巴西蘇木素對(duì)MRSA丙氨酸消旋酶抑制作用的初步研究

黎 瑞,陳澤慧,周小仙,余孟飛,楊智芳,李明哲

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科,貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院,貴州 遵義 563099)

金黃色葡萄球菌是臨床上一種重要的病原菌,可引起一系列人類(lèi)疾病,包括輕微的皮膚感染、嚴(yán)重的組織感染和敗血癥[1]。目前,主要依靠抗菌藥物治療金黃色葡萄球菌引發(fā)的感染。然而,隨著耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA)的出現(xiàn),耐藥問(wèn)題日漸嚴(yán)重[2],該類(lèi)細(xì)菌不但對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi),還對(duì)糖肽類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)等多種抗菌藥物出現(xiàn)了耐藥性[3-4],使得臨床治療變得極為困難。因此,開(kāi)發(fā)具有抗MRSA感染的新型藥物迫在眉睫。

在探索新藥物的過(guò)程中,天然產(chǎn)物一直是重要來(lái)源[5]。巴西蘇木素(Brazilin,BN)是一種從中藥材蘇木中分離提取的天然產(chǎn)物,是蘇木主要活性成分之一,分子式為C16H14O5。其具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌的作用,同時(shí)還具備降血糖和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性[6]。研究發(fā)現(xiàn)BN對(duì)MRSA具有抗菌作用,可導(dǎo)致MRSA細(xì)胞膜通透性增加、DNA與RNA等大分子物質(zhì)外滲增加以及可溶性蛋白表達(dá)減少[7]。然而,目前尚無(wú)BN通過(guò)影響MRSA細(xì)胞壁合成來(lái)發(fā)揮抑菌作用的報(bào)道。細(xì)胞壁是細(xì)菌及植物細(xì)胞所特有的結(jié)構(gòu),可保持細(xì)胞的完整性,對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)和分裂至關(guān)重要。參與細(xì)菌細(xì)胞壁合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶一直是研發(fā)抗菌藥物靶標(biāo)的熱點(diǎn)。其中丙氨酸消旋酶(alanine racemase, Alr)是一種吡哆醛-5'-磷酸依賴性細(xì)菌酶,參與細(xì)菌細(xì)胞壁的合成,為其提供肽聚糖交聯(lián)所必需的前體D-丙氨酸,對(duì)細(xì)菌的存活至關(guān)重要[8-9]。由于人類(lèi)細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),而Alr廣泛存在于細(xì)菌中[10-11]。因此,Alr成為抗菌藥物研發(fā)的理想靶標(biāo)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)BN能夠破壞MRSA細(xì)胞壁肽聚糖的合成,在對(duì)BN作用MRSA菌株前后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后,發(fā)現(xiàn)BN可以下調(diào)細(xì)胞壁肽聚糖合成過(guò)程中D-Ala代謝途徑的關(guān)鍵酶Alr的調(diào)控基因Alr。因此,基于BN對(duì)MRSA有較好的抗菌效果,進(jìn)一步的探明該效果是通過(guò)抑制Alr的活性而發(fā)揮的作用,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 巴西蘇木素(成都普思生物科技股份有限公司),純度≥98%;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN公司)、通用型DNA純化回收試劑盒(TIANGEN公司);限制性內(nèi)切酶HindⅢ、XhoⅠ、T4DNA連接酶(大連TaKaRa公司)、蛋白Marker(Solarbio公司)、磷酸吡哆醛(MACKLIN公司)、L-丙氨酸(Solarbio公司)、D-氨基酸氧化酶(Aladdin公司)、4-氨基安替比林(MACKLIN公司)、辣根過(guò)氧化物酶(Solarbio公司)、TOOS(MACKLIN公司)、Britton-Robinson緩沖液(北京雷根生物技術(shù)有限公司)、Tris-Hcl(Solarbio公司)。

1.2 主要儀器 JY300C型電泳儀(北京君意東方電泳公司)、YJ-SCZ 2+型垂直電泳槽(北京君意東方電泳公司);T100型PCR儀(美國(guó) Bio-Rad公司);K5600型超微量分光光度計(jì)(北京凱奧科技發(fā)展有限公司);MultisKan型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Scientific 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)菌株 MRSA ATCC 43300購(gòu)于上海寶錄生物有限公司。

1.4 方法

1.4.1 丙氨酸消旋酶的克隆、表達(dá)及純化 (1)PCR擴(kuò)增及切膠回收Alr于NCBI(accession號(hào)為NC_002952)檢索獲得金黃色葡萄球菌Alr基因序列,通過(guò)SnapGene軟件設(shè)計(jì)引物。通過(guò)聚合酶鏈反(polymerase chain reaction, PCR)克隆MRSA ATCC 43300的Alr基因,并進(jìn)行切膠回收。 PCR擴(kuò)增Alr所需引物(下劃線部分分別是HindⅢ和XhoⅠ的酶切位點(diǎn))及質(zhì)粒(表1)。

表1 PCR擴(kuò)增Alr所需引物及質(zhì)粒

(2)pET-28a-Alr重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定使用限制性內(nèi)切酶HindIII和XhoI雙酶切Alr基因及pET-28a質(zhì)粒,將其混合后,進(jìn)行連接。熱激轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,提取重組質(zhì)粒并送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,將正確的命名pET-28a-Alr,于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?3)pET-28a-Alr重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)、表達(dá)及純化通過(guò)熱激法獲得BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞后,將pET-28a-Alr轉(zhuǎn)入其中,用終濃度為0.05 mmol/L的IPTG,于20 ℃,120 r/min下誘導(dǎo)12～16 h,收集菌體進(jìn)行超聲破菌后,經(jīng)鎳離子金屬親和層析法純化上清液中的Alr蛋白[12]。然后通過(guò)SDS-PAGE法檢測(cè)Alr的純度,以超濾杯進(jìn)行脫NaCl、脫咪唑并濃縮蛋白。使用BCA法對(duì)濃縮蛋白定量后分裝保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 BN抑制Alr活性實(shí)驗(yàn) Alr活性測(cè)定采用消旋反應(yīng)及氧化反應(yīng)兩步法進(jìn)行測(cè)定[13]。(1)消旋反應(yīng)在總體積為200 μL的反應(yīng)體系中分別加入終濃度為20 mmol/L的Britton-Robinson緩沖液、125 mmol/L L-丙氨酸、10 μmol/L輔酶PLP、適量純化的Alr及終濃度分別為 8、16、32、64 μg/mL 的BN,同時(shí)設(shè)立對(duì)照組。置于37℃ 培養(yǎng)10 min,然后加入25 μL 2 mol/L HCl終止反應(yīng)的進(jìn)行,于冰上靜置2 min后加入相同體積的NaOH溶液,將多余的酸中和,得到消旋反應(yīng)產(chǎn)物,隨后將其離心并吸取上清轉(zhuǎn)移至新Ep管中。(2)氧化反應(yīng)在總體積為200 μL的反應(yīng)體系中分別加入0.1 mg/L 4-氨基安替吡啉、0.1 U D-氨基酸氧化酶、0.1 mg/L TOOS、100 mmol/LTris-HCl(pH=8.0)、2 U過(guò)氧化物酶及適量消旋反應(yīng)產(chǎn)物。37 ℃培養(yǎng)20 min,用酶標(biāo)儀測(cè)定550 nm處吸光度值。Alr酶活力定義：1 min內(nèi)催化L-Ala生成1 μmol D-丙氨酸所需的酶量為一個(gè)酶活性單位(U) 。每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行,重復(fù)3次。

1.4.3 細(xì)胞熱穩(wěn)定遷移實(shí)驗(yàn)(CETSA) 將pET28a-Alr重組質(zhì)粒進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),超聲破菌后離心,從上清液中獲得總蛋白。取 600 μL 上清液用128 μg/mL BN進(jìn)行處理,同時(shí)設(shè)立對(duì)照組。 37 ℃ 孵育1 h,12 000×g離心 20 min。將上清液進(jìn)行分裝,每管60 μL,共6管。分別在30、45.7、50、55.9、59.5、64 ℃ 溫度下孵育10 min,將樣品在12 000×g下離心 20 min,得到上清液。所有樣品進(jìn)行蛋白免疫印跡檢測(cè),獨(dú)立重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.4.4 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn) 將上一步所得上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳。在轉(zhuǎn)膜后,進(jìn)行封閉2 h,在4℃條件下與抗-Alr多克隆抗體孵育過(guò)夜,然后用TBST進(jìn)行洗滌,1次10 min,共3次,接著用山羊抗鼠抗體孵育,37℃,2 h后,ECL顯色雜交條帶,以檢測(cè)Alr的表達(dá)水平。

1.4.5 分子對(duì)接 在Alphafold數(shù)據(jù)庫(kù)檢索Alr蛋白結(jié)構(gòu)文件。將Alr蛋白指定為受體,小分子BN指定為配體。PyMOL(4.3.0版)軟件(https：//pymol.org/)用于分子結(jié)構(gòu)和對(duì)接結(jié)合物的可視化。

AutodockTools(http：//mgltools.scripps.edu/downloads)用于加氫,檢查電荷,將原子類(lèi)型指定為AD4類(lèi)型,計(jì)算gasteiger,并構(gòu)建受體蛋白的對(duì)接網(wǎng)格盒,此外,配體小分子BN應(yīng)確定Root,在AutodockTools中選擇配體的可扭轉(zhuǎn)鍵。最后,在AutodockTools中,受體分子和配體分子的格式都應(yīng)該從“.mol2”轉(zhuǎn)換為“.PDBQT”,以便進(jìn)一步對(duì)接。利用Vina對(duì)接后,計(jì)算小分子BN與該蛋白組合的得分,并使用PyMOL和Discovery Studio軟件進(jìn)行作用力分析和可視化。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增Alr基因及pET-28a-Alr原核表達(dá)載體的構(gòu)建 以MRSA ATCC 43300菌株的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增Alr基因,目的基因片段的大小為1 149 bp,符合預(yù)期分子量(圖1A)。將目的基因克隆入pET-28a載體中并轉(zhuǎn)化至DH5α中,進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證,結(jié)果顯示所有目的條帶的大小均符合預(yù)期(圖1B)。

A：Alr基因PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果(marker：DNA標(biāo)記DL2000 bp;1：擴(kuò)增的Alr基因);B：菌液PCR鑒定結(jié)果(M：DNA標(biāo)記DL2000 bp;1：陽(yáng)性對(duì)照;2～8：陽(yáng)性克隆菌)。圖1 pET28a-Alr重組質(zhì)粒的構(gòu)建

2.2 MRSA Alr蛋白的誘導(dǎo)、表達(dá)及純化 用IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞的重組質(zhì)粒,收集超聲后的菌上清,再經(jīng)過(guò)鎳親和層析法純化后,純度較高的Alr蛋白在60、80、100、150 mmol/L咪唑洗脫液中獲得。純化得到的Alr蛋白的分子量為48 kDa左右(圖2),與預(yù)期的蛋白分子量一致,檢測(cè)Alr蛋白濃度約為1.2 mg/mL。

marker：180 kD蛋白標(biāo)記;1：未誘導(dǎo);2：誘導(dǎo)全菌;3：誘導(dǎo)離心后上清;4：流穿液;5：10 mmol/L咪唑;6：20 mmol/L咪唑：7：30 mmol/L咪唑;8：40 mmol/L咪唑;9：60 mmol/L咪唑;10： 80 mmol/L咪唑;11：100 mmol/L咪唑;12：150 mmol/L咪唑。 圖2 Alr蛋白純化的SDS-PAGE結(jié)果

2.3 BN對(duì)Alr酶活性的抑制 與對(duì)照組相比,8～64 μg/mL巴西蘇木素均抑制了Alr活性(P<0.01),且呈一定劑量相關(guān)性,其中64 μg/mL抑制率達(dá)到約50%(圖3)。

2.4 BN與Alr蛋白的相互作用 CETSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在55.9～59.5℃下BN處理后的Alr蛋白熱穩(wěn)定性明顯高于Mock組(P<0.0001),提示BN與Alr蛋白有直接結(jié)合的相互作用關(guān)系(圖4)。

2.5 分子對(duì)接 將單體巴西蘇木素(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5)與Alr蛋白進(jìn)行對(duì)接,利用Vina對(duì)接后,計(jì)算小分子巴西蘇木素與該蛋白組合的得分,并使用PyMOL和Discovery Studio軟件進(jìn)行作用力分析和可視化。將Alr蛋白指定為受體,將小分子巴西蘇木素指定為配體。結(jié)果見(jiàn)圖6,配體小分子巴西蘇木素與受體蛋白Alr之間的結(jié)合能為-8.0 kcal/mol,其可通過(guò)5條分別為2.9、3.1、3.4、3.3、4.0 ?的氫鍵分別與受體蛋白Alr的221號(hào)GLY氨基酸殘基、204號(hào)SER氨基酸殘基、219號(hào)ARG氨基酸殘基、43號(hào)TYR氨基酸殘基和222號(hào)ILE氨基酸殘基結(jié)合;此外,配體小分子巴西蘇木素可通過(guò)2條分別為3.5 ?的疏水作用力和3.0 ?的氫鍵均與受體分子Alr的203號(hào)ASN氨基酸殘基結(jié)合;還可通過(guò)1條3.8 ?的疏水作用力和1條4.0 ?的氫鍵分別與受體分子Alr的352號(hào)ILE氨基酸殘基和169號(hào)PHE氨基酸殘基結(jié)合;還可通過(guò)2條分別為4.0 ?的疏水作用力和4.2 ?的面對(duì)面π-π堆疊力均與受體分子Alr的354號(hào)TYR氨基酸殘基結(jié)合。此外,二維作用力分析也得到了相似的結(jié)果。

圖5 巴西蘇木素結(jié)構(gòu)

3 討論

由于MRSA菌株對(duì)大多數(shù)抗菌藥物均出現(xiàn)了耐藥性,導(dǎo)致臨床治療變得非常困難。因此,需要研發(fā)新的抗菌藥物來(lái)預(yù)防和治療MRSA感染。Alr是細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖合成的關(guān)鍵酶,因其廣泛存在于原核生物中,而在哺乳動(dòng)物中較少,這使得其成為抗菌藥物的靶點(diǎn)。

針對(duì)Alr抑制劑的研發(fā)已成為重點(diǎn),根據(jù)其抑制機(jī)制的不同,可分為以下3種。①底物類(lèi)似物抑制劑,其與酶的底物結(jié)構(gòu)相似,通過(guò)與酶的活性位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,阻止底物的結(jié)合和酶的催化活性,從而抑制酶活性。D-環(huán)絲氨酸是底物類(lèi)似物抑制劑,其結(jié)構(gòu)與丙氨酸類(lèi)似,一般作為二線藥物用于治療結(jié)核病。Amorin-Franco等[14]發(fā)現(xiàn)D-環(huán)絲氨酸除了抑制Alr外,還抑制其他不相關(guān)的磷酸吡哆醛(PLP)依賴性酶,引起嚴(yán)重的不良反應(yīng),如頭痛、抑郁及嗜睡等。因此,開(kāi)發(fā)具有更高特異性的Alr抑制劑仍然十分必要。②非底物類(lèi)似物抑制劑,用來(lái)克服PLP相關(guān)的脫靶效應(yīng)的酶抑制劑,其通過(guò)與酶活性中心不同的位點(diǎn)結(jié)合,改變酶的構(gòu)象,從而抑制酶的催化活性。Wang等[15]首次證實(shí)了高龍膽酸和對(duì)苯二酚對(duì)嗜水氣單胞菌的抗菌活性,且它們均是非底物類(lèi)似物抑制劑,通過(guò)與Alr活性位點(diǎn)結(jié)合發(fā)揮抑制作用。雖然非底物類(lèi)似物抑制劑不與其他PLP依賴性酶結(jié)合,但研究發(fā)現(xiàn)此類(lèi)抑制劑仍會(huì)產(chǎn)生一定的細(xì)胞毒性。因此,尋找對(duì)人類(lèi)毒副作用更小的Alr抑制劑十分重要。③中草藥抑制劑,中草藥在我國(guó)資源豐富,因其成本低,副作用小等優(yōu)點(diǎn)而廣受關(guān)注。Kumari等[16]通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和分子對(duì)接對(duì)85種植物的化學(xué)成分進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)1,8-桉葉油腦、庚酸和芳樟醇與Alr結(jié)合能比底物丙氨酸的低,具有較高的生物活性評(píng)分。盡管BN被發(fā)現(xiàn)可以抑制MRSA菌株[17],但目前尚未有研究證明這種抑菌效果是通過(guò)抑制Alr來(lái)實(shí)現(xiàn)的。因此,本研究通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)Alr,進(jìn)行體外活性實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證BN作為Alr抑制劑的可能性。結(jié)果表明BN能夠較好抑制Alr活性,且有濃度依賴關(guān)系。為了進(jìn)一步研究BN抑制Alr活性的機(jī)制,首先需要證明BN是否直接與Alr結(jié)合,Prabhu等[18]發(fā)現(xiàn)當(dāng)藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí),蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性會(huì)發(fā)生變化。因此,本研究通過(guò)CETSA實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,該實(shí)驗(yàn)是一種用于評(píng)估藥物與蛋白質(zhì)相互作用的方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BN能夠與Alr蛋白相互結(jié)合并提高其熱穩(wěn)定性。但它們是如何結(jié)合的仍不清楚,為此本研究通過(guò)分子對(duì)接進(jìn)行了預(yù)測(cè)。分子對(duì)接是一種計(jì)算方法,用于預(yù)測(cè)藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合方式及結(jié)合能力。文獻(xiàn)報(bào)道,當(dāng)結(jié)合能為負(fù)值時(shí)說(shuō)明配體與受體之間可以自發(fā)結(jié)合[19]。本文對(duì)接結(jié)果顯示BN與Alr之間的結(jié)合能為-8.0 kcal/mol,說(shuō)明二者可以自發(fā)結(jié)合。研究表明,在Alr活性位點(diǎn)入口通道的殘基有助于確保底物的準(zhǔn)確進(jìn)入和定位到活性位點(diǎn),從而實(shí)現(xiàn)催化反應(yīng)的進(jìn)行[20];Alr通常以二聚體形式存在,在其活性位點(diǎn)及結(jié)合口袋中存在的殘基可提供穩(wěn)定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),維持酶的活性[21]。

對(duì)接結(jié)果顯示BN與Alr活性位點(diǎn)的Gly221、Phe169形成氫鍵作用,與Alr結(jié)合口袋中的Asn203形成疏水作用,這些氫鍵及疏水等作用有助于增加BN與Alr之間的穩(wěn)定性;與Alr活性位點(diǎn)中的Arg219、Ser204、Ile222和Tyr43等氨基酸殘基形成氫鍵作用,從而影響Alr與PLP結(jié)合發(fā)揮作用的穩(wěn)定性;與其活性位點(diǎn)通道的Ile352形成疏水作用,同時(shí)與Tyr354形成疏水作用及面對(duì)面π-π堆積相互作用,通過(guò)占據(jù)活性位點(diǎn)通道進(jìn)而影響Alr活性。

綜上所述,BN可能是通過(guò)與MRSA 菌株Alr的活性位點(diǎn)及其通道處的氨基酸形成氫鍵或疏水作用進(jìn)而抑制Alr的活性,為后續(xù)研究BN作為Alr抑制劑進(jìn)而抗MRSA感染提供了理論依據(jù)。