X3＋0.90X2X3-3.37X21- 3.75X22＋2.20X23。此外，以轉化率為響應值對各因素的顯著性進行分析（表3），P＜0.000 1 且失擬項不顯著，可見所得模型能準確分析和解釋模型中各因素對響應值的影響； 同時，反應溫度的升高不利于轉化率的增加，而較長的反應時間和較高的緩沖液pH 則有利于提升柴胡皂苷B1轉化率。從二次項的P值分析可知，X12（P＝0.0002）、X22（P＜0.0001）、X32（P＝0.0020）均小于0.05，三者對柴胡皂苷B1的轉化率具有顯著性影響。

表3 二階多項回歸方程方差分析

3.3.2 反應時間和緩沖液pH 對柴胡皂苷B1轉化率的影響 反應時間和緩沖液pH 的交互作用見圖4。當體系中pH為4.5 時，隨著反應時間的增加，柴胡皂苷B1轉化率緩慢上升后趨于穩(wěn)定； 當反應時間為24 h 時，轉化率隨著pH值的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，pH 偏高或偏低時會影響蝸牛酶與底物的結合，降低反應速率。

圖4 交互項（反應時間和緩沖液pH）對柴胡皂苷B1轉化率的影響

3.3.3 反應溫度和緩沖液pH 對柴胡皂苷B1轉化率的影響 反應溫度和緩沖液pH 的交互作用見圖5。當反應溫度為60 ℃時，隨著體系中pH 升高，柴胡皂苷B1轉化率先上升后下降； 當pH 4.5 時，轉化率隨著溫度的升高呈現(xiàn)出相同的趨勢，即先增加后降低，表明反應溫度和緩沖液pH 過高或過低均不利于酶水解反應的進行。

圖5 交互項（反應溫度和緩沖液pH）對柴胡皂苷B1轉化率的影響

3.3.4 反應溫度和反應時間對柴胡皂苷B1轉化率的影響 反應溫度和反應時間的交互作用見圖6。當反應溫度為60 ℃時，隨著反應時間的增加，柴胡皂苷B1轉化率先上升后趨于穩(wěn)定； 當反應時間為24 h 時，轉化率隨著溫度的升高先增加后迅速降低。

3.3.5 最佳水解條件及驗證試驗 通過Design-expert 8.0.6.1 軟件優(yōu)化后得到蝸牛酶水解柴胡皂苷B1的最佳反應條件為反應溫度55.78 ℃，反應時間33.24 h，緩沖液pH

圖6 交互項（反應溫度和反應時間）對柴胡皂苷B1轉化率的影響4.36，并對其進行驗證，考慮到實驗的實際可操作性，將水解條件調整為反應溫度56 ℃，反應時間33 h，緩沖液pH 4.5； 在此條件下，3 次平行實驗所得的柴胡皂苷B1轉化率為99.1%，與預測值100.2%基本相符，表明優(yōu)化得到的酶水解條件與實際擬合度較好。

3.4 酶解產(chǎn)物的結構鑒定 ESI-MSm／z：641［M＋Na］＋。1H-NMR （400 MHz，DMSO-d6）δ：0.58 （s，24-CH3），0.66 （s，26-CH3），0.73 （s，29-CH3），0.84（s，25-CH3），0.90 （s，30-CH3），0.93 （s，27-CH3），1.22 （d，H-6′），4.33 （d，H-1′），5.55 （dd，H-11），6.35 （dd，H-12）；13C-NMR （100 MHz，DMSO-d6）δ：38.0（C-1，19），25.5 （C-2），80.3 （C-3），43.0 （C-4），46.6（C-5），18.7 （C-6），32.0 （C-7），40.4 （C-8），54.0 （C-9），36.1 （C-10），126.8 （C-11），125.4 （C-12），135.7（C-13），43.8 （C-14），34.2 （C-15），75.4 （C-16），43.7（C-17），133.2 （C-18），32.6 （C-20），34.8 （C-21），29.7 （C-22），63.1 （C-23），12.9 （C-24），17.7 （C-25），17.2 （C-26），21.9 （C-27），62.8 （C-28），24.9 （C-29），32.4 （C-30），105.2 （3-O-Fuc-C-1′），74.1 （C-3′），71.6（C-2′），71.4 （C-4′），70.2 （C-5′），17.0 （C-6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻［17-18］報道基本一致，故鑒定該化合物為前柴胡皂苷A。

4 結論與討論

本研究基于酶水解構建了從柴胡皂苷B1制備稀有前柴胡皂苷A 的關鍵技術。與傳統(tǒng)酸水解相比，該方法可方便地獲取柴胡次級苷，而不產(chǎn)生柴胡皂苷元副產(chǎn)物； 而且在反應過程中不使用無機酸，因此是一種清潔的水解技術。本文所建立的酶水解關鍵技術，可為大量制備前柴胡皂苷A 以開展藥理藥效研究奠定基礎。

采用單因素和響應面相結合的方法對酶水解條件進行優(yōu)化，并利用LC-MS、NMR 確定產(chǎn)物的化學結構。結果表明，柴胡皂苷B1的最佳水解酶為蝸牛酶，當酶／底物質量比為30 ∶1、酶解反應時間33 h、酶解反應溫度56 ℃、緩沖液pH 4.5 時，柴胡皂苷B1轉化率高達99.1%，產(chǎn)物為前柴胡皂苷A。

中藥活性成分包括三萜類、黃酮類、蒽醌類、甾體類、生物堿類等，是中醫(yī)藥在臨床實踐中發(fā)揮防病治病作用的重要物質基礎，同時也是現(xiàn)代醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中備受關注的藥用分子實體，其新型制備技術是近年來較為活躍的研究領域。本文所構建的酶水解法具有效率高和操作方便等優(yōu)點，利用該技術從天然產(chǎn)物中獲取生物活性化合物（包括次級苷或苷元）具有良好的發(fā)展?jié)摿Α?/p>