一株白地霉在低碳氮比廢水中降氨氮新功能的研究

劉輝 李曉超 毛曉茜 魯冰花 曾桂華 李華林 王雪景 陳佳艷 肖亞梅 李莊 劉文彬 楊利平

摘 要：該文從垃圾滲濾液中篩選出一株低C/N營養(yǎng)條件下氨氮去除效果顯著的菌株。ITS序列測序鑒定表明，該菌株為白地霉（Galactomyces candidum）。經(jīng)不同pH、溫度、C/N的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h，測定其生長密度及氨氮去除情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白地霉培養(yǎng)基最佳降氨氮條件為：pH 8.0，C/N 1.5，溫度 30℃，其最佳氨氮去除率可達93.1%。該文發(fā)現(xiàn)了白地霉在污水處理，尤其是低C/N污水處理中具有氨氮去除的新功能，為其在低C/N污水生化處理工業(yè)化應(yīng)用提供了新的菌株資源和技術(shù)途徑。

關(guān)鍵詞：白地霉；低C/N；降氨氮；廢水處理；培養(yǎng)條件

中圖分類號：X703? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.01.012

A Novel Function of Galactomyces candidum in Highly Efficient Ammonia Nitrogen Removal from Low C/N Wastewater

LIU Hui1#， LI Xiaochao1#， MAO Xiaoqian3#， LU Binghua1， ZENG Guihua1， LI Hualin1， WANG Xuejing2， CHEN Jiayan2， XIAO Yamei2， LI Zhuang3， LIU Wenbin2*， YANG Liping1*

（1. College of Environmental Resources， Changsha Environmental Protection College， Changsha 410004， China;

2. State Key Laboratory of Freshwater Fish Developmental Biology， College of Life Sciences， Hunan Normal University， Changsha 410012， China; 3. Hunan Ecological and Environmental Affairs Center， Changde 415003， China）

Abstract： A strain of microorganism that demonstrated efficient nitrogen removal potential under low C/N conditions was screened from landfill leachate. The strain was identified as Galactomyces candidum by ITS sequencing， and growth density and removal of ammonia nitrogen were assessed after 24 h of incubation. The results showed that the optimum ammonia nitrogen reduction conditions for G. candidum was at pH 8.0 and 30 ℃， with a C/N ratio of 1.5; the highest rate of ammonia nitrogen removal was 93.1%. This novel function of G. candidum offers great potential in the removal of ammonia nitrogen from sewage， especially in low C/N wastewater. Our study provides a new theoretical basis for the industrial application of microorganism in the biochemical treatment of wastewater and reduces environmental pollution.

Key words： Galactomyces candidum; low C/N; ammonia nitrogen reduction; wastewater treatment; culture conditions

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（1）： 089-096）

氨氮去除是污水處理，尤其是低C/N污水處理中的一個熱門研究［1-2］。在我國受污染河水、地下水、垃圾滲濾液以及石油化工、化肥、味精等行業(yè)的生產(chǎn)廢水都具有低碳氮比的特點［3］。傳統(tǒng)生物污水處理需耗費大量的能源與碳源才能完成脫氮過程［4］。因此，找到低碳條件下高效降氨氮菌株能在一定程度上解決低C/N廢水脫氮問題。不同的真菌對碳氮比有不同的要求，且一般碳氮比>10［5］。鄧瑋瑋等［6］報道稱厭氧氨氧化菌與反硝化菌兩種自養(yǎng)細菌針對低碳氮比污水的脫氮處理效果比較好。Li等［7］、Yang等［8］發(fā)現(xiàn)在低碳氮比營養(yǎng)條件下能高效率去除氨氮的菌株。

白地霉（Galactomyces candidum）是廣泛存在于環(huán)境中的一類真核微生物，形態(tài)特征介于酵母菌與霉菌之間，常應(yīng)用于奶酪［9］、啤酒［10］、白酒、腐乳等食品釀造中。它能夠生產(chǎn)果膠酶［11］、輔酶Q、脂肪酶，提高中鏈脂肪酸含量和抗微生物活性［12］等。在污水處理方面，有研究表明，白地霉有降低廢水中化學(xué)需氧量（chemical oxygen demand，COD）［13-15］的作用，但白地霉氨氮去除性能尚無文獻報道。本文篩選的白地霉（以下簡稱GC菌）能夠在低C/N營養(yǎng)條件下生長良好，且具有顯著氨氮去除的效果。本研究結(jié)果表明，白地霉作為一種新的菌種，對氨氮去除具有顯著效果，可在低C/N污水處理工藝中發(fā)揮重要作用。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

礦質(zhì)培養(yǎng)基（g/L）：NH4Cl 0.246 g、MgSO4·7H2O 0.039 g、CaCl2 0.055 g、FeSO4·7H2O 0.010 g、CuSO4·5H2O 0.000 024 g、K2HPO4 0.348 g、葡萄糖3.603 g、瓊脂20.0 g、1 000 mL蒸餾水，115℃高溫高壓滅菌30 min ［16］。

牛肉膏蛋白胨（Luria-Bertani，LB）培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g、酵母浸粉5.0 g、氯化鈉10.0 g、瓊脂20.0 g溶于1 L蒸餾水中，121℃、15 min滅菌。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、葡萄糖20.0 g、酵母粉5.0 g、瓊脂粉20.0 g（固體），溶于1 L蒸餾水中，121℃、15 min滅菌。

乳酸細菌（De Man Rogosa and Sharp，MRS）培養(yǎng)基：蛋白胨10.00 g、牛肉浸粉5.00 g、酵母浸粉4.00 g、葡萄糖20.00 g、磷酸氫二鉀2.00 g、檸檬酸三銨2.00 g、醋酸鈉5.00 g、硫酸鎂0.20 g、硫酸錳0.05 g、瓊脂20.00 g、吐溫801.0 mL，121℃、15 min滅菌。

1.2 菌種分離篩選

利用無菌生理鹽水把從垃圾填埋處理場取來的垃圾滲濾液稀釋 10倍。為使微生物細胞分散，形成均勻的菌懸液，在上述液體中加入數(shù)顆玻璃珠，充分震蕩 20～30 min。在無菌條件下，將上述混合菌種的液體采用稀釋平板法分別轉(zhuǎn)接到LB、YPD、MRS固體培養(yǎng)基上，分別于37、30、30℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24～48 h后，將有單個菌形成的菌種圈挑出，進一步通過劃線法純化，直到得到純菌株并將其保存于-80℃冰箱。將分離純化的菌種活化培養(yǎng)，挑單菌落于5 mL滅菌后的LB、YPD、MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h。取1%菌液以12 000 r/min離心10 min，棄去上清液。加入生理鹽水打散，混勻后離心。棄去液體，重復(fù)3次。將菌體加入100 mL氨氧化選擇培養(yǎng)基中，放入30℃、150 r/min恒溫培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)。24 h后，用比濁法（OD600 nm）檢測菌體數(shù)量。納氏試劑法［17］檢測其菌體培養(yǎng)基氨氮含量，以不接菌的培養(yǎng)基做對照，計算氨氮去除率并從中篩選出一株對氨氮去除效果最好的菌株GC。

1.3 菌種鑒定

按照真菌試劑盒上方法提取DNA，試劑盒購自BIOMIGA。采用擴增ITS基因的通用引物。前引物ITS1（5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG3'），后引物ITS4（5' TCCTCCGCTTATTGATATGC3'）。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；54℃退火45 s；72℃延伸1 min，經(jīng)過 30個循環(huán)后，72 ℃再延伸10 min。將PCR產(chǎn)物送至公司測序（北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司長沙分公司），得到的基因序列上傳至NCBI網(wǎng)站進行序列比對。最后，用MEGA6.0軟件通過鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。

1.4 培養(yǎng)基單因素優(yōu)化

將GC菌用YPD培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)。離心后，將離心管底部菌體接種到氨氧化培養(yǎng)基中，探討其在不同培養(yǎng)基初始pH、不同培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基不同C/N比時對氨氮去除能力的影響。pH調(diào)節(jié)為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在30℃、150 r/min搖床中進行培養(yǎng)。溫度選擇10、20、25、30、37、42℃，在150 r/min搖床培養(yǎng)24 h。C/N等于0、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0（培養(yǎng)基固定NH4Cl 為0.246 g，葡萄糖為唯一碳源），在30℃、150 r/min搖床進行培養(yǎng)。所有試驗菌液的接種量均為1%，并以原培養(yǎng)基作對照。培養(yǎng)24 h后，比較氨氮濃度及600 nm光密度（optical density，OD）變化，所有試驗重復(fù)3次。

1.5 分析方法

檢測氨氮采用納氏試劑紫外分光光度法［17］。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)

從垃圾滲濾液篩選出的降氨氮菌株可以在以NH4+-N為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基上生長，且降氨氮效果明顯。在 30℃固體YPD培養(yǎng)基中菌落呈灰白色圓形，直徑約為 2 mm，表面粗糙、濕潤，中央不隆起，邊緣不整齊（圖1）。

2.2 菌種鑒定

GC菌ITS序列經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，GC菌基因組大小為20 kb左右（圖2a）。ITS序列大小在350 bp左右（圖2b）。

2.3 GC菌同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹

GC菌ITS序列長度為346 bp，擴增序列在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行BLAST比對分析，該菌與Galactomyces candidum strain WM 04.493 KP132255.1 相似性為99%， 與Galactomyces candidum LC317625.1相似性為98%。用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［18］，顯示該菌與Galactomyces candidum LC317625.1最為相近（圖3）。GC菌與Galactomyces candidum strain WM 04.493 KP132255.1在第4、42、43、319、338、339、340位堿基處有差異。與Galactomyces candidum LC317625.1在第65、91、92、319、338、339、340堿基處出現(xiàn)差異（圖4）。

2.4 培養(yǎng)基單因素優(yōu)化

2.4.1 生長曲線測定

為了了解GC菌生長濁度的變化，測定GC菌OD600 nm值。從圖5可以看出，GC菌0～2 h為生長延遲期，2 h后開始進入對數(shù)期，符合硝化菌世代周期短、生長速率快的特點［19-20］，24 h左右到達穩(wěn)定期，細胞數(shù)量維持穩(wěn)定。由于使用紫外分光光度計測量菌體濁度，死亡的細胞也被計入，因此，在穩(wěn)定期后沒有出現(xiàn)衰亡期。

2.4.2 最適pH

24 h后GC菌在不同pH條件下生長（圖6）及降氨氮（圖7）的變化表明：GC菌適合于偏堿性環(huán)境，最佳pH生長條件為9.0左右；但其氨氮去除效率在pH為9.0時并不是最好的，可能是因為過堿條件GC菌降氨氮酶體系受到一定的抑制。

2.4.3 最適溫度

圖8展現(xiàn)了在其他條件不變，溫度改變時，24 h后GC菌細胞的生長數(shù)量。從該圖中可以看出，該菌在溫度10～42℃都能夠生長。在10℃時，菌株細胞數(shù)量增長緩慢；溫度高于10℃時，菌株細胞生長數(shù)量明顯增加；在30℃時達到最佳數(shù)量，超過30℃后菌體生長效率下降。從圖9可以看出，在30℃時氨氮去除率最高，為76.3%，而42℃時，去除率只有7.0%。由此可知，不同溫度條件下，氨氮去除率與菌株數(shù)量大致呈正相關(guān)。

2.4.4 最適C/N

以原培養(yǎng)基作對照，在氨氮濃度不變，改變葡萄糖含量，即C/N低的條件下，GC菌24 h后細胞生長濁度如圖10所示，不加碳源，菌株基本不生長。值得注意的是，此時氨氮去除率達到48.7%（圖11），這可能是因為加入的菌體在培養(yǎng)基中產(chǎn)生了氨氧化酶，同時說明了GC菌是異養(yǎng)氨氧化類型菌株。在C/N為1～4時，菌株均能生長。其中，在C/N為1.5時菌株細胞數(shù)量最多，且氨氮去除率為93.1%。隨著碳源的增加，GC菌去除氨氮的效率逐漸降低（圖11）。

3 討論

Galactomyces是Geotrichum其中的一種類型，兩者DNA具有同源性。自2004年以來，分類修訂的結(jié)論是舊的Galactomyces geotrichum/G. candidum complex包含4個獨立的種，其中Galactomyces candidus sp.、Galactomyces candidus sp. nov./G. candiduni、Galactomyces candidum與Geotrichum candidum功能相似。張曉知等［21］、于振林等［22］也將Galactomyces candidum應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)，本文參考了其相關(guān)報道。

工業(yè)用水會產(chǎn)生高氨氮低C/N比廢水，傳統(tǒng)生物脫氮技術(shù)常由于廢水中碳源不足而導(dǎo)致脫氮效果不佳，需額外投加碳源［23］，這一問題不僅加大了費用支出，而且有CO2產(chǎn)生，污染環(huán)境。針對這種情況，通過改進現(xiàn)有工藝來利用廢水中的現(xiàn)有碳源，但是各種環(huán)境因素會影響脫氮處理效果［24］。除了同步硝化反硝化、厭氧氨氧化等工藝 ［25-28］ ，新理論、新工藝的提出減少了生物脫氮對碳源的需求。但目前氨氮廢水處理技術(shù)中，利用菌株直接降氨氮法最為經(jīng)濟有效。本文篩選到的GC菌（在20～37℃中性偏堿環(huán)境中生長速率快）培養(yǎng)基C/N比為1.5時，24 h后氨氮去除率為93.1%。其培養(yǎng)過程簡單，無需增加過多碳源，為污水氨氮處理提供了理論依據(jù)。

白地霉在廢水處理中有良好的脫色去污的效果［29-30］，也能一定程度上凈化馬鈴薯、豆腐、玉米淀粉等食品工業(yè)廢水［31-33］。但白地霉在廢水氨氮去除方面尚無報道，而本文篩選到的GC菌在24 h內(nèi)去除氨氮有顯著效果。白地霉在食品工藝中應(yīng)用廣泛，利用廢水發(fā)酵白地霉也有相關(guān)報道。本文篩選到的GC菌在高氨氮低碳源條件下能快速降解氨氮，如應(yīng)用于污水處理中，可減少設(shè)備投入，降低處理成本，同時在短時間內(nèi)完成氨氮去除。該文發(fā)現(xiàn)了白地霉在污水處理中具有顯著氨氮去除的功能，這是白地霉在污水處理中的一個新的功能。我們的研究表明了，白地霉在低C/N廢水生化處理工藝中具有廣泛的應(yīng)用前景。

本文主要聚焦白地霉對培養(yǎng)基氨氮去除率的試驗，該GC菌株在污水處理中，對其他污染因子（比如：COD、總氮、總磷）的處理是否有效或者其有效的處理條件，將是我們今后研究的任務(wù)。本文的試驗基于實驗室條件，研究發(fā)現(xiàn)該株GC菌即使在低碳氮比條件下也具有較強的降氨氮作用，但是在實際污水處理工程中的效果及安全性有待進一步工藝應(yīng)用驗證。氨氮去除包含硝化與反硝化2個過程，該菌株的氨氮去除機理，氨氮是在硝化過程還是在反硝化過程中被轉(zhuǎn)化有待下一步的研究。

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收稿日期：2022-10-31；修回日期：2023-01-06。

基金項目：湖南省自然科學(xué)基金-科教聯(lián)合項目（2019JJ70017）；湖南省自然科學(xué)基金立項課題項目（2021JJ60090）；湖南省哲學(xué)社會科學(xué)規(guī)劃基金項目（21ZWC06）。

作者簡介：#為并列第一作者。劉輝，教授，主要從事環(huán)境微生物的研究；李曉超，教授，主要從事淡水魚類發(fā)育生物學(xué)的研究；毛曉茜，工程師，主要從事污染防治、環(huán)境標(biāo)準評估等方面的研究。

* 通信作者：楊利平，教授，主要從事環(huán)境微生物的研究。E-mail： 53537035@qq.com。