針孔參數(shù)優(yōu)化對激光掃描共聚焦顯微鏡熒光成像的影響

謝冰花 趙曉楓

摘 要：激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）是一種高分辨率的光學(xué)成像儀器，它利用“共軛成像”原理，獲得的圖片質(zhì)量遠(yuǎn)超于普通熒光顯微鏡。LSCM有兩組功能不同的針孔，即照明針孔和探測針孔，這是實(shí)現(xiàn)“共軛成像”的關(guān)鍵。由于照明針孔的大小和位置一般是固定的，LSCM主要通過調(diào)節(jié)探測針孔的大小來獲得高質(zhì)量的成像圖片。然而，很多使用者對于LSCM中針孔大小與熒光成像質(zhì)量的關(guān)聯(lián)缺乏了解。因此，本文闡述了針孔在LSCM中的作用原理及其與顯微鏡分辨率的關(guān)系，并通過小鼠脊髓腹側(cè)白質(zhì)中的免疫熒光成像分析，發(fā)現(xiàn)針孔參數(shù)優(yōu)化對提高LSCM熒光成像質(zhì)量具有顯著影響。這一發(fā)現(xiàn)將為LSCM成像分析提供重要參考。

關(guān)鍵詞：激光掃描共聚焦顯微鏡；針孔；分辨率；熒光成像；成像分析

中圖分類號：Q-334；Q-336? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.01.004

Parameter Optimization for Pinhole on Laser Scanning Confocal Microscopy Fluorescence Imaging

XIE Binghua， ZHAO Xiaofeng*

（Key Laboratory of Organ Development and Regeneration of Zhejiang Province， College of Life and Environmental Sciences， Hangzhou Normal University， Hangzhou 311121， China）

Abstract： Laser scanning confocal microscopy （LSCM） is a high-resolution imaging device. It uses the principle of “conjugate imaging”， the image quality obtained is much higher than that of ordinary fluorescence microscopy. LSCM has two pairs of pinholes， namely illumination pinhole and detection pinhole， which have different function respectively and are the key to realize conjugate imaging. Although the size and position of the illumination pinhole are generally fixed， LSCM can obtain high-quality images by adjusting the size of the detection pinhole. However， there is a lack of knowledge about the link between parameter of pinhole and the higher quality picture for LSCM. Therefore， this paper reveals the principle of pinhole in LSCM and its relationship with resolution. Furthermore， based on immunofluorescence image analysis for specific proteins expression in white matter of mouse spinal cord， we found that optimization for pinhole play an important role in LSCM image quality improving. This study would provide important reference for LSCM imaging analysis.

Key words： laser scanning confocal microscopy; pinhole; resolution; fluorescence imaging; imaging analysis

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（1）： 020-025）

激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscopy，LSCM）是上世紀(jì)80年代發(fā)展并逐漸成熟起來的一種高科技熒光成像儀器［1］。雖然，現(xiàn)代普通熒光顯微鏡較過去有了長足的發(fā)展和進(jìn)步，但是在對厚度較大的樣品（如細(xì)胞）進(jìn)行觀察時，來自非焦平面的熒光會對圖像整體的分辨率形成較大的干擾。而LSCM的關(guān)鍵技術(shù)在于，每次只對空間上的一個點(diǎn)（即焦點(diǎn)）進(jìn)行成像，再通過計(jì)算機(jī)控制的逐點(diǎn)掃描形成檢測樣品的二維或者三維圖像。在此過程中，來自焦平面以外的光信號不會對成像形成干擾，從而大大提高了顯微圖像的清晰度和細(xì)節(jié)分辨能力［2］。LSCM具有高靈敏度、高分辨率、高放大率等特點(diǎn)［3］，因此被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域［4-6］，是現(xiàn)代微觀研究領(lǐng)域不可或缺的利器之一。

根據(jù)成像原理，一方面LSCM利用激光作為點(diǎn)光源［7］，激光束（laser）透過照明針孔（illumination pinhole），被二向色鏡（dichroic mirror）反射，通過物鏡（lens）匯聚后入射于待觀察的樣本內(nèi)部焦點(diǎn)（focal plane）處。另一方面，激光照射所產(chǎn)生的熒光，被物鏡重新收集后送往二向色鏡，攜帶圖像信息的熒光由于波長較長，可直接通過二向色鏡并透過探測針孔（detection pinhole）到達(dá)光電探測器（detector），通過調(diào)節(jié)探測針孔的大小和位置，實(shí)現(xiàn)點(diǎn)與點(diǎn)成像，即“共軛成像”［8］（圖1）。

本文作者在多年的使用和管理LSCM中發(fā)現(xiàn)，設(shè)置拍照的第一步是將針孔設(shè)為1個艾里單位（airy unit，AU），但每次更換物鏡或激光器，1 AU針孔的大小都會發(fā)生改變，且LSCM的成像質(zhì)量與針孔大小密切相關(guān)。根據(jù)這一現(xiàn)象，本文旨在闡明針孔在LSCM中的作用及其與顯微鏡分辨率的關(guān)系，并進(jìn)一步分析在實(shí)際應(yīng)用中如何利用這一光學(xué)原理，獲得高質(zhì)量的成像圖片，以期為研究者和使用者提供幫助。

1 針孔的概念及在LSCM中的作用

針孔為一對中央帶有小孔的板狀結(jié)構(gòu)，二者的幾何尺寸一致，約0.1～0.2 μm，是單光子掃描共聚焦顯微鏡特有的裝置。LSCM有兩組功能不同的針孔，即照明針孔和探測針孔（圖1）。

照明針孔置于激光發(fā)射器和光束分離器之間，對光源起到空間濾波和整形作用，形成點(diǎn)光源對樣品進(jìn)行照射，而點(diǎn)光源具有發(fā)散小、能量集中等優(yōu)點(diǎn)，有利于對樣品中的熒光物質(zhì)進(jìn)行高效激發(fā)，進(jìn)而避免場光源照射時樣品中每一點(diǎn)的熒光激發(fā)都會受到臨近點(diǎn)的衍射或散射光干擾的問題［9］。在實(shí)際應(yīng)用中，照明針孔的大小和位置是固定的。

探測針孔則位于光束分離器和光電探測器之間（圖1），只有在焦平面上的點(diǎn)光源所發(fā)出的熒光能夠通過探測針孔被光電探測元件所接收（圖2中綠色光線），而焦平面以外的干擾熒光和散射光不能通過探測針孔［10］（圖2中紅色光線）。通過調(diào)節(jié)探測針孔的大小，可以獲得高分辨率的理想圖片。下文中提到的針孔主要是指探測針孔。

2 針孔與分辨率的關(guān)系

顯微鏡的分辨率通常被描述為可以分辨兩個無限小的物體的最小距離，通常是1 AU。1835年，Ariy George Biddell首次提出了衍射現(xiàn)象。艾里斑（ariy disc）是點(diǎn)光源通過理想透鏡成像時，由于衍射而在焦點(diǎn)處形成的光斑，中央是明亮的圓斑，周圍有一組較弱的明暗相間的同心環(huán)狀條紋，其中以第一暗環(huán)為界限的中央亮斑被稱作艾里斑。因此，即使在最優(yōu)化的狀態(tài)下，兩個無限小的物體距離低于1 AU是不可能被分辨開來的［11］。

1873年，Abbe Ernst Karl發(fā)表了自己的理論和公式，并對顯微鏡的衍射極限進(jìn)行了解釋，即Abbe定律。

橫向（即xy軸）分辨率的Abbe衍射公式為：

d橫向= λ/（2×NA）（1）

軸向（即z軸）分辨率的Abbe衍射公式為：

d軸向= 2×λ/（NA）2（2）

在光學(xué)領(lǐng)域，數(shù)值孔徑（numerical aperture，NA）定義了鏡頭可以收集光的能力，代表了一個鏡頭最基本的物理特性，即：

NA=n×sinα（3）

式中λ是光的波長，n為成像介質(zhì)的折射率，α是物鏡孔徑角的一半。

在Abbe衍射極限的基礎(chǔ)上，1896年Strutt John William創(chuàng)造了“瑞利判據(jù)”理論（Rayleigh Criterrion），在衍射極限系統(tǒng)當(dāng)中定義了分辨率極限：

R=1.22×λ/（NAobj+NAcond）（4）

式中1.22是一個常系數(shù)，NAobj是指物鏡的數(shù)值孔徑值，NAcond為聚光鏡的數(shù)值孔徑值。

由此可知，顯微鏡的分辨率是由光的波長和數(shù)值孔徑共同決定的［10］。LSCM的針孔一般指探測針孔，該直徑一般自動設(shè)置成和艾里斑直徑一致，通常設(shè)定為1 AU，這樣可以有效地過濾掉來自非焦平面的信號，從而獲得高分辨率的成像圖片。因此，在LSCM使用過程中，每當(dāng)更換物鏡或者激光器時，分辨率都會發(fā)生變化，1 AU針孔的大小也隨之發(fā)生改變（圖3）。由圖3a可知，以蔡司LSM710為例，在488 nm激光下，物鏡鏡頭倍數(shù)越高，數(shù)值孔徑越大，分辨率越小，相應(yīng)的1 AU針孔越?。▓D3b、3c），顯微鏡分辨能力越強(qiáng)；與之相反，在10×物鏡下（圖3d），激光波長越長，分辨率越大，1 AU針孔越大（圖3e、3f），顯微鏡分辨率越小。

3 針孔在LSCM中的應(yīng)用研究

本文作者通過在多年管理和使用LSCM中獲得的經(jīng)驗(yàn)，以蔡司LSM 710為例，簡要介紹如何在LSCM中根據(jù)不同情況來設(shè)置針孔大小，以獲得理想的高質(zhì)量圖片。

3.1 設(shè)定針孔大小對熒光成像質(zhì)量的影響

許多使用者不理解針孔在LSCM中的作用，按照普通光學(xué)顯微鏡的操作，只設(shè)定電壓值，針孔大小始終是軟件的默認(rèn)值，在這種情況下拍攝出來的圖片，往往無法達(dá)到預(yù)期的理想效果。以神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）在P7小鼠脊髓腹側(cè)白質(zhì)中的免疫熒光拍照為例，從圖4可知：在20×物鏡下，當(dāng)針孔小于1 AU時，GFAP的熒光信號雖然清晰可見，但是圖片整體強(qiáng)度弱，熒光信號斷斷續(xù)續(xù)，損失嚴(yán)重，無法形成連續(xù)的完整細(xì)胞絲狀形態(tài)信號（圖4a）；而當(dāng)針孔大于1 AU時，雖然熒光強(qiáng)度得以極大提升，但同時噪音背景也相應(yīng)增強(qiáng)，圖片模糊，使我們無法分辨GFAP的細(xì)胞定位情況（圖4b）；只有當(dāng)針孔等于1 AU時，不僅圖像信噪比高，還能分辨出清晰的、連續(xù)的絲狀信號，由此判斷GFAP主要在小鼠脊髓腹側(cè)白質(zhì)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)［12］（圖4c）。因此，應(yīng)在拍攝前確保針孔大小已設(shè)為1 AU。

3.2 多通道拍照中設(shè)定每個通道針孔大小的作用

許多使用者在多通道拍攝時，隨機(jī)設(shè)定其中一個通道的針孔為1 AU，而忽略設(shè)定其他通道。以轉(zhuǎn)錄因子OLIG1在P7小鼠脊髓腹側(cè)白質(zhì)中的熒光拍照為例，由圖5可知，使用者只設(shè)定了核染料DAPI通道（405 nm激光）的針孔為1 AU，得到清晰銳利的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)（圖5a、5d）。在圖5的拍攝中，OLIG1是Olig1-cre小鼠啟動后的轉(zhuǎn)基因番茄紅素的熒光信號，該蛋白主要在小鼠脊髓腹側(cè)白質(zhì)的少突膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，信號表達(dá)強(qiáng)，但背景高。同樣在20×物鏡條件下，使用者并沒有在更換成561 nm激光后重新設(shè)定針孔為1 AU，而是按照軟件默認(rèn)值3 AU進(jìn)行拍照（圖5b、5c），得到的圖片與針孔為1 AU（圖5e、5f）相比，圖片模糊，曝光過度，信噪比低。因此，在多通道拍攝時，每次更換鏡頭或激光器時，應(yīng)確保每個通道的針孔都設(shè)為1 AU。

3.3 針孔大小的優(yōu)化設(shè)置

有些使用者了解針孔在LSCM中的重要作用，但在遇到材料熒光信號較弱拍照時卻仍將針孔大小設(shè)置為1 AU，由于LSCM的光漂白缺點(diǎn)，無法通過提高激光能量值來獲得理想的圖片，這樣得到的圖片不僅質(zhì)量差，數(shù)據(jù)也不可靠。根據(jù)LSCM成像原理，這時可以將針孔適當(dāng)調(diào)大，允許更多的熒光信號通過探測針孔，得到的效果會完全不同。由圖6可知，SOX10非常特異地

在小鼠脊髓腹側(cè)白質(zhì)的少突膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)［13］，在針孔為1 AU條件下得到的圖片熒光信號非常特異但強(qiáng)度弱，許多信號沒有被光電探測器收集（圖6a、6c）。此時通過將針孔調(diào)整為3 AU，不僅圖片熒光信號得到了提高，信號數(shù)量也較針孔為1 AU時增加了許多，同時，可以清晰地觀察到SOX10與細(xì)胞核共定位表達(dá)（圖6e、6f）。因此，在拍照時，遇到熒光信號特異性強(qiáng)而強(qiáng)度較弱時，可適當(dāng)?shù)卦黾俞樋状笮　?/p>

4 總結(jié)與展望

總的來說，LSCM利用“共軛成像”原理使大部分非焦平面的光都被阻擋，所以拍照時設(shè)置的第一要素就是確定針孔的大小，通常設(shè)置為1 AU（圖4）。由“瑞利判據(jù)”可知，不管在何種拍攝條件下，更換物鏡或者激光器時，分辨率都會發(fā)生改變，因此，都需重新設(shè)定1 AU針孔的大?。▓D5）。在拍攝共定位圖片時，相同物鏡下，波長越長，分辨率越大，所有針孔應(yīng)設(shè)置成與激光波長最大AU值一致的大小（圖2）。針孔大小不僅與LSCM的光學(xué)切片厚度有關(guān)，還對檢測器信號的強(qiáng)度有影響［14-15］。因此，不管是單通道還是多通道拍攝或多維拍攝中，遇到信號較差或是光漂白現(xiàn)象過于嚴(yán)重時，如果增大激光器強(qiáng)度仍未能獲得滿意的熒光信號，可以將針孔相應(yīng)地調(diào)大，一般可以設(shè)置成2～3 AU（圖6）［16］。

LSCM由于采用“共軛成像”技術(shù)和高精度光電探測器，極大地提高了顯微圖像的分辨率，而LSCM圖像的質(zhì)量、分辨率等與針孔大小密切相關(guān)。從理論上說，LSCM可以對樣品任一層面清晰成像即“光學(xué)切片”，然而當(dāng)針孔太小時，允許通過的熒光量減少，無法看清細(xì)胞內(nèi)部物質(zhì)的正常分布狀態(tài)；反之，當(dāng)針孔過大時，光通量也相應(yīng)增大，z軸分辨率降低，光學(xué)切片厚度增大，因此會帶來非焦平面光的成分，引起圖像模糊和信噪比降低［17-18］。為獲得高質(zhì)量的熒光圖片，一般將針孔設(shè)為1 AU。由于顯微鏡分辨率受數(shù)值孔徑和波長的影響，因此每次切換物鏡或更換激光器時，都需重新設(shè)定1 AU針孔大小。在圖片熒光較弱的時候，為了捕捉到熒光圖片，使用者可以適當(dāng)?shù)卣{(diào)高針孔大小，從而可以進(jìn)行權(quán)衡選擇以獲得滿意的成像圖片。

總之，針孔在LSCM的應(yīng)用中非常重要，是成像的關(guān)鍵，也是最容易忽視的參數(shù)。本文總結(jié)了針孔在LSCM中的成像原理，分析了改變物鏡或激光器需要重新設(shè)定針孔大小的原因，并舉例說明了在實(shí)際應(yīng)用中如何根據(jù)需求設(shè)定針孔大小，以期為使用者和廣大科研工作者在使用LSCM時理解并掌握針孔的原理提供幫助，并通過在實(shí)際應(yīng)用中靈活設(shè)置針孔大小，獲得理想的圖片，以得到可靠的試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果。

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收稿日期：2022-10-05；修回日期：2022-10-24。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（32070965）；杭州市“131”人才計(jì)劃支持項(xiàng)目。

作者簡介：謝冰花，實(shí)驗(yàn)師，主要從事中樞神經(jīng)系統(tǒng)早期發(fā)育機(jī)制的研究，以及大型儀器設(shè)備的使用與管理。

* 通信作者：趙曉楓，副教授，主要從事中樞神經(jīng)系統(tǒng)少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育、髓鞘化及其相關(guān)疾病分子機(jī)制的研究。E-mail： zane@vip.sina.com。