金匱腎氣丸對陰陽兩虛型糖尿病腎病患者的臨床療效

王毅強(qiáng)，越東杰，王儷娟，郭 鑫，張承宇，吳飛飛*

（1.長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院，山西 長治 046000； 2.長治醫(yī)學(xué)院，山西 長治 046000）

糖尿病腎臟疾病是糖尿病并發(fā)微血管病變引起的慢性腎臟病，是糖尿病最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥，在我國近20%的2 型糖尿病患者可能有腎病并發(fā)癥［1］，目前已經(jīng)成為慢性腎臟病、終末期腎衰竭的主要病因［2］，傳統(tǒng)西醫(yī)治療效果有限［3］，并被證實(shí)并不能阻礙糖尿病腎臟疾病進(jìn)展為終末期腎臟?。?］，故積極探尋治療糖尿病腎臟疾病的新方法及其機(jī)制以延緩疾病發(fā)生及發(fā)展，對提高糖尿病患者存活率、改善其生活質(zhì)量具有重要意義。

近年來研究表明，腸道菌群失調(diào)與糖尿病腎臟疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，前者有害代謝物尿毒癥毒素和自身成分通過受損的腸道屏障進(jìn)入循環(huán)，觸發(fā)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)通路，最終導(dǎo)致腎組織炎癥、細(xì)胞凋亡、纖維化、腎功能衰退［5］。一些治療糖尿病腎臟疾病的中藥（如腎炎康復(fù)片［6］、清熱消正方［7］等）在改善糖尿病腎臟疾病癥狀、臨床指標(biāo)的同時(shí)，對腸道菌群產(chǎn)生有益的影響，其中金匱腎氣丸可降低糖尿病腎臟疾病患者血糖、血脂、尿蛋白，改善腎功能［8］，可能與抑制氧化應(yīng)激、降低慢性炎癥、保護(hù)腎臟足細(xì)胞、改善慢性纖維化等機(jī)制有關(guān)［9］，但它是否能改善糖尿病腎臟疾病患者腸道菌群，以及對糖尿病腎病的保護(hù)作用是否與改善腸道菌群有關(guān)尚不明確。因此，本研究探討金匱腎氣丸對陰陽兩虛型糖尿病腎病患者的臨床療效，以期為效果中西醫(yī)結(jié)合治療提供新思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2021 年3 月至2021 年11 月收治于長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院的20 例陰陽兩虛型糖尿病腎臟疾病患者，隨機(jī)分為對照組和觀察組，每組10 例。其中，對照組男性6 例，女性4 例； 年齡44～73 歲，平均年齡（60.60±11.67）歲； 平均收縮壓（144.30±19.50）mmHg； 平均舒張壓 （87.70±10.11）mmHg； 平均空腹血糖 （11.93±4.29）mmol／L，而觀察組男性3 例，女性7 例； 年齡46 ～74 歲，平均年齡（60.40±8.58）歲； 平均收縮壓（129.30±11.12）mmHg； 平均舒張壓（78.80±13.42）mmHg； 平均空腹血糖（10.21±3.50）mmol ／L，2 組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批號RT2021067）。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)（糖尿病腎?。﹨⒄铡短悄虿∧I臟疾病診療中國指南》［10］、《中國2 型糖尿病防治指南（2020 年版）》［11］，即典型糖尿病癥狀，有多飲、多尿、多食、消瘦等癥狀，空腹血糖≥7.0 mmol／L 或隨機(jī)血糖≥11.0 mmol／L 或OGTT 2 h ≥11.0 mmol／L 或糖化血紅蛋白≥6.5%，同時(shí)與尿蛋白、腎功能變化存在因果關(guān)系，并排除其他原發(fā)性、繼發(fā)型腎小球疾病及系統(tǒng)性疾病，（1）隨機(jī)尿白蛋白／肌酐比值（UACR）≥30 mg／g，在3 ～6 個(gè)月內(nèi)重復(fù)檢測仍≥30 mg／g； （2）估算腎小球?yàn)V過率（eGFR）＜60 mL／ （min·1.73 m2），持續(xù)3 個(gè)月以上； （3）腎活檢符合糖尿病腎臟疾病病理改變，符合上述情況之一即可確診。

1.2.2 中醫(yī)（陰陽兩虛型）參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》［12］，主證精神萎靡，形寒肢冷，大便泄瀉，陽痿，遺精； 次證面色蒼白無華，倦怠乏力，面目浮腫，腰酸耳鳴； 舌淡，苔白，脈沉遲或沉細(xì)無力。具備主證2 項(xiàng)或主證1 項(xiàng)、次證1 項(xiàng)，結(jié)合舌脈即可辨證。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）符合 “1.2” 項(xiàng)下診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）Mogensen分期Ⅲ期、Ⅳ期（即臨床腎病期），其中Ⅲ期UACR 30～299 mg／g，Ⅳ期ACR＞300 mg／g； （3）年齡30～80 歲，病程6～10 年； （5）可長期隨訪； （5）患者自愿參加本研究，簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）合并原發(fā)性或其他繼發(fā)性腎臟疾病，如診斷明確的腎小球腎炎、IgA 腎病、高血壓腎??；（2）近2 周內(nèi)使用過可能影響臨床結(jié)果評價(jià)的藥物，如抗生素等； （3）近3 個(gè)月或目前口服益生元、益生菌等調(diào)節(jié)腸道菌群的藥物； （4）近6 個(gè)月內(nèi)有糖尿病急性并發(fā)癥或應(yīng)激狀態(tài)； （5）近6 個(gè)月內(nèi)有心肌梗死或卒中史，或存在嚴(yán)重心血管疾病及風(fēng)險(xiǎn)、肝功能異常、血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤； （6）合并泌尿系感染、終末期腎臟病、接受過或正在接受透析治療； （7）對研究藥物有嚴(yán)重禁忌：（8）妊娠期婦女。

1.5 治療手段 對照組采用常規(guī)治療，包括（1）糖尿病腎病飲食教育； （2）適度運(yùn)動； （3）藥物，如胰島素或降糖類藥物降糖、鈣通道阻滯劑類藥物降壓、他汀類藥物調(diào)脂。觀察組在對照組基礎(chǔ)上采用金匱腎氣丸［中國北京同仁堂（集團(tuán)）有限責(zé)任公司，水蜜丸，25 粒（5 g）］，每天2 次。2 組療程均為1 個(gè)月。

1.6 指標(biāo)檢測 治療前，收集一般資料，進(jìn)行常規(guī)生化檢查，計(jì)算中醫(yī)證候評分，采集糞便（置于-80 ℃超低溫冰箱中冷凍保存）。治療后，計(jì)算中醫(yī)證候評分，檢測空腹血糖（FBG）、餐后2 h 血糖（2 hPBG）、甘油三酯（TC）、膽固醇（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、血肌酐（SCr）水平及隨機(jī)尿微量白蛋白／肌酐比值（ACR），采集糞便（置于-80 ℃超低溫冰箱中冷凍保存）。對糞便進(jìn)行微生物多樣性檢測，提取其總基因組DNA，對細(xì)菌16S rRNA 的V3V4 區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增測序，采用QIIME、R 包（v3.2.0）、MEGAN 等軟件進(jìn)行分析，比較2 組糞便微生物組成差異。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，不符合者以［M（P25，P75）］表示，組間比較采用t檢驗(yàn)（正態(tài)分布）或秩和檢驗(yàn)（非正態(tài)分布）； 計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher 檢驗(yàn)。通過QIIME、R 包（v3.2.0）軟件計(jì)算α、β 多樣性，比較2 組腸道菌群差異，雙變量相關(guān)性研究采用Spearman 相關(guān)分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床指標(biāo) 治療后，觀察組中醫(yī)證候評分、舒張壓及FBG、2 hPBG、TC、LDL 水平降低（P＜0.05），HDL 水平升高（P＜0.05），見表1，并且ACR 中位數(shù)降低 （P＜0.05），見表2。治療后，對照組中醫(yī)證候評分及FBG、2 hPBG、TC、LDL 水平降低（P＜0.05），HDL 水平升高（P＜0.05），見表3，并且ACR 中位數(shù)降低（P＜0.05），見表4。另外，治療后，2 組中醫(yī)證候評分、收縮壓、舒張壓比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 治療前后觀察組正態(tài)分布計(jì)量資料比較（x±s，n＝10，1 mmHg＝0.133 kPa）

表2 治療前后觀察組非正態(tài)分布計(jì)量資料比較［M （P25，P75），n＝10］

表3 治療前后對照組正態(tài)分布計(jì)量資料比較（x±s，n＝10，1 mmHg＝0.133 kPa）

表4 治療前后對照組非正態(tài)分布計(jì)量資料比較［M （P25，P75），n＝10］

2.2 腸道菌群差異 將糞便分為A 組（觀察組治療前）、B 組（觀察組治療后）、C 組（對照組治療前）、D 組（對照組治療后），分別采用ACE、Chao、Shannon、Simpson 指數(shù)估計(jì)群落的多樣性，結(jié)果見圖1。由此可知，4 組物種豐富度、多樣性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 4 組腸道菌群Alpha 多樣性指數(shù)

beta 多樣性采用非度量多維尺度分析（NMDS 分析）觀察微生物群落的相似性程度，通過對樣本距離進(jìn)行等級排序來使其在低維空間中的排序盡可能符合彼此之間的距離遠(yuǎn)近關(guān)系，結(jié)果見圖2。

圖2 4 組腸道菌群beta 多樣性

Anosim 檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)組間的差異是否顯著大于組內(nèi)差異，結(jié)果見圖3，可知R＝-0.004＜0，表明組間差異小于組內(nèi)差異；P＝0.52＞0.05，表明差異無顯著性。另外，4 組之間的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)不存在顯著性差異，表明治療前后腸道菌群異質(zhì)性差異較小。

圖3 4 組腸道菌群Anosim 檢驗(yàn)

LEfSe 分析基于線性判別分析（LDA），可用于找出重要的、組間具有顯著差異的物種，本實(shí)驗(yàn)采用該方法找出4組中的顯著菌屬，LDA score 為2，P＜0.05 （Krukal Wallis Anova test、Wilcoxon test），結(jié)果見圖4，可知B 組f_ _Prevotellaceae.g_ _ Prevotella_ 7 菌增加，表明治療后腸道菌群中普雷沃氏菌（Prevotella_ 7）相對豐度升高。

圖4 LDA 值分布柱狀圖

通過16s 測序數(shù)據(jù)進(jìn)行功能預(yù)測，對不同樣品、分組之間在功能上的差異進(jìn)行分析，采用PICRUSt 軟件，基于已測細(xì)菌16S rDNA 信息并比對Greengenes 數(shù)據(jù)庫后近緣物種的OTU 信息，推斷其共同祖先的基因功能譜，同時(shí)對Greengenes 數(shù)據(jù)庫中其他未測物種的基因功能譜進(jìn)行推斷，構(gòu)建古生菌和細(xì)菌域全譜系的基因功能預(yù)測譜，最后將測序得到的菌群組成“映射” 到數(shù)據(jù)庫中，對菌群代謝功能進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果見圖5，可知B 組碳水化合物代謝水平升高，P＝0.038＜0.05，即治療后腸道菌群對碳水化合物代謝功能增強(qiáng)。

圖5 A、B 組腸道菌群功能差異預(yù)測

2.3 相關(guān)性分析 結(jié)果見圖6，可知BMI 及TC、LDL 水平與Lac_ Tyzzerella_ 3 菌群相對豐度呈正相關(guān)，中醫(yī)證候評分、病程、2 hPBG 水平與Chr_ Christensenellaceae_ R-7_group 菌群相對豐度呈正相關(guān)，TC、LDL 水平與Chr_Christensenellaceae_ R-7_ group 菌群相對豐度呈負(fù)相關(guān)。

圖6 腸道菌群與臨床特征、指標(biāo)的聚類熱圖

3 討論

金匱腎氣丸功效滋陰、溫補(bǔ)腎陽、化氣行水、補(bǔ)腎泄邪，方中地黃、山藥、山茱萸滋陰，補(bǔ)脾腎，固精，肉桂引火歸元，附子助火化升腎氣，澤瀉、茯苓、牡丹皮利水，泄邪，全方陰中求陽，得陽助陰，補(bǔ)中有瀉，瀉中寓補(bǔ)，泄而不峻，補(bǔ)而不膩，使陰平陽秘，可治腎虛引起的水腫、消渴、小便不利、腰膝酸軟、形寒肢冷、精神萎靡、倦怠乏力［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，治療1 個(gè)月后觀察組中醫(yī)證候改善、血壓降低程度優(yōu)于對照組，與文獻(xiàn)［14］報(bào)道金匱腎氣丸可改善DKD 患者臨床癥狀、降低血壓一致； 治療后，2 組FBG、2 hPBG、TC、LDL、ACR 降低，HDL 升高，但組間無明顯差異，可能是因?yàn)椋?）西醫(yī)基礎(chǔ)治療掩蓋了金匱腎氣丸改善糖脂代謝作用； （2）本實(shí)驗(yàn)選擇組分固定的中藥制劑，并不能根據(jù)患者個(gè)體化情況靈活調(diào)整，未體現(xiàn)中醫(yī)辨證論治的優(yōu)勢； （3）僅測量空腹血糖、餐后2 h 血糖不能反映血糖控制情況，需進(jìn)行動態(tài)血糖檢測； （4）本研究樣本量小，存在偏倚概率大，但仍以看出金匱腎氣丸在改善中醫(yī)癥狀、降低血壓方面的優(yōu)勢。另外，治療前后2組腸道菌群的α、β 多樣性無明顯差異，表明其豐度、多樣性、異質(zhì)性具有極大相似性，可能是因?yàn)椋?）在當(dāng)前條件下2 組治療方案對患者腸道菌群影響??； （2）治療時(shí)間不足； （3）樣本量小，存在偏倚概率大，并且觀察組腸道Prevotella_ 7 豐度升高。

普氏菌屬是厭氧革蘭氏陰性細(xì)菌，為人類共棲細(xì)菌，它對健康有益與否尚存在爭議［15］，經(jīng)短期膳食纖維治療后，部分健康人血糖、胰島素水平降低，其腸道內(nèi)普氏菌屬出現(xiàn)富集［16］。菜豆可增加小鼠腸道中普氏菌屬豐度，促進(jìn)碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生SCFAs［17］，后者可作為腸上皮細(xì)胞的能源，同時(shí)具有增強(qiáng)腸上皮屏障、調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)、抑制炎癥和氧化應(yīng)激作用［18］，從而抑制糖尿病腎臟疾病發(fā)生發(fā)展。根據(jù)KEEG 功能預(yù)測，金匱腎氣丸干預(yù)后腸道菌群碳水化合物代謝功能增強(qiáng)，但本研究并未檢測治療前后腸道SCFAs 變化，無法判斷普氏菌屬是否升高其水平而對患者產(chǎn)生益處。

Prevotellacopri富集與胰島素抵抗有關(guān)［19］，普氏菌屬在我國高血壓前期、原發(fā)性高血壓患者腸道中富集，可能與觸發(fā)炎癥有關(guān)［20］，其中Prevotella_ 7 與增加終身心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，Tyzzerella、Christensenellaceae_ R-7 在心血管疾病高風(fēng)險(xiǎn)人群中富集［21］。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，BMI、TC、LDL 與Tyzzerella_ 3 菌群的相對豐度呈正相關(guān)，說明Tyzzerella_ 3 的富集與肥胖、血脂異常相關(guān)，與Tyzzerella在心血管疾病高風(fēng)險(xiǎn)人群中富集有相關(guān)性。TC、LDL 與Christensenellaceae_ R-7 菌群相對豐度呈負(fù)相關(guān)，與Christensenellaceae_ R-7 在心血管疾病高風(fēng)險(xiǎn)人群中富集不一致，Christensenellaceae 屬于厚壁菌門，目前被認(rèn)為是健康腸道特征的5 個(gè)類群之一，與BMI、內(nèi)臟脂肪量、腰圍、腰臀比、TC、LDL、TG、糖代謝受損、血壓呈負(fù)相關(guān)，有望作為一種改善人類健康的治療性益生菌［22］，故本研究認(rèn)為TC、LDL 與Christensenellaceae_ R-7 存在負(fù)相關(guān)性是合理的，而中醫(yī)證候評分、病程、餐后2 h 血糖與后者存在正相關(guān)有待商榷。

綜上所述，金匱腎氣丸可改善陰陽兩虛型糖尿病腎臟疾病患者臨床癥狀、血壓，增加腸道菌群Prevotella_ 7 豐度，提高腸道菌群對碳水化合物的代謝能力。但由于時(shí)間、人力的限制，本研究樣本量較小，可能導(dǎo)致偏倚而產(chǎn)生陰性結(jié)果，另外由于未考察治療前后患者腸道菌群代謝產(chǎn)物、炎癥因子變化，無法從其他機(jī)制方面確定金匱腎氣丸對糖尿病腎臟疾病的作用，今后將擴(kuò)大樣本量，并對上述指標(biāo)進(jìn)行檢測。