免疫指標(biāo)在結(jié)核性胸腔積液診斷中的研究進展

譚慧 綜述 王璞 審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,重慶 400016)

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的結(jié)核病是威脅人類生命健康的全球公共衛(wèi)生問題之一?！?021年全球結(jié)核病報告》[1]指出,2020年全球范圍內(nèi)估算有990萬結(jié)核病新發(fā)病例,死亡約151.4萬例,是當(dāng)下僅次于新型冠狀病毒肺炎的第二大單一傳染病致死原因[2-3]。按最新的診斷分類,結(jié)核性胸腔積液(Tuberculous pleural effusion,TPE)歸屬于肺結(jié)核[4],發(fā)病率約占所有結(jié)核病患者3%～30%[5]。TPE是MTB抗原引起的T淋巴細胞介導(dǎo)的胸膜腔內(nèi)滲出性遲發(fā)型超敏反應(yīng)和胸膜感染共同作用的結(jié)果[6-7], MTB抗原通過胸膜下實質(zhì)病灶的破裂進入胸膜腔,誘發(fā)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致毛細血管通透性增加、胸腔積液形成;可能是MTB原發(fā)感染的一種表現(xiàn),也可能與結(jié)核病再激活有關(guān)。在病變部位,活化的淋巴細胞聚集呈現(xiàn)“區(qū)室化”, 各種T細胞通過分泌細胞因子相互作用,形成特殊的感染灶微環(huán)境;強烈的免疫反應(yīng)對MTB有效抑制及清除,故而滲出液的細菌載量少、培養(yǎng)陽性率低,使得從細菌學(xué)角度鑒別TPE與其他胸腔積液,尤其是惡性胸腔積液(Malignant pleural effusion,MPE)在臨床上相對延遲且具有挑戰(zhàn)性;從病理學(xué)角度,即使內(nèi)科胸腔鏡的安全性和有效性已得到證實,但高度依賴于操作員專業(yè)技術(shù)和精密設(shè)備,在基層醫(yī)院開展受限,因有創(chuàng)性往往不被患者接受。近年來,國內(nèi)外對于診斷TPE的生物標(biāo)志物的研究眾多,腺苷脫氨酶(Adenosine deaminase, ADA)在TPE診斷方面的應(yīng)用價值得到大眾認(rèn)可、已在臨床實踐中廣泛開展。本文主要就近年來新興的免疫指標(biāo)在TPE診斷及鑒別診斷的研究進展予以綜述,旨在為臨床早期識別TPE以及今后相關(guān)研究提供參考。

1 免疫指標(biāo)用于TPE的診斷研究進展

免疫指標(biāo)按來源分為細胞因子、固有免疫、體液免疫指標(biāo),其中細胞因子主要包括干擾素、白介素、趨化因子,通過運用免疫病原微生物實驗檢測方法,檢測TPE中上述目標(biāo)免疫物質(zhì),從而達到早期臨床識別TPE的目標(biāo)。

1.1 細胞因子

1.1.1 干擾素γ(Interferon-γ,IFN-γ) 主要由活化的CD4+ T細胞和自然殺傷細胞釋放,機體感染MTB后,IFN-γ能使巨噬細胞聚集且增加其對MTB的殺菌活性,控制感染播散[8];另一方面,它又能通過程序性死亡分子1(PD1)及其配體(PD-L1)通路抑制CD4+T細胞增殖及黏附活性,使MTB不易被清除[9],在發(fā)揮TPE患者中發(fā)揮殺菌作用時具有正向和反向雙重作用。國內(nèi)外學(xué)者肯定了非刺激性IFN-γ對TPE的診斷性能：Aggarwal等[10]一項Meta分析顯示, IFN-γ診斷TPE的敏感性93%,特異性96%,PLR 22.80,NLR 0.07,隨后在后續(xù)進行的另一項Meta分析中比較了IFN-γ、ADA對TPE診斷準(zhǔn)確性,結(jié)果表明IFN-γ在確診和排除TPE方面均優(yōu)于ADA[11]。一些學(xué)者也探討了IFN-γ和ADA的聯(lián)合診斷價值,提出當(dāng)在兩者均為陰性,在中、高度疾病流行情況下可用于排除TPE;若均為陽性,對于微生物學(xué)未確診的患者,可啟動ATT[12]。IFN-γ是淋巴細胞來源的生物標(biāo)志物,因此也受TPE不同的感染背景的影響。在TPE患病率較低時,PPV相當(dāng)?shù)?但IFN-γ在任何流行情況下的NPV均優(yōu)于ADA：當(dāng)TPE流行率為5%、25%和85%時,ADA的NPV分別為99.6%、97.6%和76.0%,IFN-γ的NPV分別為99.8%、98.8%和83.0%[13]。雖然IFN-γ比 ADA似乎更具優(yōu)勢,但從成本效益出發(fā)分析,IFN-γ檢測成本高、量化技術(shù)繁瑣; INF-γ超靈敏快速免疫懸浮法(IRSA-TB)比ADA似乎擁有更好的成本效益[14-15],但現(xiàn)階段暫未在臨床實驗室廣泛開展。

1.1.2 γ干擾素釋放試驗(Interferon-γ release assays,IGRA)通過量化MTB基因組差異區(qū)域(RD)-1編碼的特定抗原[包括早期分泌抗原靶6(ESAT-6)、培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)和TB7.7(p4)]刺激離體的效應(yīng)T淋巴細胞釋放的IFN-γ,判斷是否存在MTB特異性細胞免疫反應(yīng)[16]。包括酶聯(lián)免疫斑點檢測法T-SPOT.TB 和酶聯(lián)免疫吸附測定QuantiFERON-TB Gold(QFT), 是世界衛(wèi)生組織(WHO) 批準(zhǔn)用于潛伏性結(jié)核病診斷的兩種較成熟的檢測方法[17]。 QuantiFERON檢測MTB特異抗原(ESAT-6、CFP-10和TB7.7)刺激產(chǎn)生的IFN-γ濃度;T-SPOT.TB則檢測外周血中受ESAT-6和CFP-10刺激釋放的IFN-γ的T細胞,對其進行斑點計數(shù)。與PPD相比,ESAT-6和CFP-10不存在于絕大部分非結(jié)核桿菌(NTM)和卡介苗(BCG)中,可避免BCG接種和NTM感染帶來的假陽性[18]。T-SPOT.TB的診斷性能優(yōu)于QuantiFERON[19],目前在臨床實踐中,應(yīng)用外周血T-SOPT.TB篩查結(jié)核感染開展較為廣泛,尤其是對于使用免疫抑制劑、生物制劑或小分子靶向藥物的患者,在啟動上述治療方案初期,需密切隨訪監(jiān)測A、B斑點數(shù)變化,避免在治療期間出現(xiàn)繼發(fā)結(jié)核感染或潛伏結(jié)核活動。由于MTB抗原特異性淋巴細胞的“區(qū)室化”特性,多項研究提出胸水T-SPOT.TB診斷效能優(yōu)于外周血[20-22];但在臨床實驗室,T-SOPT.TB應(yīng)用于胸水標(biāo)本仍比外周血標(biāo)本少見,可能與胸腹腔積液、腦脊液等臨床樣本缺乏統(tǒng)一的操作流程和判斷標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)。

1.1.3 白細胞介素27(Interleukin27,IL-27) 白細胞介素可與特定受體結(jié)合介導(dǎo)白細胞間的通訊,進而促進各種類型的炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)一些白介素在TPE中升高,促使學(xué)者探索它們在診斷TPE及鑒別TPE 與其他類型胸腔積液方面的潛在價值。IL-27是一個值得關(guān)注的指標(biāo),它是一種主要由活化的抗原遞呈細胞所分泌的異二聚體,屬于IL-12/IL-6細胞因子家族成員,作為MTB感染人體后免疫應(yīng)答中重要的細胞因子,通過Th1免疫反應(yīng)參與 IFN-γ 的產(chǎn)生,對Th1型免疫和IFN-γ分泌存在雙重調(diào)節(jié)作用[23]。許多研究均報告了胸水 IL-27對于TPE的診斷是一種敏感而特異的生物標(biāo)志物：有3項Meta分析全面評估了IL-27對TPE的診斷效率,分別納入9項(1 226例患者)、7項(1 157例患者)、11項(1 454例患者)研究,其敏感性為92%～95%、特異性為90%～92%、PLR 為13.99～29.87、NLR 為0.07～0.09[24-26]。IL-27在鑒別TPE和惡性胸膜間皮瘤、淋巴瘤所致的胸腔積液不盡如人意[27],在小兒TPE中的診斷價值亦有限,無法區(qū)分兒童TPE和肺炎支原體肺炎性胸腔積液[28]。但學(xué)者們一致認(rèn)為IL-27聯(lián)合IFN-γ或ADA,或者3者聯(lián)合檢測可提高診斷效率(當(dāng)3項至少有一項為陽性時,最佳靈敏度為100%;當(dāng)3項都呈陽性時,特異性為100%)[29],可作為臨床診斷TPE的優(yōu)選策略。另外,Jiang等[30]探討了年齡作為獨立協(xié)變量對胸水ADA、IFN-γ和IL-27在TPE診斷方面的影響,在年輕患者(≥18歲、≤40歲)中, ADA的診斷性能最優(yōu);對于40歲以上患者,IL-27和IFN-γ在區(qū)分TPE與非TPE表現(xiàn)更出色,故建議在臨床上將生物標(biāo)記物與年齡相結(jié)合,以較高的敏感性和特異性估計TPE的發(fā)生概率,可能使患者避免侵入性操作。但IL-27檢測支出大、技術(shù)繁瑣,如何降低檢測成本、簡化檢測程序可作為未來研究探索的空間。

1.1.4 其他白介素 一些研究發(fā)現(xiàn)胸水IL-32、IL-33、IL-2、可溶性IL-2受體(sIL-2R)、IL-31在TPE中表達亦增高,對TPE診斷有潛在價值[31-35],但它們的臨床相關(guān)性及診斷準(zhǔn)確性需進一步確定,且與ADA、IFN-γ以及IL-27相比,無明顯優(yōu)勢。

1.2 趨化因子 趨化因子CXCR3配體,由IFN-γ誘導(dǎo),強烈募集免疫細胞,與結(jié)核病發(fā)病相關(guān);包括3種趨化因子(CXCL9、CXCL10和CXCL11)。CXCL10,又名IFN-γ的誘導(dǎo)蛋白10(IP-10),在結(jié)核病患者的血液和體液中得到了最廣泛的檢測;連續(xù)的血漿IP-10檢測可能有利于區(qū)分來自LTBI的活動性結(jié)核[36]。Porcel等[37]評估了胸水IP-10濃度識別TPE的靈敏度和特異性,分別為84%和90%,與IFN-γ一樣,它的預(yù)測值不受年齡影響。Chung等[38]研究評價了胸水CXCL9、CXCL11對TPE的診斷價值,發(fā)現(xiàn)它們在TPE組濃度顯著高于非TPE組(MPE、PPE、漏出液),AUC均>0.9,其中CXCL9在區(qū)分TPE與MPE中表現(xiàn)最佳。趨化因子在TPE診斷中的潛在作用值得關(guān)注,現(xiàn)階段涉及文獻較少,其適用性、穩(wěn)定性、檢測技術(shù)和成本,以及免疫狀態(tài)是否會影響結(jié)果,這些問題需要在未來多中心研究中解答。

1.3 其他免疫學(xué)相關(guān)指標(biāo) 單核-巨噬細胞對于宿主免疫MTB感染至關(guān)重要,在不同因素刺激下,可通過經(jīng)典激活或替代激活途徑極化為“促炎”型M1細胞(CD14+CD86+)、“抑炎”型M2細胞(CD14+CD163+)。一項前瞻性研究比較了TPE和MPE胸水M1/M2型細胞數(shù)量、占比,發(fā)現(xiàn)TPE中巨噬細胞向M1極化,MPE向M2極化,提出可通過胸水巨噬細胞的極化方向?qū)烧哌M行辨別[39]。程序性死亡分子-1配體(PD-L1)及其可溶性形式(sPD-L1)是近年來免疫微環(huán)境研究的熱點,抗PD1/PD-L1抗體已在腫瘤的靶向免疫治療取得巨大突破。PD-1/PD-L1通路在抗結(jié)核免疫中主要發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用,抑制T細胞活化,從而阻止過度免疫損傷;動物試驗證實敲除PD-1、PD-L1后,小鼠肺部病理變化加重,MTB負荷升高[40]。有研究提出TPE胸水中sPD-L1明顯高于MPE或非TPE;對TPE的診斷有一定輔助價值(AUC>0.8)[41-42]。PD-L1為TPE的診斷研究提供了新的方向,其在TPE中的具體機制以及診斷準(zhǔn)確性尚不明確,現(xiàn)階段在腫瘤的免疫向治療領(lǐng)域應(yīng)用更為廣泛,PD-1抗體特異性與T淋巴細胞表面的PD-1結(jié)合或PD-L1抗體與腫瘤細胞的PD-L1結(jié)合,從而解除腫瘤細胞對淋巴細胞的免疫抑制調(diào)節(jié),達到殺滅腫瘤細胞的目的。

2 新的技術(shù)方法在TPE的診斷研究進展

隨著人類基因組的解碼和基因檢測技術(shù)的日益成熟,高通量測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué),為研究者中在體液或胸膜組織中探索能夠有效診斷TPE的新型生物標(biāo)志物創(chuàng)造了一種新的機遇;學(xué)者們也利用高通量測序方法探討與結(jié)核病相關(guān)的RNA、蛋白質(zhì)和小分子代謝物質(zhì),涉及轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)。

2.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)-miRNA 一類小型非編碼RNA,不僅存在于細胞中,也存在于各種體液中,具有良好穩(wěn)定性且易于檢測,可通過實時熒光定量PCR技術(shù)完成胸水中miRNA的定量檢測[44]。miR-29a屬于較早發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關(guān)的miRNA之一,在肺結(jié)核的發(fā)病機制中也起重要作用,通過與IFN-α mRNA結(jié)合負向調(diào)節(jié)機體對MTB的免疫應(yīng)答[45]。有研究發(fā)現(xiàn)TPE患者胸水miR-29a的表達明顯高于MPE;且miR-29a與ADA在TPE中呈顯著正相關(guān);在ATT后胸腔積液中miR-29a表達下調(diào),提示miR-29a有望成為鑒別TPE與MPE的新指標(biāo),并判定結(jié)核病的活動性[46]。但由于尚無基于大樣本的研究對TPE高表達的miRNA進行篩選和驗證、胸水中miRNA濃度偏低、定量檢測技術(shù)待優(yōu)化、對于已篩選的特異性miRNA在TPE中的作用機制仍未知等因素,目前暫未開發(fā)商業(yè)化的基于miRNA組合物的TPE預(yù)測試劑盒。

2.2 蛋白質(zhì)組學(xué) 主要研究生物體內(nèi)蛋白質(zhì)含量動態(tài)變化,多年來一直是生命科學(xué)各個領(lǐng)域的研究熱點。蛋白質(zhì)組學(xué)在結(jié)核病研究和臨床應(yīng)用中具有巨大潛力?；谫|(zhì)譜分析的非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是近年來發(fā)現(xiàn)結(jié)核病相關(guān)蛋白標(biāo)記的有前途的方法[47],從體液中分析出與非結(jié)核性疾病患者之間的差異性蛋白,再通過蛋白質(zhì)譜的比較分析,尋找到結(jié)核性相關(guān)特異性蛋白,進而發(fā)現(xiàn)TPE新型診斷標(biāo)志物。補體C1抑制物、銅藍蛋白、溶菌酶前體、凝溶膠蛋白等被發(fā)現(xiàn)在TPE中高于MPE[48-51],顯示了區(qū)分TPE與MPE的潛在能力。國內(nèi)學(xué)者有兩項研究對比分析了TPE患者血清、胸水蛋白質(zhì)組,發(fā)現(xiàn)TPE患者體液中特異性高表達相對分子質(zhì)量為2660的蛋白質(zhì),提示具有此特征的蛋白可能是診斷TPE的目標(biāo)蛋白[52-53]。此方面研究受限于諸多因素(如蛋白質(zhì)樣品的制備處理、技術(shù)成本高等),僅停留在描述階段,對初現(xiàn)曙光的目標(biāo)蛋白也缺乏更深層次研究。

2.3 代謝組學(xué) 主要是通過探索生命體在不同生理病理狀態(tài)下所產(chǎn)生的內(nèi)源性小分子代謝物變化規(guī)律,尋找疾病的特異性代謝標(biāo)志物。核磁共振(NMR)光譜和質(zhì)譜(MS)是代謝分析的兩種主要技術(shù)[54]。有研究對TPE、MPE患者胸水小分子的代謝譜進行了比較分析,發(fā)現(xiàn)它們間的物質(zhì)代謝差異顯著：研究在TPE與MPE間篩選出17種差異代謝物,TPE中有5種上調(diào),亞油酸甲酯和替普瑞酮上調(diào)62倍、19倍[55]。細胞外囊泡(EV)的代謝組學(xué)分析是一個新的研究領(lǐng)域。EV是細胞在機體應(yīng)激時以脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)包裹胞漿物質(zhì)并分泌到細胞外的一種納米級囊泡,其中包含DNA、RNA、蛋白質(zhì)等成分,具有調(diào)節(jié)細胞通訊、血管生成、免疫調(diào)節(jié)作用。Luo等[56]從胸水EV代謝物水平探索了結(jié)核和惡性腫瘤的代謝重編程,為胸腔積液的機制提供了新的見解,發(fā)現(xiàn)了區(qū)分TPE和MPE的4個候選代謝物(苯丙氨酸、亮氨酸、磷脂酰膽堿和鞘磷脂)。對于延遲或漏診的患者,代謝物組分析可能是生化、免疫檢測的有益互補。但它也面臨著蛋白質(zhì)組學(xué)相似的困境,可重復(fù)性差,在尿液、血清或胸液中的MTB代謝標(biāo)志物未確定,今后需開發(fā)更快速的檢測方法及方便的EVs分離技術(shù)。

3 總結(jié)與展望

TPE診斷相關(guān)研究所涉及的免疫指標(biāo)中,IGRA運用最為廣泛,其中以外周血T-SPOT.TB最為顯著,未刺激的IFN-γ、IL-27也是重要的檢測指標(biāo),但由于檢測成本高、技術(shù)復(fù)雜,不作為TPE診斷的常規(guī)選擇。在臨床中,對于不同標(biāo)志物的優(yōu)勢可聯(lián)合應(yīng)用,使優(yōu)劣勢互補增強特異度和靈敏度以提高應(yīng)用價值。其他具有潛在價值的標(biāo)志物,實驗證據(jù)尚不足且差異較大未被廣泛接受。另外,不能提供培養(yǎng)和藥物敏感性信息是免疫指標(biāo)無法回避的缺陷。隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,新興的檢測技術(shù)不斷涌現(xiàn),給疑難危重感染性疾病的診療注入“新力量”。轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)相關(guān)研究的引入,為TPE的診斷開拓了新視野,但尚處于“萌芽期”,還有諸多問題待解決。在醫(yī)療條件較差的地區(qū),需權(quán)衡檢測技術(shù)性能與患方經(jīng)濟可承受性,“因地制宜”規(guī)范應(yīng)用,同時緊密結(jié)合經(jīng)典的結(jié)核病微生物學(xué)檢查,降低患者疾病負擔(dān)。