銅綠假單胞菌單PilZ結構域蛋白PA0012和PA4324突變體生物學表型的初步篩選

趙 朔,盛 碩

(1.遵義醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院電鏡室,貴州 遵義 563099;2.華南農(nóng)業(yè)大學 群體微生物研究中心/廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室,廣東 廣州 510642;3.遵義醫(yī)科大學 基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室, 貴州 遵義 563099)

銅綠假單胞菌是一種常見的革蘭陰性致病菌,其對寄主的感染可分為急性感染和慢性感染[1],從這兩種不同的感染中分離得到的銅綠假單胞菌具有不同的毒性特征[2]。環(huán)二鳥苷酸(cyclic diguanosine monophosphate,c-di-GMP)是1987年在木葡糖酸醋桿菌中被首次鑒定的一種能夠激發(fā)纖維素合成酶構象改變的小分子[3]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)c-di-GMP不僅僅存在于這一種細菌中,也廣泛存在于其它細菌中,并且對細菌生物被膜的形成有重要調控作用[4-5]。

C-di-GMP能夠由含有GGDEF結構域的二鳥苷酸環(huán)化酶(diguanylate cyclase, DGC)催化兩分子三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate, GTP)環(huán)化形成,以及被含有EAL或HD-GYP 結構域的磷酸二酯酶(phosphodiesterase, PDE)特異性地水解。在細菌體內,DGC和PDE緊密地控制著c-di-GMP的濃度,c-di-GMP的受體能通過結合c-di-GMP并與其它蛋白相互作用而導致細胞內的生理變化。含PilZ結構域的蛋白是最早被發(fā)現(xiàn)的c-di-GMP受體,并且與其它受體蛋白相比較,PilZ結構域蛋白與c-di-GMP結合能力最強,是最廣泛存在于細菌中的c-di-GMP受體。PilZ結構域中的2個基序對c-di-GMP的結合有重要作用,(D/N)xSxxG基序能夠結合c-di-GMP,RxxxR基序能夠在c-di-GMP附近形成環(huán)狀,且2個精氨酸(R)能夠與c-di-GMP形成氫鍵。

單PilZ結構域蛋白是所有PilZ結構域蛋白中數(shù)量最多的一類,它們通常由80～160個氨基酸組成。單PilZ結構域蛋白也被認為是最難研究的一類PilZ結構域蛋白,相比較于多結構域PilZ蛋白,它們缺少其它結構域為鑒定蛋白功能提供線索。銅綠假單胞菌PAO1的基因組一共編碼有8個含PilZ結構域的蛋白,其中PilZ (PA2960),HapZ (PA2799),MapZ (PA4608),PA0012和PA4324是單PilZ結構域蛋白,PilZ(PA2960)是銅綠假單胞菌PAO1產(chǎn)生四型菌毛(T4P)所必要的蛋白[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)HapZ(PA2799)能夠直接與組氨酸激酶SagS相互作用,阻斷SagS向其下游的HptB的磷酸轉移[7],MapZ(PA4608)能夠跟甲基轉移酶CheR1結合,并抑制趨化受體蛋白PctA的甲基化,通過改變趨化受體的甲基化程度來調節(jié)細菌鞭毛轉動方向變化的頻率[8]。 然而,PA4324和PA0012這2個單PilZ結構域蛋白的功能仍然不清楚,這也是本論文的研究主題。

C-di-GMP的典型作用是作為“黏合劑”將2個結構域或者蛋白的距離拉得更近,造成構象的改變,從而觸發(fā)下游的信號傳導。不同的PilZ結構域蛋白與c-di-GMP的結合方式也不一樣[9],比如MapZ(PA40608)蛋白與插入式的c-di-GMP結合,而PlzD(VCA0042)蛋白與c-di-GMP單體結合。此外,PilZ結構域還可以通過構象改變靈活地轉換與c-di-GMP的結合方式。然而,也有不能與c-di-GMP結合的含PilZ結構域的蛋白,比如銅綠假單胞菌中的蛋白PA2960[10]。因此,不同的PilZ結構域蛋白突變可能觸發(fā)不同的c-di-GMP信號傳導方式,進而影響不同的生物學表型。本論文主要內容為研究PA4324和PA0012對銅綠假單胞菌生物學表型的影響,本研究首先利用同源重組的方法進行基因敲除,得到突變體菌株ΔPA0012和ΔPA4324,隨后,以野生型菌株PAO1為對照,對2個突變體進行表型篩選,本研究發(fā)現(xiàn)這2個基因的突變導致銅綠假單胞菌的表型變化非常相似,然而,在轉錄水平上2個蛋白突變導致的差異基因卻有明顯差異,這些基因所涉及的信號通路也不盡相同。本項研究將能夠使研究者更進一步理解銅綠假單胞菌中單PilZ結構域蛋白功能的多樣性和重要性,為進一步研究它們調控致病性的機理提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒和培養(yǎng)條件 本文用到的所有菌株和質粒均列在表1中。編碼完整或部分蛋白質的DNA片段都是根據(jù)已知的銅綠假單胞菌PAO1基因組序列設計引物,利用PCR手段以該菌的基因組DNA為模板擴增得來的,本文中PCR和分子克隆所使用的所有引物均在表2中進行了總結。質粒都是由標準的分子克隆技術構建完成的,除非有特殊說明?；蚯贸褂猛粗亟M的方法。

表1 菌株和質粒匯總

表2 PCR和分子克隆所用引物

1.1.2 主要試劑 實驗中用到的抗生素如卡那霉素(Kan) 、羧芐青霉素(Cb)、慶大霉素(Gen)等均購自生工生物工程(上海)股份有限公司;LB等培養(yǎng)基和瓊脂粉用的是BD品牌產(chǎn)品;T4 連接酶、PCR 反應高保真酶以及各種限制性內切酶用的是NEB品牌產(chǎn)品;質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒用的是Axygen品牌產(chǎn)品;PCR 反應Taq酶購自全式金生物技術有限公司;實驗所用到的引物合成和DNA片段的一代測序均由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 基因敲除突變體的構建 構建基因敲除突變菌株用的是同源重組的實驗方法,選用的是自殺質粒pK18GT。先將基因上下游同源臂融合并克隆到pK18GT上,轉化入感受態(tài)細胞DH5α中,隨后將DH5α與PAO1和含有輔助質粒的大腸桿菌進行三親雜交,篩選出被pK18GT重組質粒插入到基因組上的銅綠假單胞菌,再在蔗糖-LB平板上劃線,挑取缺失PA0012片段大小的PCR產(chǎn)物所對應的單菌落。

1.2.2 生長曲線實驗 挑取單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r/min過夜培養(yǎng),隨后將所得菌液稀釋至OD600≈0.2。取稀釋好的100 μL菌液放進全自動生長曲線儀設置37 ℃,150 r/min,測生長曲線48 h。

1.2.3 群集運動實驗 該實驗使用的培養(yǎng)基是營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。挑取單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r/min過夜培養(yǎng)。隨后將搖好的種子液接種至現(xiàn)配好的營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基平板中央,37 ℃正置培養(yǎng)過夜。

1.2.4 線蟲慢殺死實驗 該實驗使用的培養(yǎng)基是NG固體培養(yǎng)基。挑約30頭L4期的雌雄同體線蟲到涂有銅綠假單胞菌的NG平板上,20～25 ℃正置培養(yǎng)。在開始培養(yǎng)之后大約12～24 h開始計數(shù),一共觀察7 d,每天取2～3個時間點計數(shù)剩余的線蟲。

1.2.5 脫脂牛奶瓊脂平板實驗 該實驗使用的培養(yǎng)基是脫脂奶粉固體培養(yǎng)基。挑取單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r/min過夜培養(yǎng)。隨后,吸取20 μL菌液加入提前打好孔的脫脂奶粉固體平板的孔中,37 ℃過夜培養(yǎng),然后測量每個孔周圍的蛋白降解圈直徑。

1.2.6 生菜感染實驗 該實驗使用的培養(yǎng)基是LB液體培養(yǎng)基,重懸菌體使用的是10 mmol/L硫酸鎂溶液。挑取單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r/min過夜培養(yǎng)。隨后用硫酸鎂溶液重懸,取10 μL菌液注射進潔凈的生菜葉片中,同時注射硫酸鎂溶液作為對照,將接種過的生菜葉片放在無菌的盒子中放入30 ℃培養(yǎng)5 d,每天觀察1次。

1.2.7 RNA測序分析 首先,對總RNA的樣品檢測, RNA質量檢測達標以后,進行文庫的構建,主要包括去除rRNA,打斷mRNA并合成雙鏈cDNA,給純化后的cDNA加上測序接頭并進行片段大小選擇,然后將選擇好的片段進行PCR擴增,并將所得PCR產(chǎn)物純化,即得了所需文庫。最后,對文庫進行質量檢測,將庫檢合格的文庫進行HiSeq/MiSeq測序。將所得到的原始數(shù)據(jù)參照銅綠假單胞菌的參考基因組進行生物信息學的分析。

2 結果

2.1 PA0012和PA4324氨基酸序列比對 本研究將PA0012、PA4324、MapZ和HapZ這4個銅綠假單胞菌中單PilZ結構域蛋白的氨基酸序列進行比對,其中MapZ和HapZ是c-di-GMP結合位點已知的2個蛋白。比對結果發(fā)現(xiàn)它們具有高度保守的能夠與c-di-GMP結合的(D/N)xSxxG基序和RxxxR基序,但其他部分氨基酸序列則存在明顯的差異(圖1)。

A：4個單PilZ結構域蛋白氨基酸序列比對結果,方框內為最保守的氨基酸位點;B：4個單PilZ結構域蛋白的N端部分氨基酸序列標識,紅色星號下的氨基酸為預測的c-di-GMP結合位點。圖1 序列比對和序列標識

2.2PA0012和PA4324基因突變不顯著影響生長曲線 在進行突變體表型篩選之前,本研究首先進行了生長曲線的測定,以確定這2個基因突變不會影響細菌的生長,本實驗采用的是LB液體培養(yǎng)基。用Bioscreen C全自動生長曲線儀所測得的實驗結果顯示,相比較于野生型菌株PAO1,突變體ΔPA0012和ΔPA4324的生長曲線沒有顯著性的變化,不接種菌液的LB培養(yǎng)基作為該實驗的陰性對照(圖2)。該結果表明,銅綠假單胞菌PA0012和PA4324基因突變不會顯著性影響細菌的生長,可進行下一步的表型篩選實驗。

PAO1：野生型;ΔPA0012、ΔPA4324：突變型;LB：培養(yǎng)基。圖2 菌株的生長曲線比較

2.3ΔPA0012和ΔPA4324的群集運動能力顯著增強 本研究對2個突變體群集運動的能力進行了檢測,實驗在半固體培養(yǎng)基上進行。實驗結果顯示,相比較于野生型菌株PAO1,2個突變菌株的群集運動能力均有顯著增強,并且均能夠被互補(P<0.05,圖3A)。表型互補是將蛋白用pUCP18載體在對應的突變菌株中表達,由于互補菌株中含有載體,故在野生型菌株和突變菌株中都加入pUCP18空載體,排除載體影響表型的可能性,在觀察群集運動現(xiàn)象的同時,本研究也用尺子對運動區(qū)域的直徑進行了測量,PA0012和PA4324突變后,運動區(qū)域直徑顯著增加且能夠被互補(圖3B～C)。結果表明,PA0012和PA4324對銅綠假單胞菌的群集運動均具有顯著的負調控作用。

A：2個含有空質粒的單PilZ結構域蛋白突變體ΔPA0012 (p), ΔPA4324 (p)及其互補體ΔPA0012 (c), ΔPA4324 (c)與含有空質粒的野生型菌株PAO1 (p)群集運動能力的比較;B：2個含有空質粒的單PilZ結構域蛋白突變體ΔPA0012 (p)、 ΔPA4324 (p)與含有空質粒的野生型菌株PAO1 (p)群集運動區(qū)域直徑的比較;C：2個單PilZ結構域蛋白突變體的互補體ΔPA0012(c)、 ΔPA4324 (c)與含有空質粒的野生型菌株PAO1 (p)群集運動區(qū)域直徑的比較。圖3 群集運動表型

2.4ΔPA0012和ΔPA4324慢殺死秀麗隱桿線蟲的能力和蛋白酶活性無顯著改變 秀麗隱桿線蟲是一種模式動物,相關研究中用它作為寄主,模擬銅綠假單胞菌對人或者動物的感染。本研究用ΔPA0012,ΔPA4324和野生型菌株PAO1分別對線蟲進行了慢殺死實驗,結果顯示ΔPA0012和ΔPA4324均與野生型菌株無顯著性差異(P>0.05,圖4A)。本實驗以大腸桿菌OP50作為陰性對照。上述結果表明,PA0012和PA4324基因突變均不會顯著影響銅綠假單胞菌PAO1對秀麗隱桿線蟲的慢殺死。

蛋白酶包括多個種類,它們的活性在銅綠假單胞菌感染寄主時能夠起到重要作用,它們能夠水解寄主的免疫蛋白,從而導致發(fā)病。本實驗用脫脂牛奶固體培養(yǎng)基檢測了ΔPA0012、ΔPA4324和野生型菌株PAO1產(chǎn)生的總蛋白酶的水解活性。實驗結果顯示,相比較于野生菌株,2個突變菌株產(chǎn)生的蛋白水解酶的活性沒有顯著性改變(圖4B)。該結果表明PA0012和PA4324基因突變均不會顯著影響銅綠假單胞菌PAO1總蛋白酶對脫脂奶粉的水解活性。

2.5 ΔPA0012和ΔPA4324感染生菜的能力顯著減輕 銅綠假單胞菌能夠感染十字花科植物早已經(jīng)被報道過。本研究用ΔPA0012和ΔPA4324分別去感染生菜,在每片生菜葉上同樣也接種野生型菌株PAO1,比較同一片菜葉上突變體菌株與野生型菌株感染的差別,所有細菌均用硫酸鎂溶液懸浮,并且以硫酸鎂溶液作為對照,以防止葉片因缺鎂產(chǎn)生變化。本研究的實驗結果顯示,相比較于野生型菌株PAO1,2個突變菌株感染生菜的情況顯著減輕(圖5)。該實驗結果表明,PA0012和PA4324基因突變均能導致銅綠假單胞菌感染生菜的情況顯著減輕。

A：突變體ΔPA0012與野生型菌株PAO1感染生菜的比較;B：突變體ΔPA4324與野生型菌株PAO1感染生菜的比較。圖5 ΔPA0012和ΔPA4324感染生菜表型

2.6 ΔPA0012和ΔPA4324的RNA測序分析 在進行了表型篩選之后,進行了RNA測序分析。本研究以log2(基因表達倍數(shù)變化) ≥ 0或 ≤ 0為界限,結果顯示,相比較于野生型菌株PAO1,ΔPA0012有612個基因表達量上調,有144個基因表達量下調;ΔPA4324有521個基因表達量上調,有102個基因表達量下調(圖6A)。ΔPA0012所引起表達量有差異的基因廣泛分布于微生物代謝等在內的多種通路中,將這些差異基因的功能分類,又可分為代謝、催化等多種類型,如其通路富集統(tǒng)計散點圖(前20位)所示(圖6B)。 ΔPA4324所引起表達量有差異的基因廣泛分布于包括核糖體等在內的多種通路中,如其通路富集統(tǒng)計散點圖(前20位)所示(圖6C)。將這些差異基因的功能分類,又可分為代謝、結合和催化等多種類型。本研究用韋恩圖對2個突變體的共有差異基因進行了分析,發(fā)現(xiàn)相比較于野生型菌株,ΔPA0012與ΔPA4324有148個共有差異基因(圖6D)。

以上RNA測序結果表明,2個突變體有一些共同的差異基因,暗示了它們在調控銅綠假單胞菌生理進程的過程中可能存在著某些相近的方式。然而,PA0012和PA4324基因的突變也導致了銅綠假單胞菌中某些不同基因的差異表達。PA0012和PA4324這2個蛋白對銅綠假單胞菌生理進程的調控具有復雜的網(wǎng)絡,還需進一步結合它們的互作蛋白進行研究。

3 討論

本文對銅綠假單胞菌PA0012和PA4324這2個單PilZ結構域蛋白突變體的主要生物學表型進行了初步篩選,篩選結果表明,雖然它們影響的生物學表型較為相似,但轉錄組分析還是有明顯的差異。根據(jù)蛋白氨基酸序列的差異,自然界中的單PilZ結構域蛋白又可以分為很多類,因此不同氨基酸序列的單PilZ結構域蛋白可能具有不同的生物學功能。本次研究的這2個蛋白氨基酸序列存在差異,說明它們的轉錄組存在差異也是合理的。雖然RNA測序的結果還需要進一步驗證,但是,這些結果結合前期表型篩選的結果已經(jīng)足以表明PA0012和PA4324能夠影響銅綠假單胞菌的生物學表型。

根據(jù)本研究的實驗結果,PA0012和PA4324的突變均能夠導致銅綠假單胞菌PAO1的群集運動能力增強,并且可以被互補。C-di-GMP對群集運動的調控具有關鍵的作用,細胞內高濃度的c-di-GMP能夠促進細菌生物被膜的形成,并且抑制其群集運動[11]。從2005年開始,研究人員就陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些能夠調控生物被膜形成的c-di-GMP代謝酶,隨著研究的不斷深入,近幾年又發(fā)現(xiàn)RmcA、WspR、MorA、PipA、SiaD和SiaA等c-di-GMP的代謝酶也能夠調控綠膿桿菌生物被膜的形成[12-16],也有研究者發(fā)現(xiàn)c-di-GMP受體蛋白FlgZ能夠調節(jié)銅綠假單胞菌的群集運動[17],FlgZ 蛋白是含有PilZ結構域的雙結構域蛋白,根據(jù)報道,它能夠依賴于c-di-GMP與運動促進定子MotC特異地互作,從而影響細菌的群集運動[17]。在銅綠假單胞菌編碼的4個可結合c-di-GMP的單PilZ結構域蛋白中,前期報道了HapZ能夠與雜合組氨酸激酶SagS相互作用[7],MapZ能跟甲基轉移酶CheR1相互作用[8],而對于PA0012和PA4324這2個蛋白,了解還很有限。

C-di-GMP通路能夠影響多種植物和人體/動物病原菌的毒性。C-di-GMP信號通路首次被發(fā)現(xiàn)能夠影響毒性是在霍亂弧菌中(V.cholerae),高c-di-GMP濃度能夠減輕霍亂弧菌對幼鼠的毒性。通過之前的研究,人們認為細菌的急性感染只需要低濃度的c-di-GMP,甚至不需要c-di-GMP,比如將鼠疫耶爾森菌(Yersiniapestis)中的某些有功能的DGC敲除以后并不影響細菌對小鼠的毒性[18]。有研究者將沙門菌(Salmonellaenterica)中所有含GGDEF結構域的基因敲除以后,發(fā)現(xiàn)細菌的毒性減弱,然而在突變體中互補一個沒有c-di-GMP合成酶活性的二鳥苷酸環(huán)化酶STM4551就能將細菌對小鼠的毒性恢復回去,該結果表明c-di-GMP在沙門菌該種感染模型中不起作用[19]。還有研究者將羊布魯桿菌(Brucellamelitensis)中所有的PDE進行了敲除,發(fā)現(xiàn)細菌感染小鼠的毒性會降低,而敲除所有的DGC之后則細菌對小鼠的毒性增強[20]。關于c-di-GMP代謝調控細菌毒性的報道還有很多,然而c-di-GMP受體PilZ結構域蛋白調控細菌毒性的報道還很有限。

C-di-GMP在許多環(huán)境或者病原微生物生理過程中都扮演了重要的角色,人們對其研究最多的是它在生物被膜形成和散播過程中所起的作用。本研究對銅綠假單胞菌PA0012和PA4324突變體生物學表型的篩選以及RNA測序分析讓我們面對細菌致病過程中復雜的c-di-GMP受體蛋白信號通路有了一個新的視角,但同時也產(chǎn)生了一些疑惑,導致這些表型變化的機制是否為c-di-GMP在細胞內發(fā)揮作用還不得而知。本文篩選出了PA0012和PA4324能夠顯著影響銅綠假單胞菌的生物學表型,同時,推測了PA0012和PA4324在轉錄水平上可能參與調控細胞生理進程的通路,為更深入的理解和完善c-di-GMP信號傳導系統(tǒng)對細菌致病性的調控作用提供了理論基礎。