腦心清片質(zhì)量標準提升

劉傲雪，馮文明，張 甦

［鑒甄檢測技術(shù)（上海）有限公司，上海 200131］

柿科植物柿DiospyroskakiThunb.的葉作為中藥使用，始見于《滇南本草》，《本草再新》［1］記載其可用于“治咳嗽吐血，止渴生津”。腦心清片是以柿葉為原料制成的薄膜衣片，主要成分包括黃酮、三萜、酚酸，其中黃酮占總含量的25.7%［2-4］，該制劑具有活血化瘀、通絡(luò)的功效，用于治療脈絡(luò)瘀阻、眩暈頭痛、肢體麻木、胸痹心痛、胸中憋悶、心悸氣短、冠心病、動脈粥樣硬化癥等見上述證候者，主要有抗氧化、抗炎、抗細胞凋亡［5］、改善血流動力學和血液流變學、抑制血小板和血栓形成、抗心肌缺血、抗腦缺血等作用［6-8］，對腦動脈硬化［9-10］、腦卒中及其后遺癥療效顯著［11-12］。

目前，關(guān)于腦心清片質(zhì)量標準的研究涉及黃酮含量測定、指紋圖譜等［13-16］，并且已收載于2020年版《中國藥典》［17］中，但缺乏黃酮特征鑒別和多成分質(zhì)控手段。因此，本實驗通過TLC 鑒別、特征圖譜、含量測定來提升腦心清片質(zhì)量標準，以期為有效控制該制劑品質(zhì)提供可靠的方法。

1 材料

ATS 4 全自動點樣儀、Visualizer 2 薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)（瑞士Camag 公司）； Waters Aquility UPLC H-class 超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）； Schmidbauer GmbH／P300H 超聲波清洗儀（德國Elma 公司）； MS204TS／02、XSE105DU 電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。金絲桃苷（批號111521-201809）、異槲皮苷 （批號111809-201804）、紫云英苷（批號10319）、槲皮素（批號100081-201610）、山柰酚 （批號110861-202013）對照品分別購自中國食品藥品檢定研究院、上海詩丹德生物技術(shù)有限公司。腦心清片共15 批，由廣州白云山和記黃埔中藥有限公司提供，規(guī)格包括0.41 g／片（含柿葉提取物50 mg）、0.41 g／片（含柿葉提取物100 mg）。流動相用乙腈（上海阿達瑪斯試劑有限公司）、磷酸（美國Fisher 公司）為色譜純； 供試品溶液制備、TLC 展開劑用甲醇、無水甲酸、二氯甲烷為分析純； 水為超純水（由Master Touch-DUVF 超純水機制備）。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別 取本品適量（相當于柿葉提取物125 mg），加20 mL 水超聲提取15 min，離心10 min，上清液用二氯甲烷萃取2 次，每次20 mL，合并二氯甲烷液，蒸干，殘渣加1 mL 甲醇，作為供試品溶液； 取山柰酚對照品適量，甲醇制成每1 mL含0.5 mg 該成分的溶液，作為對照品溶液［6］。吸取上述2 種溶液各10 μL，分別點于同一高效硅膠GF254 薄層板上，以甲醇-二氯甲烷（1 ∶15）為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外光燈（254 nm）下檢視，結(jié)果見圖1。由此可知，供試品、對照品溶液色譜圖同一位置處顯示相同顏色斑點。

2.2 特征圖譜建立

2.2.1 色譜條件、系統(tǒng)適用性試驗 參考文獻［7-8］報道，Agilent Zorbax Eclipse plus C18色譜柱（10 cm×2.1 mm，1.8 μm）； 流動相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～30 min，5% ～40%A；30～32 min，40% ～95% A； 32 ～34 min，95% A；34～35 min，95% ～5%A； 35 ～40 min，5%A）； 體積流量0.3 mL／min； 柱溫35 ℃； 檢測波長254 nm； 進樣量2 μL。理論塔板數(shù)按槲皮素計，應不低于8 000。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取槲皮素對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含10 μg 該成分的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 取本品10 片 （批號I20A004），研細，取約0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（380 W、37 kHz）處理15 min，放冷，70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液制備 取陰性樣品適量，按“2.2.3” 項下方法制備，即得。

2.2.5 標準規(guī)定 供試品溶液特征圖譜中應呈現(xiàn)12 個特征峰，以槲皮素色譜峰為S 峰，其中11 號峰保留時間應與對照品溶液色譜峰的相對應，各特征峰相對保留時間應在規(guī)定值的±5% 以內(nèi)，分別為0.16 （峰1）、0.27 （峰2）、0.41 （峰3）、0.51 （峰4）、0.63 （峰5）、0.65 （峰6）、0.68（峰7）、0.70 （峰8）、0.74 （峰9）、0.78 （峰10）、1.19 （峰12）。

2.2.6 專屬性試驗 供試品溶液特征圖譜中有12個特征峰，經(jīng)對照品比對，峰1 為原兒茶酸，峰2為對羥基苯甲酸，峰5 為金絲桃苷，峰6 為異槲皮苷，峰9 為紫云英苷，峰11 為槲皮素，峰12 為山柰酚，陰性無干擾，表明專屬性符合規(guī)定，見圖2。

圖2 腦心清片特征圖譜Fig.2 Characteristic chromatogram of Naoxinqing Tablets

2.2.7 重復性試驗 取裝量差異下的本品（批號I20A004），研細，取約0.2 g，精密稱定，平行6份，按“2.2.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，以槲皮素特征峰為參照峰，測得各特征峰相對保留時間RSD 在0.02% ～0.08% 范圍內(nèi)，相對峰面積 RSD 在1.34% ～2.30%范圍內(nèi)，表明重復性符合規(guī)定。

2.2.8 中間精密度試驗 由不同分析人員在不同檢驗日期使用不同儀器，對同一批樣品 （批號I20A004）平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得各特征峰相對保留時間RSD 在0 ～1.36% 范圍內(nèi)，相對峰面積RSD 在2.13% ～17.65% 范圍內(nèi)，表明中間精密度符合規(guī)定。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液 （批號I20A004）適量，室溫下于0 ～24 h 在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得各特征峰相對保留時間RSD 在0.16% ～2.27%范圍內(nèi)，相對峰面積RSD 在0.28% ～3.03%范圍內(nèi)，表明穩(wěn)定性符合規(guī)定。

2.2.10 結(jié)果分析 采用上述方法建立15 批樣品特征圖譜，以槲皮素特征峰為參照峰，測得12 個共有峰在所有樣品色譜圖中均出現(xiàn)，特征峰相對保留時間均在規(guī)定值的±5%以內(nèi)。

2.3 含量測定 采用HPLC 法。

2.3.1 色譜條件、系統(tǒng)適用性試驗 同“2.2.1” 項。

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，加甲醇制成每1 mL 分別含金絲桃苷9 μg、異槲皮苷14 μg、紫云英苷16 μg、槲皮素9 μg、山柰酚12 μg 的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液制備 同“2.2.3” 項。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密稱取對照品溶液（金絲桃苷0.498 mg／mL、異槲皮苷0.510 mg／mL、紫云英苷0.503 mg／mL、槲皮素0.521 mg／mL、山柰酚0.495 mg／mL）適量，甲醇制成系列質(zhì)量濃度，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結(jié)果見表1，可知各黃酮在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各黃酮線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various flavonoids

2.3.5 重復性試驗 取裝量差異下本品（批號I20A004），研細，取約0.2 g，精密稱定，平行6份，按“2.3.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，測得各黃酮含量RSD 在0.50% ～1.94%范圍內(nèi)，表明重復性符合規(guī)定。

2.3.6 中間精密度試驗 由不同分析人員在不同檢驗日期使用不同儀器，對同一批樣品 （批號I20A004）平行制備6 份供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，測得各黃酮含量RSD 在0.41% ～2.75%范圍內(nèi)，重復性、中間精密度含量RSD 在0.10% ～1.74%范圍內(nèi)，表明中間精密度符合規(guī)定。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液 （批號I20A004）適量，室溫下于0 ～24 h 在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，測得各黃酮色譜峰保留時間RSD 在0.74% ～1.37% 范圍內(nèi)，峰面積RSD 在0.22% ～0.67%范圍內(nèi)，表明穩(wěn)定性符合規(guī)定。

2.3.8 加樣回收率試驗 取各黃酮含量已知的本品（批號I20A004）約0.1 g，精密稱定，平行6份，置于具塞錐形瓶中，精密加入金絲桃苷對照品溶液（0.099 6 mg／mL）1 mL、異槲皮苷對照品溶液（0.102 mg／mL）2 mL、紫云英苷對照品溶液（0.101 mg／mL）2 mL、槲皮素對照品溶液（0.104 mg／mL）1 mL、山柰酚對照品溶液 （0.099 1 mg／mL）2 mL，加70%甲醇至25 mL，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，金絲桃苷平均加樣回收率為101.43%，RSD 為2.21%； 異槲皮苷平均加樣回收率為102.16%，RSD 為2.31%；紫云英苷平均加樣回收率為95.38%，RSD 為1.48%； 槲皮素平均加樣回收率為105.16%，RSD為1.43%； 山柰酚平均加樣回收率為104.48%，RSD 為0.73%。

2.3.9 樣品含量測定 取 15 批樣品，按“2.3.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，計算含量，結(jié)果見表2。

表2 各黃酮含量測定結(jié)果（mg／g）Tab.2 Results of content determination of various flavonoids （mg／g）

3 討論

本實驗對供試品溶液制備方法、展開劑、檢視方法、點樣量等方面進行考察，確定TLC 鑒別條件，再進行方法學考察，包括專屬性、穩(wěn)定性等，發(fā)現(xiàn)均符合要求。另外，15 批腦心清片經(jīng)檢測均符合起草標準，表明該方法專屬性強，穩(wěn)定性好，可實現(xiàn)有效成分鑒別的目的。

然后，將特征圖譜和含量測定相結(jié)合，采用同一液相體系兼顧有效成分定性、定量分析。結(jié)果，特征圖譜中保留時間10 min 前的成分大多為有機酸，12 min 后大多為黃酮，其中黃酮苷極性大于苷元，出峰更靠前，于12～16 min 集中出峰，而苷元出峰在18 min 后。再進行體系耐用性探索，發(fā)現(xiàn)不同柱溫 （33、35、37 ℃）、體積流量 （0.2、0.3、0.4 mL／min）、鹽體系 （0.05%、0.1% 磷酸）、色譜柱下各黃酮色譜峰峰面積RSD 均小于4%，表明該方法穩(wěn)定，重復性、耐用性良好。

含量測定結(jié)果顯示，各黃酮總含量穩(wěn)定，但隨著工藝變動（企業(yè)中試生產(chǎn)批次）黃酮苷、苷元比例發(fā)生變化。若含量測定僅限定于個別黃酮類成分［18-20］則會相對片面，而本實驗對該類成分的質(zhì)量控制更完善、穩(wěn)定。

4 結(jié)論

本實驗通過增加TLC 鑒別、特征圖譜、含量測定項目，進一步提升了腦心清片質(zhì)量標準。在2020 年版《中國藥典》 基礎(chǔ)上，新增的TLC 法彌補了腦心清片中黃酮類特征成分的鑒別項； 特征圖譜中12 種成分可對該制劑特征峰進行監(jiān)控； 含量測定在原有的槲皮素、山柰酚2 種黃酮苷元基礎(chǔ)上，又增加了3 種黃酮苷（金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷），可對其進行更全面的質(zhì)量控制。