迷迭香酸對宮頸癌PI3K/A/mTOR信號通路靶分子作用的研究

覃秋蓮 滕淑靜 胡爽 劉陽春 王志文

摘 要：迷迭香酸作為一種天然酚酸類化合物目前已被廣泛應用于多種癌癥的治療。為探討迷迭香酸對人宮頸癌的治療效果，本研究通過細胞增殖、遷移和自噬等試驗進行功能驗證，并應用蛋白質免疫印跡技術驗證了其可能發(fā)揮作用的信號通路。研究結果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)迷迭香酸處理后，人宮頸癌Hela細胞的增殖能力顯著性下降；細胞的遷移能力同樣受到抑制，自噬相關蛋白（ATGs）ATG5和Beclin1（酵母ATG6同源物）表達上調(diào)，磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（AKT）和雷帕霉素靶蛋白（mTOR）表達下降。這提示，迷迭香酸可能通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路來促進細胞的自噬，并抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移。該研究結果進一步說明了迷迭香酸作為抗癌藥物的潛在價值，為抗癌藥物的研發(fā)提供了一個新的理論。

關鍵詞：迷迭香酸；宮頸癌；細胞自噬；細胞增殖

中圖分類號：Q279；R737.33? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.01.009

Effects of Rosmarinic Acid on Target Molecules of PI3K/Akt/mTOR Signaling Pathway in Cervical Cancer

QIN Qiulian1， TENG Shujing1， HU Shuang2， LIU Yangchun2， WANG Zhiwen1，3*

（1. Key Laboratory of Chronic Noncommunicable Diseases， Yueyang Vocational Technical College， Yueyang 414006， China;

2. Nursing Department of Yueyang peoples Hospital， Yueyang 414000， China; 3. College of Life and Health Sciences， Wuhan University of Science and Technology， Wuhan 430081， China）

Abstract： Rosmarinic acid， as a natural acid-secreting compound， has been widely used in the treatment of various cancers. In order to explore the therapeutic effects of rosmarinic acid on human cervical cancer. The experiments of cell proliferation， migration and autophagy were carried out in this study for functional verification， and Western blotting was used to verify the possible signaling pathways. The results showed that the proliferation ability of human cervical cancer significantly decreased after rosmarinic acid treatment; the cell migration ability was also inhibited， the expressions of autophagy-related proteins ATG5 and Beclin1 were up-regulated， and the expressions of PI3K， AKT and mTOR proteins decreased. This suggests that rosmarinic acid may promote cell autophagy and inhibit the proliferation and migration of cervical cancer cells by inhibiting the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway， thereby achieving the effects of inhibiting or treating human cervical cancer. This further indicates the potential value of rosmarinic acid as an anticancer drug. It provides a new theory for the research and development of anticancer drugs.

Key words： rosmarinic acid; cervical cancer; autophagy; cell proliferation

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（1）： 062-068）

宮頸癌是女性主要的惡性腫瘤之一，其致死率在婦科惡性腫瘤中僅次于乳腺癌［1］。2020年，全球新增宮頸癌病例約60萬例，死亡34萬例［2］。目前，晚期轉移性宮頸癌的首選治療策略主要包括手術、放療和化療。盡管現(xiàn)代醫(yī)療技術在宮頸癌診斷和治療中不斷發(fā)展與提高，但在過去的5年中，確診為宮頸癌患者的總生存率并無實質性提高，因此，對宮頸癌有效的診斷、治療和預防藥物的開發(fā)成為一種迫切的需求［3-4］。目前，一些常規(guī)治療容易出現(xiàn)耐藥性，導致癌癥復發(fā)和轉移。近年來，一些植物來源的天然產(chǎn)物被評估為潛在的抗癌藥物，可以優(yōu)先殺死腫瘤細胞而不會產(chǎn)生嚴重的不良反應［5］。目前，約有60%的抗癌藥物是來自于植物或動物的天然產(chǎn)物［6］。近年來，從天然產(chǎn)物中提取有效成分來預防癌癥和治療癌癥已經(jīng)成為癌癥研究的重點之一。已有研究表明，天然短葉紅豆杉樹皮中提取分離得到的紫杉醇具有獨特的治療癌癥的作用機制，對于多種癌癥具有治療效果，且對乳腺癌和卵巢癌治療效果明顯，被公認為是目前世界上有效治療癌癥的藥物之一［7］。另外，姜黃素也是一種從天然植物中提取的多酚類天然產(chǎn)物。大量研究表明，姜黃素可以調(diào)控多種癌癥中的分子靶點，對于基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）、AKT、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等信號蛋白具有顯著性的抑制作用，可作為一種選擇性藥物治療癌癥［8］。秋水仙堿是一種從百合科秋水仙中提取的卓酚酮類生物堿，其結構中的C環(huán)與微管蛋白結合，阻止其聚合成紡錘絲，使細胞分裂停止于中期。目前，研究發(fā)現(xiàn)秋水仙堿對于食管癌、胃癌、肺癌等具有明顯的抑制作用［9］。綜上所述，大量的研究表明，天然產(chǎn)物具有多途徑、毒副作用小、多效應等優(yōu)勢，從天然產(chǎn)物中尋找抗癌藥物也成為一種可靠的方式，為未來尋找化療藥物，維護人類健康提供另外的保障。

迷迭香酸（rosmarinic acid，C18H16O8）是一種水溶性的具有多個多酚羥基的化合物，在唇形科、紫草科和傘形科等多種植物中廣泛分布［10-11］。研究發(fā)現(xiàn)迷迭香酸具有抗菌、抗氧化、抗炎及神經(jīng)保護作用［12］，并且具有抗腫瘤作用，可有效地抑制直腸癌細胞的轉移、侵襲［13］和胰腺癌細胞增殖、侵襲和遷移［14］，還能夠抑制炎癥與血管生成［15］，能通過促分裂素原活化蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinases，MAPK）信號通路對膠質細胞凋亡進行調(diào)控［16］，因此，對迷迭香酸的研究具有重要意義。然而，目前關于迷迭香酸對宮頸癌細胞的影響，仍然沒有詳細的研究報道。本試驗選用迷迭香酸作為研究對象，通過探討迷迭香酸對人宮頸癌Hela細胞系增殖以及遷移能力的影響，來進一步探討其影響人宮頸癌細胞的具體機制，以期為宮頸癌的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

迷迭香酸（上海源葉生物科技有限公司，中國）；RPMI-1640基礎培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）；Transwell小室（BD公司，美國）；人宮頸癌細胞Hela細胞系（科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，中國）；胎牛血清、青霉素-鏈霉素、0.25%胰酶（Gibco公司，美國）；奧林巴斯激光共聚焦（奧林巴斯公司，日本）；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（Hyclone 公司，美國）；增強型化學發(fā)光液（enhanced chemiluminescence，ECL）、發(fā)光液、細胞增殖及毒性檢測試劑盒（CCK-8）、抗anti-ACTB、E-cadherin、PI3K、AKT、ATG5等抗體（ABclonal公司，中國）；辣根過氧化物酶標記兔/鼠二抗（愛博泰克公司，中國）；BCA（bicinchoninic acid assay）蛋白質濃度測定試劑盒、RIPA（radio immunoprecipitation assay）裂解液（強）、脫脂奶粉（碧云天生物技術有限公司，中國）；自噬流標記試劑盒（艾美捷生物科技有限公司，中國）。

1.2 細胞培養(yǎng)與細胞處理

將細胞凍存管從液氮罐中取出，37℃水浴解凍，隨后將凍存管中的細胞凍存液混合物取出放進裝有5 mL完全培養(yǎng)基的15 mL離心管中。4℃ 300 g離心5 min，去上清，用1 mL完全培養(yǎng)基重懸細胞。將細胞懸液轉移到10 cm細胞培養(yǎng)皿中，其中液體成分為含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基。最后，將細胞培養(yǎng)皿轉移到37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。細胞每2～3 d傳代1次，當細胞匯合度達到70%～80%時進行傳代處理。首先，去除培養(yǎng)皿中的上清，PBS清洗1次，加入1 mL 0.25%胰酶37℃消化3 min，加入完全培養(yǎng)基終止消化反應。吹打培養(yǎng)基，將細胞懸液制備成單細胞懸液，并進行細胞計數(shù)。隨后，4℃ 300 g離心5 min，加入培養(yǎng)基制備成每毫升含有5×106個細胞的單細胞懸液，按2 mL每孔的用量接種到到6孔板中。將細胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜，隨后加入二甲亞砜溶解的迷迭香酸，孵育培養(yǎng)48 h后進行其他試驗。

1.3 CCK-8細胞活性試驗檢測

經(jīng)過上述處理后，將細胞以每孔1×105個細胞的用量接種到96孔板中，每個試驗組設置5個獨立的重復孔。分別在接種后的0、24、48和72 h，按說明書加入所需體積的CCK-8試劑，37℃孵育1 h后在多功能酶標儀中觀察試驗孔中450 nm處的吸收值，記錄并繪制成曲線。

1.4 克隆形成試驗

取對數(shù)生長期的細胞消化后，以每孔1 000個細胞的用量接種到6孔板中，每個試驗組設立3個獨立的重復孔。隨后將其置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜，并向試驗組中加入二甲亞砜溶解的迷迭香酸（20 ?mol/L）。培養(yǎng)15 d后，去除培養(yǎng)基，PBS清洗3次，加入4%多聚甲醛固定液室溫固定20 min，PBS清洗3次，加入0.1%結晶紫染色液，室溫染色15 min，PBS清洗3次，晾干后計數(shù)克隆數(shù)并將其繪制成柱狀圖。

1.5 Trnaswell遷移試驗

經(jīng)過上述處理48 h后的細胞，在對數(shù)生長期時用胰酶進行消化，將細胞裝在15 mL離心管中，4℃ 300 g離心5 min收集細胞，無血清基礎培養(yǎng)基清洗細胞2次。將上述細胞數(shù)量調(diào)整為每毫升含有5×105個細胞的細胞懸液，備用。向24孔板中添加含有20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基800 ?L，向Transwell小室中添加200 ?L細胞懸液并于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。隨后取出Transwell小室，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，PBS清洗2次。最后，在顯微鏡下觀察細胞遷移結果，在10倍鏡下隨機選取5個視野，拍照并計數(shù)。

1.6 細胞免疫熒光

將1×105個細胞接種于裝有細胞爬片的24孔板中，每個試驗設置有獨立的3個重復孔。接種細胞，并將其置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜，加入二甲亞砜溶解的迷迭香酸培養(yǎng)48 h。去除培養(yǎng)基，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定細胞，0.5% Triton X-100通透細胞膜；用5% BSA室溫封閉1 h，加入5% BSA配置的Anti-E-cadherin抗體，置于濕盒中4℃孵育過夜，PBS洗3次；根據(jù)說明書加入體積比為1∶200比例稀釋的Cy3標記抗兔二抗，置于濕盒中室溫孵育1 h，PBS洗3次；用4′，6 -二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽［2-（4-Amidinophenyl）-6-indolecarbamidine dihydrochloride，DAPI ］室溫對細胞核進行染色，PBS洗3次。

1.7 細胞自噬流標記

首先，按說明書配置好清洗緩沖液和染色工作液，其他步驟簡略如下：去除含有迷迭香酸的培養(yǎng)基，用清洗緩沖液清洗3次；在每孔中加入染色緩沖液100 ?L，室溫避光孵育30 min，清洗緩沖液清洗3次；4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS清洗3次；DAPI染色，避光15 min，PBS清洗3次；激光共聚焦顯微鏡100倍鏡下觀察并拍照。

1.8 Western blot免疫印跡分析

應用一步法蛋白電泳凝膠試劑盒配制10%凝膠，每孔加入20 ?g蛋白樣品，150 V恒壓電泳1.5 h；200 mA轉膜，根據(jù)目的蛋白千道爾頓（kilodalton，kD）數(shù)，以每kD/min的標準調(diào)整轉膜時間；轉膜完成后將聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜浸泡在5%含有0.05%吐溫的三乙醇胺緩沖鹽溶液的脫脂牛奶 TBST中室溫1 h；將PVDF膜孵育在相應抗體工作液中，4℃孵育過夜；將膜取出室溫在TBST中清洗3次，每次10 min；加入二抗，室溫孵育1 h。TBST清洗3次，每次10 min；ECL化學發(fā)光液顯色PVDF膜，化學成像系統(tǒng)拍照。

1.9 統(tǒng)計學分析

試驗數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 9軟件進行分析，用配對t檢驗分析兩組數(shù)據(jù)之間的統(tǒng)計學差異，P<0.05時認為兩組數(shù)據(jù)之間具有統(tǒng)計學差異（*P<0.05；**P<0.01）。

2 結果與分析

2.1 迷迭香酸對Hela細胞增殖能力的影響

首先，我們觀測迷迭香酸處理人宮頸癌細胞后對其細胞活性的改變。向96孔板中接種細胞后，再向孔中加入迷迭香酸使其終濃度為20 μmol/L，在特定時間點采集每孔中450 nm處吸收峰數(shù)值。經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)，人宮頸癌Hela細胞在經(jīng)迷迭香酸處理后24 h，細胞活力無明顯變化，處理48 h后細胞活力顯著性下降（圖1a）。隨后，我們應用克隆形成試驗，去檢驗迷迭香酸對人宮頸癌Hela細胞體外增殖能力的影響。試驗結果分析顯示（圖1b），迷迭香酸同樣能顯著性降低人宮頸癌Hela細胞的體外增殖能力。

2.2 迷迭香酸對Hela細胞遷移能力的影響

利用試驗觀測迷迭香酸對人宮頸癌Hela細胞遷移能力以及細胞遷移蛋白標志物表達的影響。Transwell細胞遷移試驗結果顯示（圖2a），經(jīng)迷迭香酸處理后的人宮頸癌Hela細胞的遷移能力下降明顯。提取迷迭香酸處理48 h后的宮頸癌細胞蛋白，后經(jīng)Western blot和細胞免疫熒光分析顯示（圖2b、2c），遷移蛋白標志物N-cadherin和E-cadherin經(jīng)處理后有顯著性的表達變化，并與Transwell的結果相符。

2.3 迷迭香酸對Hela細胞自噬的影響及其發(fā)揮作用信號通路的研究

為探究迷迭香酸通過何種方式發(fā)揮抑制細胞增殖和遷移的作用，我們依據(jù)文獻對迷迭香酸處理后的細胞進行自噬流標記以及自噬相關蛋白免疫熒光標記和Western blot分析。分析結果顯示，迷迭香酸處理后的細胞自噬明顯上升，自噬相關蛋白同樣表達上調(diào)（圖3、圖4a）。

最后，為探究迷迭香酸通過何種細胞信號通路調(diào)控自噬的變化，我們應用Western blot檢測了PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白的表達。如圖4b和4c所示，經(jīng)過迷迭香酸處理后的細胞中PI3K、AKT和mTOR蛋白的表達明顯下調(diào)，且p-PI3K、p-AKT和p-mTOR的含量也均顯著性下降。上述結果顯示，當迷迭香酸處理宮頸癌Hela細胞時，宮頸癌細胞中自噬關鍵調(diào)控蛋白Beclin1表達上升，但PI3K/AKT/mTOR信號通路的相關蛋白及相關蛋白的磷酸化含量均顯著性下降。這些結果表明，迷迭香酸是通過影響PI3K/AKT/mTOR信號通路進而影響人宮頸癌Hela細胞的自噬，從而導致細胞遷移和增殖能力的改變。

3 討論

宮頸癌是全球第四大常見女性癌癥，且在低收入和中等收入國家中發(fā)病人數(shù)占主導地位［17］。我國是宮頸癌發(fā)病率較高的國家，并且每年的發(fā)病率及致死率仍在上升［18］。如何預防與治療宮頸癌是全球研究人員共同關注的課題，因此，尋找新的抗癌藥物是所有醫(yī)療人員面臨的巨大挑戰(zhàn)。由于迷迭香酸具有抗氧化、抗炎、抑制增殖和促進凋亡等特殊藥理活性，其在癌癥的預防與治療中得到了廣泛的應用［19］。

目前研究表明，迷迭香酸對多種癌癥具有顯著的抑制作用［20］。在本試驗中，我們先通過CCK-8試驗和克隆形成試驗檢測迷迭香酸對人宮頸癌Hela細胞增殖的影響，結果表明，迷迭香酸能顯著性降低人宮頸癌Hela細胞體外增殖能力。另外，Transwell細胞遷移試驗表明，經(jīng)迷迭香酸處理后的人宮頸癌Hela細胞的遷移能力下降明顯，并且其中遷移蛋白標志物N-cadherin經(jīng)處理后有顯著性降低，E-cadherin顯著性升高。自噬是一種廣泛存在于真核生物體內(nèi)的生物學現(xiàn)象，是一種高度保守的分解代謝過程，也是長壽命蛋白質和細胞質細胞器降解的主要細胞途徑［21］。自噬是一種不可或缺的生物學功能，有助于維持正常的組織穩(wěn)態(tài)和代謝適應性，當自噬調(diào)節(jié)異常時，也會對正常的細胞功能造成嚴重后果［22］。PI3K/AKT/mTOR通路是腫瘤發(fā)生發(fā)展中的一條常見的自噬通路，在癌癥發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［23-25］。已有研究證明，迷迭香酸可以通過PI3K/AKT/mTOR信號通路影響結腸癌細胞自噬的發(fā)生，并且可以通過細胞自噬影響鼻咽癌細胞的凋亡［26］，然而，關于迷迭香酸通過何種作用機制影響結腸癌的發(fā)生發(fā)展尚未可知。為了進一步探究迷迭香酸調(diào)控人宮頸癌Hela細胞增殖和遷移的具體作用機制，我們檢測了自噬相關蛋白和PI3K/AKT/mTOR信號通路相關蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過迷迭香酸處理后的細胞中的自噬相關蛋白的表達上調(diào)，PI3K、AKT及mTOR信號通路相關蛋白表達下調(diào)。綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)迷迭香酸能夠通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號通路來調(diào)控自噬的發(fā)生，從而對人宮頸癌Hela細胞增殖和遷移產(chǎn)生影響。

隨著對迷迭香酸功能研究的不斷深入，越來越多的研究表明，迷迭香酸可能通過不同的途徑或者信號通路來影響癌癥的發(fā)生發(fā)展［16］。本研究初步證實了迷迭香酸對宮頸癌的抑制作用及可能的作用機制，揭示了迷迭香酸作為抗癌藥物的潛在價值，為迷迭香酸的臨床藥物開發(fā)應用奠定了重要的基礎。

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收稿日期：2022-10-09；修回日期：2022-11-09。

基金項目：湖南省自然科學基金科教聯(lián)合項目（2020JJ7071）；湖南省教育廳自然科學項目（18C1770）。

作者簡介：覃秋蓮，講師，主要從事腫瘤分子機制的研究。

* 通信作者：王志文，講師，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤分子流行病學的研究。E-mail： wzw189189@163.com。