芹菜素通過AMPK/mTOR通路調(diào)控肺癌A549細(xì)胞自噬*

雷軒 羅丹 盧梁杰 高露洋 王文軍

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,四川 瀘州 646000)

我國(guó)肺癌的發(fā)病率及死亡率均為惡性腫瘤之首,是癌癥相關(guān)死亡的重要原因[1-2]。目前肺癌主要以綜合治療為主,但由于多數(shù)患者確診時(shí)已為中晚期,喪失手術(shù)機(jī)會(huì),加之化療藥物毒副作用大,耐藥性嚴(yán)重,肺癌的預(yù)后仍不盡如人意[3-4],因此迫切需要開發(fā)低毒、有效的新型抗腫瘤藥物。近年來,在眾多新型高效低毒的抗癌藥物中,中醫(yī)藥受到越來越多的關(guān)注。芹菜素(Apigenin ,APG)是一種常見的天然植物黃酮類化合物,具有多種潛在藥理活性,如抗炎、抑制氧化應(yīng)激、抗腫瘤、誘導(dǎo)凋亡和自噬等[5-7]。已有研究證實(shí)芹菜素對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、侵襲、遷移有顯著抑制作用,并可促進(jìn)凋亡[8-9],但芹菜素在肺癌A549細(xì)胞自噬過程中的作用及相關(guān)機(jī)制報(bào)道鮮少,因此本項(xiàng)工作擬探討肺癌A549細(xì)胞自噬過程中芹菜素所產(chǎn)生的影響,并對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行分析,以期為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑 肺癌A549細(xì)胞來源于西南醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室。芹菜素(規(guī)格：每支10 mg,純度：>99%,貨號(hào)：HY-N1201),腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)抑制劑Compound C(規(guī)格：每支5 mg,純度：>99%,貨號(hào)：HY-13418A)均購(gòu)自美國(guó)MCE公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司;細(xì)胞自噬染色檢測(cè)試劑盒(MDC法)購(gòu)自Beyotime;β-Actin抗體購(gòu)自天德悅公司,P62抗體購(gòu)自Abcam;微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)抗體、p-AMPKα抗體、AMPKα抗體、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抗體、p-mTOR抗體均購(gòu)自CST公司;胰酶-EDTA、PBS購(gòu)自吉諾醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司;RIPA總蛋白裂解液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、磷酸化蛋白酶抑制劑、BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒、麗春紅染液、ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、一抗稀釋液、二抗稀釋液、抗體洗脫液、顯影定影液、脫脂奶粉等均購(gòu)自ASPEN公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 在含10%FBS+1%P/S的F12K培養(yǎng)液中放置人肺癌A549細(xì)胞,置于5%CO2加濕培養(yǎng)箱中37 ℃下培養(yǎng);等待細(xì)胞融合至80%時(shí),吸出培養(yǎng)液,用PBS清洗細(xì)胞,去除上清,胰酶消化后加入培養(yǎng)液進(jìn)行傳代培養(yǎng),收集培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將A549細(xì)胞分為空白對(duì)照組(0 μmol/L APG),低、中、高濃度組(20,40,80 μmol/L APG)和抑制劑組(80 μmol/L APG+10 μmol/L AMPK抑制劑Compound C)5組。

1.3 CCK-8法檢測(cè)芹菜素對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用胰蛋白酶消化后配制成濃度為1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,按10 000個(gè)/孔接種于96孔板,每孔加入100 μL,放入5%CO2培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)24 h。24 h后分別加入終濃度為0、20、40、80、160 μmol/L的芹菜素培養(yǎng)24、48、72 h,各組均設(shè)立6個(gè)復(fù)孔,加入CCK-8溶液繼續(xù)孵育2 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450 nm吸光度值(A值),以溶劑處理的細(xì)胞為對(duì)照組,按公式計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率。抑制率%=(A值對(duì)照組-A值實(shí)驗(yàn)組)/(A值對(duì)照組-A值空白組)×100%。計(jì)算24、48、72 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)值。

1.4 MDC染色法檢測(cè)芹菜素對(duì)A549細(xì)胞自噬的影響 各組干預(yù)48 h后,根據(jù)細(xì)胞自噬染色法(MDC法)試劑盒使用說明進(jìn)行染色,染色后使用熒光顯微鏡(×3000倍)對(duì)比觀察,各組隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行拍照并計(jì)數(shù),檢測(cè)到高亮點(diǎn)狀熒光表示自噬小泡,參照文獻(xiàn)[10]計(jì)算積分光密度值(IOD)。以上步驟重復(fù)3次。

1.5 Western blot檢測(cè)自噬及AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 各組培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞,用PBS多次清洗細(xì)胞以去除培養(yǎng)液,加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞,反復(fù)搖動(dòng)培養(yǎng)瓶使細(xì)胞充分裂解,提取總蛋白,使用BCA試劑盒檢測(cè)樣品蛋白濃度;樣品蛋白經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后,將膜移至封閉液孵育盒,室溫下封閉1 h。除去殘留封閉液,加入稀釋好的一抗p-AMPKα、AMPKα、p-mTOR、mTOR、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ及P62抗體4℃過夜。孵育結(jié)束后,用TBST洗滌3次;將稀釋好的二抗加入,孵育30 min后搖床上TBST洗滌3次?；瘜W(xué)發(fā)光法顯影、拍照,以β-actin作為內(nèi)參蛋白,使用AlphaEaseFC軟件分析目標(biāo)帶的光密度值。以上步驟重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 芹菜素對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 空白對(duì)照組培養(yǎng)24、48、72 h的細(xì)胞增殖抑制率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與空白對(duì)照組比較,芹菜素處理后A549細(xì)胞增殖抑制率隨濃度增加呈上升趨勢(shì),呈濃度依賴關(guān)系(P<0.05)。20、40、80 μmol/L芹菜素組隨作用時(shí)間延長(zhǎng),對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)逐漸增加,呈時(shí)間依賴關(guān)系(P<0.05)。160 μmol/L芹菜素組培養(yǎng)48及72 h的細(xì)胞增殖抑制率明顯高于24 h(P<0.05),但48與72 h之間的細(xì)胞增殖抑制率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1、圖1。經(jīng)SPSS軟件分析芹菜素作用A549細(xì)胞24、48、72 h的IC50值分別為128.13、52.18、24.03 μmol/L。

圖1 芹菜素對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制率的影響

表1 芹菜素對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制率的影響

2.2 芹菜素對(duì)A549細(xì)胞自噬的影響 與空白對(duì)照組比較,低、中、高濃度組A549細(xì)胞中檢測(cè)到具有高亮點(diǎn)狀熒光的自噬小泡數(shù)量及IOD值逐漸增加,細(xì)胞自噬呈濃度依賴性增加(P<0.01)。抑制劑組與高濃度實(shí)驗(yàn)組比較,細(xì)胞中含高亮點(diǎn)狀熒光的自噬小泡及IOD值減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2、3。

圖2 芹菜素對(duì)A549細(xì)胞自噬的影響(3000×)

圖3 積分光密度值(IOD)比較

2.3 芹菜素對(duì)A549細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 低、中、高濃度組與空白對(duì)照組比較,LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平依次升高,P62蛋白表達(dá)水平依次降低,均呈濃度依賴性(P<0.05)。抑制劑組與高濃度組比較,LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平下降,而P62蛋白表達(dá)水平升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 芹菜素對(duì)A549細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.4 芹菜素對(duì)A549細(xì)胞中AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組相比,各濃度芹菜素組p-AMPKα表達(dá)水平及p-AMPKα/AMPKα比值隨濃度升高依次增加,而p-mTOR表達(dá)水平及p-mTOR/mTOR比值隨濃度升高依次降低,均呈濃度依賴性(均P<0.05)。與高濃度組比較,抑制劑組p-AMPKα蛋白表達(dá)水平和p-AMPKα/AMPKα比值下降,而p-mTOR蛋白表達(dá)和p-mTOR/mTOR比值升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 芹菜素對(duì)A549細(xì)胞AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

芹菜素是一種廣泛分布的天然植物類黃酮,具有多種生理功能及藥理作用[11]。近來,芹菜素因其抗腫瘤活性和低毒性而被廣泛研究[12]。已有研究表明,芹菜素以劑量依賴方式降低人黑色素瘤細(xì)胞A375P和A375SM的細(xì)胞活力[13]。在肝癌細(xì)胞系SMMC-7721和HepG2中,芹菜素以劑量和時(shí)間依賴方式表現(xiàn)出顯著抗增殖活性,而對(duì)非致瘤細(xì)胞系LO2的細(xì)胞活力無顯著影響[14]。本研究結(jié)果顯示,芹菜素呈濃度依賴性顯著抑制肺癌A549細(xì)胞增殖活性,且在20、40、80μmol/L濃度下呈時(shí)間依賴性。

自噬是溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞自我消化過程,作為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡,對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程具有重要作用[15]。在自噬體形成過程中,自噬標(biāo)志蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)被脂質(zhì)化,LC3Ⅰ轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3Ⅱ,聚集于自噬體膜,蓄積的LC3Ⅱ被視為自噬標(biāo)志物[16]。P62是一種多功能支架蛋白,參與各種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)及自噬,作為一種重要的適配器,P62通過LIR結(jié)構(gòu)域與核心自噬蛋白質(zhì)LC3相互作用,介導(dǎo)特定的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)聚集體遞送至自噬溶酶體后共同被降解,細(xì)胞內(nèi)P62水平嚴(yán)格受自噬活性調(diào)控,其表達(dá)水平與自噬活性成反比[17-18]。研究顯示,芹菜素可通過促進(jìn)LC3蛋白的轉(zhuǎn)化,p62降解及酸性囊泡細(xì)胞器的形成顯著增加肝癌HepG2細(xì)胞、甲狀腺乳頭狀癌BCPAP細(xì)胞中的自噬水平,誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[19-20]。此外,芹菜素也能通過誘導(dǎo)胃癌AGS細(xì)胞、肺鱗癌NCI-H520細(xì)胞、結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞自噬和凋亡,抑制腫瘤生長(zhǎng)[21-23]。本研究顯示,芹菜素處理A549細(xì)胞后,高亮點(diǎn)狀熒光自噬小泡及自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ表達(dá)水平呈濃度依賴性增加,而P62蛋白表達(dá)水平逐漸降低,表明芹菜素可以促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞自噬。

AMPK是一種能量傳感器,基本存在于所有真核生物中,由異源三聚體復(fù)合物組成,包括α催化亞基和β、γ調(diào)節(jié)亞基,在代謝紊亂和癌癥中起著關(guān)鍵作用[24]。AMPK通路通過磷酸化而活化,活化的AMPK可調(diào)節(jié)各種代謝過程,包括自噬[25]。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是細(xì)胞代謝和自噬的重要調(diào)節(jié)因子,自噬誘導(dǎo)和mTORC1激活之間存在緊密的反向耦合關(guān)系[26]。AMPK/mTOR是細(xì)胞中從合成代謝到分解代謝的轉(zhuǎn)換,是自噬調(diào)控的關(guān)鍵途徑,通常充當(dāng)自噬的起始途徑[27]。已有研究證實(shí),芹菜素可激活胃癌細(xì)胞中的AMPK通路,促進(jìn)AMPK磷酸化,并下調(diào)p-mTOR來促進(jìn)自噬性細(xì)胞死亡[28]。本研究結(jié)果顯示,芹菜素可活化肺癌A549細(xì)胞中AMPK/mTOR通路,上調(diào)p-AMPKα蛋白表達(dá),增加p-AMPKα/AMPKα比值,并下調(diào)p-mTOR蛋白表達(dá)及p-mTOR/mTOR比值,促進(jìn)A549細(xì)胞自噬。且在加用AMPK抑制劑Compound C后,逆轉(zhuǎn)了芹菜素對(duì)AMPK通路的激活作用,并抑制了A549細(xì)胞自噬水平,進(jìn)一步證實(shí)芹菜素可通過AMPK/mTOR通路誘導(dǎo)A549細(xì)胞自噬。

4 結(jié)論

本研究表明芹菜素能抑制肺癌A549細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)其自噬,其作用機(jī)制可能與激活A(yù)MPK/mTOR通路有關(guān),為芹菜素在肺癌的臨床應(yīng)用提供了一定參考。但本研究?jī)H為體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),需進(jìn)一步聯(lián)合動(dòng)物模型和臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探索。