云南松原生質體制備及優(yōu)化

關鍵詞： 云南松；原生質體制備；酶解法；優(yōu)化體系

中圖分類號： S791.257.01 文獻標志碼： A 文章編號： 1004–390X （2024） 06?0133?09

植物原生質體是指通過質壁分離去除細胞壁后剩下的、由單層細胞膜包裹著的、有活力的原生質團[1]，它較易從木質化程度較低的植物組織材料中獲得。葉片因易獲得和易分解，是制備原生質體常用的理想材料[2]。原生質體無細胞壁的支撐和保護作用，外源大分子物質DNA、質粒、病毒、細胞器等容易攝入，是遺傳操作和基因轉移的良好材料，也是基因功能驗證、亞細胞定位、蛋白互作等研究的理想受體[3-5]。保持活性的原生質體含有細胞的完整遺傳信息，不僅可以進行體細胞雜交、細胞融合和突變體篩選培育，還能夠克服遠緣雜交不親和的問題[6]。此外，由于具有細胞全能性，原生質體還是進行細胞壁再生、細胞分裂與分化、膜透性及離子轉運等研究的基礎材料[7]。

在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryzasativa）、煙草（Nicotiana tabacum） 等模式植物中，原生質體分離純化體系較為成熟且應用廣泛，而木本植物原生質體的制備和應用相較于草本植物、農作物、微生物等起步較晚[8]。草本植物因其生長周期短，在原生質體制備、培養(yǎng)等方面較為完善，特別是擬南芥、煙草等模式植物的原生質體，已廣泛應用于基因功能研究[9]。木本植物原生質體研究以棗（Ziziphus jujuba）[10]、梨（Scurrulaphilippensis）[11]、桑樹（Morus alba）[12]、茶樹（Camellia sinensis）[13]等植物居多，而鮮有針葉森林樹種的相關研究[14]。松科（Pinaceae） 是裸子植物中最大的一類，且為主要的森林樹種，具有重要的生態(tài)和經濟價值[15]。近年來，隨著分子生物學和生物化學的發(fā)展，松科松屬（Pinus） 植物的種質創(chuàng)新、遺傳改良、次生代謝途徑調控等研究得到快速發(fā)展[16]。雖然基因功能鑒定、亞細胞定位、蛋白互作等可以在模式植物（如煙草和擬南芥） 的原生質體中異源表達和定位，但可能與本體表達存在差異[17-18]。此外，因植物物種間的基因型、幼嫩程度、細胞壁組成成分等不同，目前尚未建立通用的原生質體分離純化體系[19]。因此，建立松屬植物的原生質體分離純化體系，對于其種質創(chuàng)新、遺傳轉化、基因功能驗證及挖掘具有重要意義。

云南松（P. yunnanensis） 為松科松屬常綠喬木，是西南地區(qū)荒山造林的先鋒樹種和重要經濟林木[20]。近年來，云南松遺傳資源大量流失或消失，對現(xiàn)有遺傳資源進行保存或改良尤為重要。云南松生長發(fā)育的相關基因功能鑒定及預測已成為研究熱點[21-23]，建立高效的云南松原生質體分離純化體系是進行種質資源改良、亞細胞定位、蛋白互作等研究的前提[24]，但目前未見云南松原生質體制備相關的研究報道，極大限制了云南松種質創(chuàng)新、基因工程等方面的研究?；诖?，本研究使用酶解法，以云南松幼苗為試驗材料，探究纖維素酶質量分數、離析酶質量分數、甘露醇濃度、真空處理時間、酶解條件和離心條件對原生質體制備的影響，以期為松科植物的體細胞雜交和基因功能研究提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植物

云南松種子于2020年11月采自云南省宜良縣花園林場（24o92′N，103o14′E，海拔1 600 m），采后于4 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆?。種子經始溫50 ℃ 熱水熱激浸泡48 h 后，播種于組培瓶中萌發(fā)生長30 d。萌發(fā)條件為：溫度（23±2） ℃，光照時間16 h/d，光照強度2100～2500 lx。試驗地點為西南林業(yè)大學西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)和草原局重點實驗室。

1.1.2 主要試劑

纖維素酶（cellulase R-10，CE） 和離析酶（macerozymeR-10，MA） 購自上海源葉生物科技有限公司（上海）；甘露醇、蔗糖、2-（N-嗎啉） 乙磺酸一水化合物[2-（N-morpholino）ethanesulfonic acidmonohydrate，MES]、牛血清蛋白（bovine" serumalbumin，BSA）、固體臺盼藍、氯化鉀、氯化鈉、二水合氯化鈣、磷酸二氫鉀、碘化鉀、硝酸鉀、七水合硫酸鎂、五水合硫酸銅、磷酸緩沖液（phosphate buffer saline，PBS） 等常規(guī)試劑均購自索萊寶科技有限公司（北京）。

1.1.3 供試溶液配制

W5 溶液：含4.500g/L 氯化鈉、9.190g/L二水合氯化鈣、0.186 g/L 氯化鉀、0.213 g/L MES，溶劑為純水，pH 為5.8。

2×CPW緩沖液：含0.0272g/L 磷酸二氫鉀、0.0160g/L 碘化鉀、0.1010g/L 硝酸鉀、0.2450g/L七水合硫酸鎂、0.0250mg/L 五水合硫酸銅，溶劑為純水，pH 為5.8。

酶解液（現(xiàn)用現(xiàn)配）：在質量分數為1.0% 的纖維素酶、質量分數為0.6% 的離析酶、0.3 mol/L甘露醇、500 μL 2×CPW 緩沖液、21.325 g/L MES、74.550μg/L 氯化鉀中加入8 mL 純水，并于55 ℃恒溫水中水浴溶解， 溶液冷卻至室溫后加入0.0147mg/L 二水合氯化鈣、3.0000g/L 牛血清蛋白，調節(jié)pH 至 5.8，加純水定容至10mL。

0.1% 臺盼藍（現(xiàn)用現(xiàn)配）： 稱取1.0g臺盼藍，以PBS為溶劑溶解，pH 為7.4，定容至1 L。

1.2 試驗方法

1.2.1 原生質體的分離

待云南松種子萌發(fā)生長至約30 d，挑選長勢良好且一致的實生幼苗，分別稱取針葉、莖和根各（0.100±0.002） g，用預先滅菌的手術刀快速切成1～2 mm 的小段后放入裝有酶解液10 mL 的離心管中，用錫紙包裹離心管，真空處理后置于不同條件的搖床上進行酶解。酶解結束后，用70 μm的細胞濾網分別過濾根、莖、葉的組織細胞酶解液混合物，得到組織細胞懸液并裝入15 mL 離心管備用。

1.2.2 不同因素對原生質體分離的影響

預試驗發(fā)現(xiàn)：云南松幼嫩針葉在1.00% 纖維素酶、0.60% 離析酶和0.3 mol/L 甘露醇的酶解液中真空處理10min 后，以4h、28 ℃、180 r/min的條件進行酶解，再以180 r/min 離心5 min，可以觀察到有活力的原生質體。因此，根據預試驗結果設計以下試驗。

（1） 酶解液中酶的質量分數

① 酶解液中的纖維素酶質量分數設置為0.75%、1.00%、1.25% 和1.50%，其他條件同預試驗，制備原生質體；② 離析酶質量分數設置為0.60%、0.80%、1.00% 和1.20%，纖維素酶質量分數為①中得到的最適質量分數，其他條件同預試驗，制備原生質體。

（2） 甘露醇濃度

設置甘露醇濃度為0.2、0.3、0.4、0.5 和0.6 mol/L，纖維素酶和離析酶質量分數為（1） 中得到的最佳質量分數，其他條件同預試驗，制備原生質體。

（3） 真空處理時間和酶解條件

預試驗發(fā)現(xiàn)：未進行真空處理的原生質體產量約為真空處理的1/3，且酶解時間相差約5 倍。在（1）、（2） 中得到的最適酶解液成分（纖維素酶、離析酶和甘露醇） 及預試驗離心條件的基礎上探討真空處理和酶解條件對原生質體分離的影響。真空處理時間設置為5、10、15、20和25 min，在5 個真空處理時間條件下進行酶解條件（酶解溫度、酶解轉速、酶解時間） 的L₁₆（3⁴） 試驗，其中酶解溫度設置為24、26、28 和30 ℃，酶解轉速設置為80、130、180 和230 r/min，酶解時間設置為3.0、3.5、4.0 和4.5 h。

篩選出制備針葉原生質體的最佳條件后，以優(yōu)化體系對云南松幼嫩根、莖進行原生質體分離與純化，并對制備效果進行比較和評價。

1.2.3 原生質體的純化

將1.2.1 節(jié)得到的組織細胞懸液進行第1 次離心，棄去上清液；加入等體積W5 溶液進行第2 次離心，棄去上清液；加入等體積0.3 mol/L 甘露醇溶液進行第3次離心，棄去多余上清液，留下上清液約1.0 mL 重懸沉淀，即可得到較為純凈的原生質體懸液。3次離心條件均為：先將離心時間設置為5 min （預試驗結果），探索600、800和1000 r/min 中的最佳轉速；得到最佳轉速后，在最佳轉速下探索3、5、7 和9 min 中的最佳離心時間。

1.2.4 原生質體的產量計算及活力檢測

采用血球計數板計算原生質體產量，利用臺盼藍檢測法測定細胞活力。取純化后的原生質體懸液0.9 mL 于試管中，再加入0.1% 臺盼藍染液0.1 mL 混勻，室溫避光反應3 min，輕柔搖晃后吸取20 μL 滴于血細胞計數板（25×16型） 上，蓋上蓋玻片后在Axio Vision系統(tǒng)下觀察、拍照，并按照公式計算原生質體的產量和活力：原生質體產量=（5 個中方格內原生質體總數/80×400×10⁴×稀釋倍數）/組織總質量；原生質體活力=（原生質體總數?顯藍色的原生質體數）/原生質體總數×100%。5個中方格指4 個角和1 個中央的中方格，1 個中方格有16 個小格，計數遵循計上不計下、計左不計右的原則。每組處理重復3 次，每個重復計數3 次。

1.3 數據處理與統(tǒng)計分析

采用Excel 2007整理數據；采用SPSS 19.0進行單因素方差分析；采用Origin 21.0制圖。數據結果采用“平均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 云南松不同組織原生質體的制備效果

云南松的不同組織在相同條件下進行酶解，其針葉組織細胞懸液綠色較深，莖段組織細胞懸液綠色較淺，根組織細胞懸液呈淡黃色；依次對針葉、莖段、根的染色結果進行觀察發(fā)現(xiàn)：視野中呈綠色的原生質體逐漸減少，橢圓形細胞也逐漸減少，組織碎片逐漸增多（圖1）。因此，在同一制備程序下，云南松實生幼苗針葉的原生質體制備效果優(yōu)于莖和根，在后續(xù)研究中對針葉原生質體制備條件進行優(yōu)化。

2.2 酶質量分數對針葉原生質體產量和活力的影響

由圖2a 可知：在0.60% 離析酶處理下，隨著纖維素酶質量分數的升高，原生質體的產量和活力先升高后降低，當纖維素酶質量分數為1.00%時，產量達到最大值，為7.09×10⁷個/g，活力為61.37%；當纖維素酶質量分數為1.25% 時，活力達到最大值，為65.01%，產量為6.11×10⁷個/g。因此，1.00% 纖維素酶為制備原生質體的最適質量分數。由圖2b 可知：在1.00% 纖維素酶處理下，隨著離析酶質量分數的升高，原生質體產量呈先升高后降低的趨勢，活力呈鋸齒形變化，當離析酶質量分數為0.80% 時，產量和活力都達到最大值，分別為5.71×10⁷個/g 和75.27%。綜上所述，1.00% 纖維素酶和0.80% 離析酶的組合為云南松針葉原生質體制備的較適酶解體系。

2.3 甘露醇濃度對針葉原生質體產量和活力的影響

由圖3 可知：甘露醇濃度過高或過低都會顯著影響原生質體的活力。當甘露醇濃度為0.2 和0.6 mol/L 時，原生質體活力較低，約為50%，且這2 個處理間差異不顯著；隨著甘露醇濃度的增加，原生質體產量呈先升高后降低的趨勢，為4×10⁷～6×10⁷ 個/g；當甘露醇濃度為0.3 mol/L 時，原生質體產量最高，為5.88×10⁷ 個/g。

2.4 真空處理時間及酶解條件對針葉原生質體產量的影響

由圖4 可知：隨著真空處理時間的延長，原生質體產量呈下降趨勢，5～15 min 是制備原生質體較適宜的真空處理時間，而真空處理25 min 不利于原生質體的制備；當真空處理時間一定時，3.5 和4.0 h 是較適宜的酶解時間；當真空處理時間為10min，酶解時間為3.5h 時，原生質體產量隨著酶解溫度和轉速的升高而升高；當真空處理時間為10min，酶解時間為4.0h 時，原生質體產量隨著酶解溫度和轉速呈先升高后降低的趨勢，在酶解溫度26 ℃、轉速130 r/min 時達到最大值，為7.07×10⁷個/g。綜上所述，酶解前真空處理10 min，以26 ℃、130 r/min酶解4 h，原生質體的產量可達最大值。

2.5 離心時間及速度對針葉原生質體純化的影響

由圖5a 可知：隨著離心時間的增加，原生質體產量呈先升高后降低的趨勢，離心5 min時，其產量（5.88×10⁷ 個/g） 和活力顯著高于其他處理。由圖5b 可知：隨著離心速度的增加，原生質體產量呈先升高后降低的趨勢；當離心速度為800 r/min 時，其產量（5.75×10⁷ 個/g） 和活力（72.98%） 顯著高于其他處理；當離心速度升至1000 r/min 時，原生質體活力較800 r/min 時降低了約10%。綜上所述，純化過程中800 r/min、離心5 min 是原生質體純化的最佳條件。

2.6 優(yōu)化體系對根、莖原生質體制備效果評價

由圖6a 可知：對云南松幼嫩根、莖進行原生質體分離與純化，其產量分別為4.35×10⁷ 和5.27×10⁷ 個/g，均顯著低于葉的產量（5.98×10⁷ 個/g），且根的產量顯著低于莖的產量。由圖6b 可知：根、莖的原生質體活力分別為67.69% 和69.83%，均低于針葉原生質體活力（72.22%），且根原生質體活力顯著低于葉。可見，本研究建立的原生質體制備及優(yōu)化技術體系為云南松不同組織的原生質體分離純化提供了可行方案。

3 討論

3.1 酶解液成分對植物原生質體制備的影響

采用酶解法高效分離、純化大量有活力的植物原生質體，受到多種因素的影響，其中，酶解液的酶種類及濃度、滲透壓調節(jié)劑等是影響植物原生質體產量和活力的關鍵因素[25]。通常根據不同植物材料使用不同濃度配比的纖維素酶、離析酶、果膠酶和半纖維素酶中的2～3 種進行酶解[26]。在酶解過程中，若酶濃度過低，可能酶解不完全，原生質體聚集成團；若濃度過高，原生質體破裂，活性不高[27]。以1.5% 纖維素酶+0.3% 離析酶+0.5% 果膠酶的酶解液組合分離茶樹（Camelliasinensis） 葉片原生質體的效果最好[28]；以1.50%纖維素酶+0.75% 果膠酶是酶解柳枝稷（Panicumvirgatum） 的最適組合[29]；使用不同質量分數的纖維素酶、離析酶和半纖維素酶組合處理梭梭（Haloxylon ammodendron） 同化枝，結果發(fā)現(xiàn)：0.4%離析酶R-10+1.0% 纖維素酶R-10 是分離其原生質體的最優(yōu)酶解組合[30]； 對馬鈴薯（Solanumtuberosum） 葉片原生質體的研究表明：纖維素酶和離析酶的酶解作用大于果膠酶[31]。本研究采用的云南松幼苗較為幼嫩，細胞壁去除相對容易，綜合考慮成本等因素，選擇纖維素酶和離析酶進行酶解，結果表明：與其他組織相比，針葉分離得到的原生質體產量和活力都較高。適宜的酶解液滲透壓能維持原生質體活性和質膜穩(wěn)定性，使酶和底物的結合更充分[32]。常用甘露醇、蔗糖、葡萄糖、山梨醇等作為分離原生質體的滲透壓穩(wěn)定劑[33]。在萱草（Hemerocallis fulva） 原生質體的分離中，與甘露醇相比，蔗糖和葡萄糖作為滲透壓調節(jié)劑時制得的原生質體產量較低[34]。在本研究中，當甘露醇濃度為0.3 mol/L 時，分離的原生質體產量高達5.88×107 個/g，活力達62.86%，與擬南芥[35]、楊樹[36]和茶樹[13]原生質體分離時的最適甘露醇濃度相差不大。此外，酶解液中的其他因素也會影響原生質體制備的效率，如酶解液的pH、pH 穩(wěn)定劑、牛血清蛋白等，這些因素在優(yōu)化研究中值得進一步探索。

3.2 酶解條件對植物原生質體制備的影響

酶解前是否對材料進行預處理以及酶解條件對原生質體的分離效果有重要影響。對于葉面積較大且葉表皮易去除的組織材料，通常通過撕去葉片表皮，使葉肉細胞與酶解液充分接觸，從而縮短酶解時間，提高原生質體的獲得率[37]。在酶解前進行抽真空處理，也可提升酶解效率。在分離菊花（Chrysanthemum morifolium） 花瓣和葉片的原生質體過程中，酶解前抽真空5 min，原生質體的產量相較于其他處理提高了579 倍和14 倍；與抽真空20 min 處理相比，抽真空30 min 處理獲得的原生質體數量減少約40%[25]。在本研究的前期試驗中，酶解前未進行抽真空的處理，能觀察到原生質體的酶解時間至少為20 h；而進行真空處理后，酶解時間為原來的1/5，原生質體產量相差3 倍。酶解時間隨物種不同有較大差異，在木本植物中，酶解時間為3～24 h 不等，隨著原生質體制備方法的優(yōu)化，酶解時間逐漸縮短[38]。

在本研究中，真空處理、酶解溫度及搖床轉速一定時，原生質體產量隨酶解時間的延長呈先升高后降低的趨勢。酶解時振蕩與否或搖床轉速也會對原生質體的制備效率產生重要影響。在制備杜鵑（Rhododendron simsii） 原生質體時， 使用靜置、振蕩、靜置與振蕩相結合的方式進行酶解，酶解時間長達14 h，產量也較低[39]。與原生質體制備相關的纖維素酶、離析酶、果膠酶等，較適宜的反應溫度為40～50 ℃，但一般植物材料最高耐受溫度為35 ℃，所以酶解溫度一般選擇在35 ℃以下。本研究發(fā)現(xiàn)：酶解溫度為24～30 ℃ 時，對原生質體產量的影響不大，這可能是酶解溫度變化梯度不大或溫度變化在云南松耐受溫度范圍內，在后續(xù)研究中需進一步優(yōu)化。

3.3 分離材料對植物原生質體制備的影響

分離材料是影響植物原生質體分離效率的重要因素，有研究認為：選擇合適的材料可以顯著影響原生質體的制備效果[40]。材料的木質化程度、生理狀態(tài)等均會影響原生質體分離的效果。使用相同制備條件分離和純化同一材料、不同組織的原生質體，結果顯示：蘭花原生質體產量的順序為葉基gt;根gt;嫩葉gt;花蒂[4]；茶樹原生質體的產量和活力為嫩葉gt;根gt;枝條[28]。使用相同制備條件分離和純化不同材料、同一組織的原生質體，結果顯示：紫風車菊花花瓣的原生質體產量和活力均大于帝王水晶菊花花瓣[25]。本研究發(fā)現(xiàn)：幼嫩針葉制備的原生質體，其產量和活力均優(yōu)于根和莖，這與對杉木（Cunninghamia lanceolata） 的研究結果一致[41]。在后續(xù)研究中，可以利用建立的原生質體制備體系分離不同生長環(huán)境及不同幼嫩程度的云南松組織。

4 結論

本研究以云南松幼苗為試驗材料，通過探索原生質體制備的關鍵影響因素，建立了云南松原生質體制備及優(yōu)化的技術體系。云南松幼嫩針葉原生質體的制備方法為：先置于1.00% 纖維素酶+0.80% 離析酶+0.3mol/L 甘露醇的酶解液中抽真空10min，然后以4 h、26 ℃、130 r/min 的條件進行酶解，再用180r/min 離心5min，原生質體產量達5.98×10⁷個/g，活力為72.22%。利用該技術體系可以為后續(xù)云南松原生質體培養(yǎng)、融合及瞬時表達體系等研究提供重要技術支撐。

責任編輯：何謦成