丁酸梭菌穩(wěn)定性對(duì)肉雞腸道菌群調(diào)控作用的影響

關(guān)鍵詞： 丁酸梭菌；貯存穩(wěn)定性；制粒穩(wěn)定性；肉雞；腸道菌群

中圖分類(lèi)號(hào)： S831.92 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 1004–390X （2024） 06?0075?07

近年來(lái)，飼用益生菌在安全性、功能性及加工性方面的篩選、評(píng)估與應(yīng)用，已成為畜禽養(yǎng)殖及飼料行業(yè)的熱點(diǎn)之一[1-2]。丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum） 為梭菌屬（Clostridium） 益生菌，因其優(yōu)良的安全性，成為人類(lèi)醫(yī)學(xué)中最早應(yīng)用的益生菌之一[3]，并于2008 年被列入《飼料添加劑品種目錄》[4]。隨著中國(guó)飼料行業(yè)“禁抗”政策的實(shí)施，丁酸梭菌在抑制畜禽腸道有害菌、調(diào)控腸道菌群等方面的益生功能逐漸被發(fā)掘[5-10]，這一機(jī)制是飼用丁酸梭菌制劑改善畜禽生產(chǎn)性能的重要途徑[11-16]。然而，現(xiàn)有的丁酸梭菌在肉雞養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究存在2 個(gè)主要問(wèn)題：第一，丁酸梭菌在肉雞飼料中的添加劑量范圍較寬，從104～107 CFU/g（全價(jià)配合飼料） 不等[6-9]；第二，盡管大量研究表明飼用丁酸梭菌能顯著降低肉雞腸道大腸桿菌的數(shù)量[8-11]，但也有研究顯示其未能顯著抑制大腸桿菌[6， 15-16]。這導(dǎo)致丁酸梭菌在改善肉雞生長(zhǎng)性能方面的研究結(jié)果并不一致。

國(guó)際益生菌與益生元科學(xué)聯(lián)合會(huì)于2014 年發(fā)布的《益生菌的科學(xué)共識(shí)》指出：只有當(dāng)腸道中益生菌的數(shù)量足夠且處于活性狀態(tài)時(shí)，才能發(fā)揮其正常的益生功能[17]。由于大多數(shù)畜禽飼料需要制粒加工和貯存，因此，評(píng)估包括丁酸梭菌在內(nèi)的益生菌飼料添加劑的穩(wěn)定性具有重要意義，這是研究其添加量及抑菌功能的基礎(chǔ)?；诖耍狙芯客ㄟ^(guò)動(dòng)物試驗(yàn)評(píng)估丁酸梭菌對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能和腸道菌群的影響，并對(duì)丁酸梭菌制劑的制粒及貯存穩(wěn)定性進(jìn)行分析，以期為完善其應(yīng)用技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

丁酸梭菌菌株從云南省西雙版納州西雙版納云嶺茶花雞產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司茶花雞養(yǎng)殖場(chǎng)的糞便中分離獲得，并經(jīng)16S rRNA 基因鑒定，編號(hào)為YNAU 5738。該菌株在云南師范大學(xué)制備成丁酸梭菌干粉制品（總菌數(shù) 7.05×109 CFU/g），并當(dāng)天用于試驗(yàn)組飼糧的配制。

1.2動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)

1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照體質(zhì)量一致的原則，將200 只健康的1 日齡愛(ài)拔益加（Arbor Acres，AA） 肉公雞分為2個(gè)處理組，每個(gè)組設(shè)10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧；參考周琳[9]的研究，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼糧中添加丁酸梭菌制品1.42kg/t （丁酸梭菌添加量為1.00×10⁷ CFU/g 全價(jià)配合飼料）。

1.2.2試驗(yàn)飼糧

基礎(chǔ)日糧參照《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T33—2004）制定，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。基礎(chǔ)飼糧中不添加抗生素、其他飼用益生菌及抑菌性功能添加劑。兩組飼糧在82 ℃ 條件下制粒，并由昆明滇福飼料有限公司生產(chǎn)。

1.2.3飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)附屬試驗(yàn)雞場(chǎng)進(jìn)行。所有試驗(yàn)雞采用籠養(yǎng)，試驗(yàn)期間自由采食和飲水，并保持24 h 光照。免疫程序按照雞場(chǎng)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，定期進(jìn)行清掃和消毒。試驗(yàn)周期為21 d。

1.3測(cè)定指標(biāo)

1.3.1 生長(zhǎng)性能測(cè)定

每個(gè)處理組以重復(fù)為單位，統(tǒng)計(jì)體質(zhì)量、平均日增量、平均日采食量和料重比；以組為單位，計(jì)算死亡率。

1.3.2 腸道菌群檢測(cè)

21 日齡稱(chēng)量質(zhì)量后，每個(gè)處理組從10 籠中各挑選1 只雞屠宰（N=10）。取肉雞盲腸食糜樣本，采用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)大腸桿菌、乳酸桿菌和丁酸梭菌的總菌數(shù)。大腸桿菌使用伊紅美藍(lán)瓊脂檢測(cè)，乳酸桿菌使用乳酸桿菌選擇性瓊脂檢測(cè)[18]；丁酸梭菌使用胰蛋白胨—亞硫酸鹽—環(huán)絲氨酸（tryptone-sulfite-cycloserine，TSC） 基礎(chǔ)瓊脂檢測(cè)，具體步驟參考《飼料添加劑 丁酸梭菌》（T/CSWSL006—2019）[19]。

1.3.3丁酸梭菌對(duì)大腸桿菌抑制作用的體外評(píng)估

為了客觀反映腸道食糜中不同數(shù)量級(jí)丁酸梭菌對(duì)大腸桿菌的抑制作用，采用牛津杯抑菌法體外比較丁酸梭菌對(duì)不同密度大腸桿菌的抑菌效果。具體方法為：丁酸梭菌培養(yǎng)液的總菌數(shù)為2.5×10⁶ CFU/mL，按照丁酸梭菌與大腸桿菌K88為1.0∶1.0 和0.1∶1.0進(jìn)行試驗(yàn)，分別將大腸桿菌K88 涂布至密度為2.5×10⁶ 和2.5×10⁷ CFU/mL的平板上，再進(jìn)行牛津杯抑菌試驗(yàn)。通過(guò)測(cè)量抑菌圈直徑（diameter of inhibition zone，DIZ），比較丁酸梭菌對(duì)不同密度大腸桿菌的抑菌作用。

牛津杯抑菌試驗(yàn)步驟及標(biāo)準(zhǔn)參考課題組前期報(bào)道[20]，簡(jiǎn)述如下：依據(jù)實(shí)測(cè)的丁酸梭菌培養(yǎng)液總菌數(shù)（2.5×10⁶ CFU/mL），將LB培養(yǎng)基培養(yǎng)24h的大腸桿菌K88 （菌株編號(hào)ATCC 25922） 密度稀釋至2.5×10⁶ 和2.5×10⁷ CFU/mL，隨后取每種密度的大腸桿菌培養(yǎng)液200μL 涂布于2個(gè)平板上。每個(gè)平板中放置2 個(gè)牛津杯，分別加入無(wú)菌蒸餾水（對(duì)照組） 和丁酸梭菌菌液（試驗(yàn)組） 200 μL，于37.5 ℃ 恒溫培養(yǎng)24 h。使用游標(biāo)卡尺測(cè)量DIZ，并根據(jù)DIZ 判定抑菌作用。判定標(biāo)準(zhǔn)為：DIZ=7.8 mm，為不敏感；7.8 mm12.0mm，為高敏感。

1.3.4 丁酸梭菌制品的制粒穩(wěn)定性及貯存穩(wěn)定性評(píng)估

在試驗(yàn)的第1天和第21天，現(xiàn)場(chǎng)采集試驗(yàn)組顆粒料樣品，檢測(cè)當(dāng)天的丁酸梭菌總菌數(shù)，以評(píng)估丁酸梭菌制品的制粒穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性。同時(shí)，在第1 天和第21天檢測(cè)丁酸梭菌干粉制品（留樣） 中的總菌數(shù)，以評(píng)估制品的貯存穩(wěn)定性。丁酸梭菌總菌數(shù)的檢測(cè)方法參照《飼料添加劑 丁酸梭菌》（T/CSWSL 006—2019）[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

除肉雞死亡率外，其他檢測(cè)指標(biāo)的數(shù)據(jù)均采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)分析使用SAS9.2 軟件，Plt;0.05 表示差異顯著，0.05lt;Plt;0.10表示存在差異的趨勢(shì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧添加丁酸梭菌對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知：與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組肉雞的平均日增量和平均采食量顯著增加（Plt;0.05），但料重比無(wú)顯著差異（Pgt;0.05）。對(duì)照組肉雞死亡率為3.00%，而試驗(yàn)組未發(fā)生死亡。

2.2 飼糧添加丁酸梭菌對(duì)肉雞腸道菌群的影響

由表3 可知：試驗(yàn)組肉雞盲腸食糜中的乳酸桿菌總菌數(shù)顯著高于對(duì)照組（Plt;0.05）；盡管試驗(yàn)組盲腸食糜中的大腸桿菌總菌數(shù)呈下降趨勢(shì)（P=0.068），但差異未達(dá)到顯著水平；此外，試驗(yàn)組肉雞盲腸食糜中丁酸梭菌的總菌數(shù)為2.82×10⁴ CFU/g（lg=4.45），而對(duì)照組盲腸食糜中丁酸梭菌的總菌數(shù)僅為5.01×10¹ CFU/g （lg=1.69）。

2.3 丁酸梭菌對(duì)大腸桿菌的抑菌作用

由表4 和圖1 可知：當(dāng)丁酸梭菌與大腸桿菌K88 按1.0∶1.0 進(jìn)行牛津杯體外抑菌試驗(yàn)時(shí)，抑菌圈直徑（DIZ） 為12.14 mm，抑菌作用為高敏感； 當(dāng)丁酸梭菌與大腸桿菌K88 的比例為0.1∶1.0 時(shí)，DIZ 值顯著降低至10.42 mm （Plt;0.05），抑菌作用為中敏感；無(wú)菌蒸餾水對(duì)大腸桿菌K88的抑制作用為不敏感（DIZ=7.80 mm）。

2.4 丁酸梭菌制品的制粒及貯存穩(wěn)定性

由圖2a 可知：與飼糧中添加的丁酸梭菌量（第0 天1.00×10⁷ CFU/g 全價(jià)配合飼料） 相比，試驗(yàn)組第1 天制粒顆粒料中的丁酸梭菌總菌數(shù)降至5.57×10⁶ CFU/g， 顯著降低了44.13% （Plt;0.05）；顆粒料經(jīng)21d 貯存后， 丁酸梭菌總菌數(shù)降至4.38×106 CFU/g，進(jìn)一步降低了21.36% （Plt;0.05）。由圖2b可知：丁酸梭菌制品在第1 天的總菌數(shù)為7.05×10⁹ CFU/g；經(jīng)過(guò)21d 貯存后，第21天的總菌數(shù)為5.29×10⁹ CFU/g，顯著下降了24.96%（Plt;0.05）。

3 討論

3.1 飼糧添加丁酸梭菌對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

研究表明：肉雞飼糧中丁酸梭菌的添加量為104～106 CFU/g （全價(jià)配合飼料）。本研究參考周琳[9]和王成森[21]的報(bào)道，在試驗(yàn)組飼糧中添加了1.00×10⁷ CFU/g 丁酸梭菌制品，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，飼喂丁酸梭菌制品的試驗(yàn)組肉雞平均日增量和平均日采食量分別顯著增加了5.74% 和7.14%，這與前人的研究結(jié)果[7-8]相符；且試驗(yàn)組肉雞未發(fā)生死亡，表明飼喂丁酸梭菌有效降低了肉雞的死亡風(fēng)險(xiǎn)。這說(shuō)明丁酸梭菌對(duì)肉雞的體質(zhì)量、采食量、死亡率等生長(zhǎng)性能指標(biāo)有顯著的改善作用。此外，1～21 日齡試驗(yàn)組肉雞的料重比與對(duì)照組無(wú)顯著差異，這與前人的研究結(jié)果[10， 13-14]一致。然而，也有研究表明：飼用丁酸梭菌可顯著降低肉雞的料重比。徐晨希[12]的研究顯示：飼用丁酸梭菌顯著降低了1～21 日齡AA 肉雞的料重比；鞠孜敬[22]的研究結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，飼用丁酸梭菌（菌株編號(hào)：AQQF01000149）可改善1～30 日齡AA 肉雞的料重比；肖克權(quán)等[23]的研究也表明：飼用丁酸梭菌可顯著降低1～20日齡麻雞的料重比。

3.2 飼糧添加丁酸梭菌對(duì)肉雞腸道菌群的影響

乳酸桿菌是腸道主要有益菌群中的優(yōu)勢(shì)菌種，其在食糜中的總菌數(shù)增加被認(rèn)為是肉雞腸道健康和生長(zhǎng)性能改善的關(guān)鍵標(biāo)志；相反，食糜中大腸桿菌的總菌數(shù)增加會(huì)對(duì)肉雞的腸道健康和生長(zhǎng)性能產(chǎn)生負(fù)面影響[24-25]。與對(duì)照組相比，飼喂丁酸梭菌制品的試驗(yàn)組肉雞盲腸食糜中乳酸桿菌的總菌數(shù)顯著增加，這與前人的研究結(jié)果[6， 8， 10-11， 16]一致。這一作用可能與丁酸梭菌分泌消化酶和增加腸道低聚糖類(lèi)功能物質(zhì)有關(guān)，從而進(jìn)一步促進(jìn)腸道乳酸菌等有益菌的增殖[2， 4-5]。

大量研究表明：飼用丁酸梭菌可顯著降低肉雞腸道有害菌大腸桿菌的數(shù)量，是維持腸道形態(tài)及降低料重比的重要機(jī)制之一[8， 11]。然而，本研究結(jié)果顯示：試驗(yàn)組肉雞盲腸食糜中的大腸桿菌總菌數(shù)僅下降了12.90%，盡管存在一定的降低趨勢(shì)，但未達(dá)到顯著水平。戴晉軍等[15]研究發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，飼糧中添加2×10⁶ CFU/g 丁酸梭菌未能顯著降低21 日齡Cobb肉雞盲腸食糜中的大腸桿菌數(shù)量，且對(duì)料重比也沒(méi)有改善作用。劉婷婷[6]在三黃雞的飼糧中添加1×10⁴ CFU/g 丁酸梭菌，未顯著降低21日齡小雞盲腸食糜中的大腸桿菌數(shù)量，且1～21日齡的料重比差異并不顯著。YANG 等[16]在嶺南黃雞的飼糧中添加1×10⁴ CFU/g丁酸梭菌，結(jié)果同樣未顯著降低21 日齡雞盲腸食糜中的大腸桿菌數(shù)量，也未提高1～21日齡小雞的平均日增量。推測(cè)丁酸梭菌作用效果不盡一致的原因包括以下2個(gè)方面。第一，丁酸梭菌的穩(wěn)定性差異。一般而言，芽孢桿菌屬的飼用益生菌具有較好的制粒和貯存穩(wěn)定性。制粒后，益生菌能在腸道中保持足夠的數(shù)量，從而發(fā)揮抑制腸道有害菌、分泌促生長(zhǎng)物質(zhì)等作用，進(jìn)而穩(wěn)定地改善畜禽生產(chǎn)性能。相反，非芽孢桿菌屬的益生菌（如酵母菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌等） 在制粒和貯藏過(guò)程中穩(wěn)定性較差，若未進(jìn)行穩(wěn)定性處理，可能會(huì)影響其在飼料中的直接應(yīng)用[26-27]。目前，關(guān)于丁酸梭菌制劑的制粒和貯藏穩(wěn)定性報(bào)道較少。第二，丁酸梭菌菌株的抑菌性能差異。肖海蒂[28]評(píng)估了3 株丁酸梭菌（菌株編號(hào)分別為D-2、D-8、D-19） 對(duì)大腸桿菌的抑制作用，其中2 株表現(xiàn)為高敏感，1 株為中敏感。

3.3 丁酸梭菌對(duì)大腸桿菌的抑制作用及效果評(píng)估

在本研究中，鑒于試驗(yàn)組肉雞盲腸食糜中丁酸梭菌的總菌數(shù)為2.82×10⁴ CFU/g、大腸桿菌總菌數(shù)為5.62×10⁵ CFU/g，丁酸梭菌的總菌數(shù)較大腸桿菌的總菌數(shù)低1 個(gè)數(shù)量級(jí)，因此，在體外牛津杯抑菌試驗(yàn)中，將丁酸梭菌與大腸桿菌K88 的比例調(diào)整為1.0∶1.0 和0.1∶1.0，通過(guò)抑菌圈直徑（DIZ） 來(lái)評(píng)估腸道中丁酸梭菌的有效數(shù)量對(duì)大腸桿菌抑菌效果的差異。結(jié)果顯示：當(dāng)丁酸梭菌與大腸桿菌K88 按1.0∶1.0 進(jìn)行牛津杯體外抑菌試驗(yàn)時(shí)，DIZ 為12.14 mm，表現(xiàn)為高敏感；而當(dāng)丁酸梭菌與大腸桿菌K88 按0.1∶1.0 進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，DIZ 顯著減小至10.42 mm，抑菌效果降為中敏感。謝麗靜等[29]采用牛津杯法，在牛津杯中加入培養(yǎng)48 h 的丁酸梭菌上清液240 μL，結(jié)果顯示其對(duì)大腸桿菌（10⁶ CFU/mL） 的DIZ 為13.82 mm。費(fèi)中杰[30]的研究表明：丁酸梭菌菌液200 μL 可對(duì)大腸桿菌（10⁶ CFU/mL） 表現(xiàn)出顯著的抑制作用。劉歡歡等[31]在抑菌試驗(yàn)中加入丁酸梭菌菌液100 μL，結(jié)果顯示其對(duì)大腸桿菌的DIZ 為8 mm，未表現(xiàn)出抑制作用。盡管目前尚無(wú)丁酸梭菌與指示菌密度比例的相關(guān)報(bào)道，但以上結(jié)果表明：丁酸梭菌對(duì)大腸桿菌的抑制效果不僅與菌株特性相關(guān)，也受到丁酸梭菌密度（數(shù)量級(jí)） 的影響。這一結(jié)論為進(jìn)一步分析丁酸梭菌制品的制粒及貯存穩(wěn)定性提供了科學(xué)依據(jù)。

3.4 丁酸梭菌制品的制粒及貯存穩(wěn)定性評(píng)估

本研究中，試驗(yàn)組飼糧中丁酸梭菌制品的添加量為1.00×10⁷ CFU/g，即使考慮肉雞食糜高水分（約60%～85%） 的情況[32]，盲腸食糜丁酸梭菌總菌數(shù)應(yīng)為10⁵～10⁶ CFU/g，顯然本研究試驗(yàn)組肉雞腸道丁酸梭菌檢測(cè)值（2.82×10⁴ CFU/g） 偏低。課題組前期報(bào)道了在仔豬飼糧中添加穩(wěn)定性較好的飼用凝結(jié)芽孢桿菌1.00×10⁷ CFU/g，其盲腸食糜中可檢測(cè)到較高數(shù)量級(jí)的凝結(jié)芽孢桿菌（0.93×10⁶ CFU/g）[18]。鑒于此，本研究進(jìn)一步評(píng)估了丁酸梭菌制品的制粒穩(wěn)定性及貯存穩(wěn)定性，結(jié)果顯示：與制粒前相比，試驗(yàn)組飼糧制粒后的丁酸梭菌總菌數(shù)降低了44.13%；顆粒料貯存21 d 后，丁酸梭菌總菌數(shù)進(jìn)一步降低了21.36%。說(shuō)明試驗(yàn)所用的丁酸梭菌制品在制粒及貯存過(guò)程中損失較大，穩(wěn)定性較差。韋曉芳等[33]研究顯示：試驗(yàn)組雞飼糧中添加丁酸梭菌5.00×10⁵ CFU/g，制粒后實(shí)測(cè)顆粒料中的丁酸梭菌總菌數(shù)為2.88×10⁵ CFU/g，減少了42.40%。王騰浩[34]報(bào)道：將丁酸梭菌（菌株編號(hào)：ZJU-F1） 在80～85 ℃ 水浴處理后，總菌數(shù)降低72.59%～80.00%。關(guān)青龍[35]的研究顯示：丁酸梭菌在90 ℃ 水浴處理15 min 后，總菌數(shù)損失為68.3%。賈麗楠等[36]報(bào)道：將丁酸梭菌制品在85 ℃ 水浴處理7.5 min 后，丁酸梭菌總菌數(shù)降低了53.65%。此外，本研究發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌制品貯存21d后，總菌數(shù)降低了24.96%。以上分析表明：作為嚴(yán)格厭氧的丁酸梭菌，其制品易受到氧氣、溫度等因素的影響，導(dǎo)致制粒穩(wěn)定性及貯存穩(wěn)定性較差。結(jié)合抑菌效果的差異，充分說(shuō)明本研究的丁酸梭菌制劑存在較大的制粒和貯藏?fù)p失，并且在腸道中的數(shù)量級(jí)偏低，這在一定程度上影響了丁酸梭菌制劑對(duì)大腸桿菌的抑制效果。這一結(jié)論也揭示了當(dāng)前丁酸梭菌在肉雞飼料中添加劑量過(guò)于寬泛的潛在原因。

4 結(jié)論

本研究所用丁酸梭菌對(duì)肉雞的生長(zhǎng)性能和腸道菌群具有一定的改善作用。然而，制粒和貯存的穩(wěn)定性問(wèn)題導(dǎo)致丁酸梭菌在肉雞腸道中的數(shù)量較低，進(jìn)而影響了其對(duì)腸道大腸桿菌的抑制效果。因此，改善丁酸梭菌菌株的耐熱性及其制品的貯存性，是篩選和應(yīng)用優(yōu)質(zhì)丁酸梭菌飼料添加劑的重要方向之一。

責(zé)任編輯：何承剛