成都市錦江區(qū)污水中猴痘病毒的監(jiān)測及基因特征分析

陳 欣,曹譽(yù)齡,楊穎馨,曹 昊,敬小麗,鄭月茂,繆瑞琦

(1.成都市錦江區(qū)疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科,四川 成都 610021;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院生物分析教研室,四川 成都 611130)

猴痘病毒是痘病毒科的一員,是20世紀(jì)70年代在北非發(fā)現(xiàn)的一種病毒性人畜共患病。猴痘病毒可通過接觸病變體液、呼吸道飛沫和受污染的物質(zhì)在人與人之間傳播[1]。2022年5月,非洲以外非流行地區(qū)的猴痘流行開始受到全世界的關(guān)注。2022年7月23日,世界衛(wèi)生組織宣布猴痘為國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件。據(jù)世衛(wèi)組織數(shù)據(jù),自猴痘疫情暴發(fā)以來,總共有111個(gè)國家和地區(qū)向世衛(wèi)組織報(bào)告了超過8.7萬例病例,包括140例死亡病例。2022年9月重慶報(bào)道了中國首例猴痘病例,2023年6月,成都也發(fā)現(xiàn)了猴痘,感染人數(shù)迅速上升。

快速識(shí)別疫情及聚集性對(duì)感染控制至關(guān)重要。污水監(jiān)測已被認(rèn)為是評(píng)估病原體傳播的有力工具,已成功用于追蹤SARS-CoV-2及其變體。研究表明,猴痘病毒DNA會(huì)從唾液、糞便、尿液、精液和皮膚病變中脫落[2],病毒基因組可能存在于污水中。因此,在2023年7～9月成都猴痘流行期間,跟蹤監(jiān)測了成都市第九污水處理再生水廠的污水,檢測并分析污水中的猴痘病毒含量和基因特征,研究污水中猴痘病毒濃度與陽性報(bào)告病例發(fā)生率的相關(guān)性,探討環(huán)境監(jiān)測作為猴痘疫情監(jiān)測補(bǔ)充手段的可行性和重要性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 對(duì)成都市第九污水處理再生水廠未經(jīng)消殺處理的污水進(jìn)行采樣,采樣方式為智能水質(zhì)采樣器24 h間斷采樣(即24 h不同時(shí)間所采集的瞬時(shí)水樣混合為1個(gè)樣本),采樣體積為300 mL,每周采集檢測2次,共檢測了2023年7～9月的26個(gè)樣本。

1.1.2 試劑 聚乙二醇購于生工生物工程股份有限公司,氯化鈉購于成都科隆化學(xué)品有限公司,提取試劑盒和猴痘DNA檢測試劑盒購于碩世生物科技股份有限公司,另一種猴痘DNA檢測試劑盒購于上海仁度生物科技股份有限公司,測序及全基因組分析試劑和系統(tǒng)購自杭州柏熠科技有限公司,均在效期內(nèi)使用。

1.2 方法

1.2.1 樣本的處理與富集 污水樣本經(jīng)0～4℃冷藏運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室,立即在60 ℃水浴30 min進(jìn)行滅活。污水的富集濃縮按照國標(biāo)WS/T 799-2022[3]中的聚乙二醇沉淀法進(jìn)行,將105 mL污水富集濃縮到0.6 mL。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測及定量 猴痘病毒DNA的提取使用碩世核酸提取試劑盒,按照試劑使用說明書進(jìn)行,用200 μL污水富集液提取50 μL總核酸。猴痘病毒DNA檢測按照《猴痘防控方案(2023版)附件7：猴痘病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)指南》[4]進(jìn)行,檢測采用2個(gè)廠家的成品試劑盒,以猴痘病毒F3L基因?yàn)槟繕?biāo)基因,任一試劑盒檢測結(jié)果陽性即判定為猴痘病毒DNA陽性。用中國計(jì)量科技院科學(xué)研究院猴痘病毒突變型F3L基因假病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線的縱坐標(biāo)為CT值,橫坐標(biāo)為濃度以10為底數(shù)的對(duì)數(shù)值,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中猴痘病毒的濃度,根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作過程中的實(shí)際濃縮倍數(shù),將核酸樣本中的猴痘病毒濃度換算成污水樣本中猴痘病毒的拷貝數(shù),單位為拷貝/毫升(copy/mL)。

1.2.3 擴(kuò)增子測序 檢測陽性的樣本均進(jìn)行擴(kuò)增子測序。使用杭州柏熠的猴痘病毒全基因組捕獲試劑盒進(jìn)行猴痘病毒全基因組靶向擴(kuò)增與富集,使用illumina nextseq2000進(jìn)行二代測序,數(shù)據(jù)比對(duì)分析參考nextclade2.14.0猴痘病毒分子分型系統(tǒng)(網(wǎng)址https：//clades.nextstrain.org/;更新時(shí)間2023-08-01)進(jìn)行比對(duì)和注釋,參考序列Reconstructed ancestral MPXV(ancestral),依據(jù)杭州柏熠科技有限公司猴痘全基因組分析軟件系統(tǒng)(數(shù)據(jù)庫構(gòu)建于GISAID猴痘病毒分子系統(tǒng)(https：//gisaid.org/)進(jìn)行溯源,并與本省輸入、本土病例猴痘病毒基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析、比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 污水中猴痘病毒檢出情況及含量 在26個(gè)污水樣本中,有8個(gè)樣本檢測出猴痘病毒陽性,檢出率30.8%(8/26)。結(jié)果見表1。

表1 污水中猴痘病毒含量及猴痘陽性病例數(shù)

2.2 猴痘基因組分型及溯源 8個(gè)陽性水樣經(jīng)測序后,得到175 266 746條聚類序列,經(jīng)過濾拼接后,得到173 707 771條聚類序列,均為西非分支Ⅱb C.1型。溯源的部分結(jié)果見表2。由表2可以看出,污水中檢出的猴痘病毒基因和臨床株非常相似,與2022年猴痘疫情暴發(fā)的基因組密切相關(guān)。

表2 部分污水中猴痘病毒的溯源

2.3 相似性分析 以hMpxV_China_YN-CDC-0001_2023猴痘病毒Ⅱb B.1.3為參考序列構(gòu)建進(jìn)化樹(圖1),并將所得的分離株序列進(jìn)行聚類分析(圖2)。由圖1可看出,進(jìn)化分支長度均小于0.1,說明進(jìn)化支變化的程度很小,污水中檢出的猴痘病毒基因與參考序列差異小,進(jìn)化距離近,親緣關(guān)系密切。由圖2可看出,各分離株序列之間也非常相似,相似性為99%以上,提示引起本次成都疫情的猴痘病毒的傳播鏈比較單一。

圖2 污水分離株中猴痘病毒DNA的相似性

3 討論

本次研究的采樣地點(diǎn)為成都市第九污水處理再生水廠,其是西南地區(qū)最大的再生水廠,每天污水處理規(guī)模100萬噸,服務(wù)于廣大的錦江流域,服務(wù)面積約195平方公里,服務(wù)人口600萬人,其轄區(qū)內(nèi)有成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心,成都市肛腸醫(yī)院等大型醫(yī)院,九眼橋、太古里等大型娛樂場所集合地。其中,成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心是本地最大的收治猴痘患者的定點(diǎn)醫(yī)院,九眼橋片區(qū)的娛樂場所是男男性行為人群主要的聚會(huì)交友地。在2023年6月成都檢出了首例猴痘陽性患者后,從7月到9月,成都市錦江區(qū)報(bào)告了猴痘陽性病例75例,其中7月34例,8月37例,9月4例(陽性病例數(shù)據(jù)來源于中國疾病預(yù)防控制信息系統(tǒng)的猴痘監(jiān)測報(bào)告管理模塊,陽性確診病例的判定標(biāo)準(zhǔn)為：經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測在咽拭子、肛拭子或痘痂任一標(biāo)本中猴痘病毒核酸陽性[4])。本次研究檢測的結(jié)果也與成都本次猴痘陽性感染的報(bào)道情況基本一致：7月感染人數(shù)快速上升,8月到達(dá)頂峰,9月數(shù)量大幅下降,所以在7月下旬首次在污水中檢出猴痘病毒,8月污水中病毒濃度升高,9月病毒濃度快速下降,到9月下旬降至低于檢出限或陰性。由基因測序的結(jié)果可以看出,污水中的猴痘病毒都與報(bào)道的臨床毒株高度相似,所以可以推定污水中的猴痘病毒均來自于患者或攜帶者的人體脫落物或排泄物。污水中猴痘病毒濃度與陽性報(bào)告病例的發(fā)生率基本呈正相關(guān),表明污水監(jiān)測是監(jiān)測猴痘感染傳播趨勢的可行方法[5-6]。

污水監(jiān)測是監(jiān)測傳染病威脅的一種敏感且具有低成本效益的輔助公共衛(wèi)生工具[7]。例如猴痘病毒,在中國主要經(jīng)由男男性行為人群密切接觸傳播[8],部分患者基于羞恥和偏見不愿就醫(yī),還有部分癥狀輕微的患者和無癥狀攜帶者未去就醫(yī),所以,社區(qū)中的真實(shí)患者和攜帶者的數(shù)量可能遠(yuǎn)高于報(bào)道的陽性病例數(shù)[9]。這也可能是在本次猴痘疫情中,陽性病例數(shù)并不多,但仍可在污水中檢出猴痘病毒的原因之一。污水監(jiān)測作為一種獨(dú)立于個(gè)人檢測的補(bǔ)充性監(jiān)測方法,它代表了來自社區(qū)的復(fù)合生物樣本[10]。排入污水的病原體的存在和濃度提供了相關(guān)疾病的信息,而無需個(gè)人層面的任何參與,從而為公共衛(wèi)生機(jī)構(gòu)和臨床醫(yī)生提供了一種獲得疾病流行態(tài)勢感知的新手段[11-12]。當(dāng)污水監(jiān)測提示某傳染病原廣泛存在或高于日常水平時(shí),可以提高公共衛(wèi)生響應(yīng)水平,提醒臨床醫(yī)生,并指導(dǎo)受影響地區(qū)的資源(例如檢測、疫苗和治療藥物)和人員的分配。

本次猴痘病毒檢測前處理,依據(jù)的是污水中新型冠狀病毒的濃縮方法,但猴痘患者遠(yuǎn)少于新型冠狀病毒患者,污水中猴痘病毒載量也遠(yuǎn)低于新型冠狀病毒[13]。在下一步的研究工作中,本課題組還將研究影響污水中猴痘檢測的因素[14],包括采樣時(shí)間地點(diǎn)、感染者的病毒脫落、環(huán)境持久性等[15],探討研究優(yōu)化濃縮和檢測方法,以提高污水中猴痘檢測的敏感性,從而使污水中猴痘監(jiān)測可用于非流行地區(qū)的猴痘的哨點(diǎn)監(jiān)測,并且融會(huì)貫通,讓污水中的病原體(如流感、手足口病、諾如等常見傳染病)監(jiān)測作為社區(qū)一級(jí)的哨點(diǎn)早期監(jiān)測,真正成為綜合性監(jiān)測的有效補(bǔ)充方法。