神經(jīng)生長(zhǎng)因子及其受體在高原牦牛與平原黃牛端腦中的比較分析

吳亞娟 杜曉華，* 劉 霞 鄭麗平 劉珊珊

（1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中最早被發(fā)現(xiàn)的成員之一［1］，是一種分泌型糖蛋白，主要通過(guò)與高親和力受體酪氨酸蛋白激酶A（tyrosine protein kinase A，TrkA）結(jié)合調(diào)節(jié)神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育、存活及再生［2］。有研究表明，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生缺血性腦損傷時(shí)，NGF 與其受體TrkA 可通過(guò)表達(dá)上調(diào)對(duì)受損組織或細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)，對(duì)機(jī)體發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，同時(shí)也在維持神經(jīng)系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮著重要作用［3-4］，此外，NGF 可通過(guò)刺激血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和其他血管活性因子促進(jìn)血管生成，增加供氧量對(duì)缺氧神經(jīng)元進(jìn)行保護(hù)［5-6］。有研究顯示，當(dāng)NGF 及其受體TrkA 異常表達(dá)時(shí)，在臨床上常引發(fā)糖尿病［7-9］、抑郁癥［10］以及阿爾茨海默癥［11-12］等疾病。

端腦又稱(chēng)大腦，是腦組織中占比最大、結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的部分［13］。其大腦皮質(zhì)在機(jī)體認(rèn)知、情緒、感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)方面發(fā)揮著重要作用，海馬則在情緒處理及記憶方面起著重要作用。有研究證實(shí)，哺乳動(dòng)物大腦中的皮層和海馬，功能一旦受損，就會(huì)出現(xiàn)癲癇、抑郁以及精神分裂癥等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?4］。牦牛（Bosgrunniens）因生存環(huán)境的特殊性形成了獨(dú)有的低氧適應(yīng)機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)，因缺氧引起腦功能紊亂時(shí)，NGF可促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增殖對(duì)缺氧進(jìn)行抵抗［14］。同時(shí)，NGF 通過(guò)表達(dá)上調(diào)激活受體TrkA，構(gòu)成NGF-TrkA 調(diào)控系統(tǒng)，在大腦缺血缺氧方面發(fā)揮內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)作用［15］。目前，有關(guān)NGF 及其受體TrkA 在牛屬動(dòng)物體內(nèi)的研究仍局限于水牛和牦牛的生殖器官，以及牦牛的心、肝、脾、肺、腎等部位［16-17］，而在牦牛中樞神經(jīng)系統(tǒng)器官和組織中的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。

鑒于此，本研究以高原牦牛腦組織為研究對(duì)象，針對(duì)其端腦部位，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)（immunohistochemistry，IHC）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）以及蛋白免疫印跡技術(shù)（Western Blot，WB）對(duì)NGF 及其受體TrkA 在牦牛端腦各區(qū)的分布及表達(dá)特征進(jìn)行研究，并與平原黃牛比較，旨在探討NGF和TrkA在牦牛端腦不同區(qū)域分布規(guī)律、表達(dá)水平與低氧環(huán)境之間的關(guān)聯(lián)，為進(jìn)一步探究牦牛適應(yīng)高原低氧環(huán)境提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品的選取

于甘肅省甘南藏族自治州合作市及河南省鄭州市某屠宰場(chǎng)，分別隨機(jī)選取5 頭健康的成年甘南牦牛與南陽(yáng)黃牛，其中牦牛所處區(qū)域平均海拔高度為2 960 m，黃牛所處區(qū)域平均海拔高度為108 m，待屠宰后迅速開(kāi)顱取出完整的腦組織，并分區(qū)采集端腦組織樣品，包括大腦皮質(zhì)（額葉皮質(zhì)、顳葉皮質(zhì)、頂葉皮質(zhì)及枕葉皮質(zhì)）、大腦白質(zhì)、海馬及胼胝體等組織，分別投入液氮和4%多聚甲醛中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器

TriQuick Reagent 總RNA 提取試劑，蘭州科寶生物科技有限公司；Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，湖南艾科瑞生物工程有限公司；神經(jīng)生長(zhǎng)因子多克隆抗體（rabbit anti-NGF polyclonal antibody，DF6061），江蘇親科生物研究中心有限公司；酪氨酸蛋白激酶受體A多克隆抗體（rabbit anti-TrkA polyclonal antibody，bs-0193R）、β-肌動(dòng)蛋白（內(nèi)參對(duì)照）多克隆抗體［rabbit anti-β-Actin（Loading Control）polyclonal antibody，bs-0061R］、二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG HRP（goat anti-rabbit Ig G/HRP，bs-0295G-HRP），北京博奧森生物技術(shù)有限公司；鏈霉卵白素—生物素法檢測(cè)（streptavidin peroxidase，SP）試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；增強(qiáng)型HRP-二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）底物顯色試劑盒，北京天根生化科技有限公司；增強(qiáng)型化學(xué)超敏發(fā)光液（enhanced-chemiluminescence，ECL），北京索萊寶科技有限公司。LightCycler96 PCR 儀，德國(guó)瑞士Roche 公司；冷凍型高通量組織研磨儀，寧波新芝生物公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 IHC 染色定位 將包埋好的石蠟塊用切片機(jī)切成厚度為4 μm的切片，經(jīng)展片、捻片及烘片處理后，放置于切片架上依次經(jīng)二甲苯、苯酒（二甲苯與無(wú)水酒精配比為1∶1）、無(wú)水酒精、95%酒精、80%酒精進(jìn)行脫蠟復(fù)水，后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）沖洗，再將切片架放入已沸騰的檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)處理，并依次滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑和山羊血清工作液進(jìn)行阻斷封閉，隨后滴加以1∶100 稀釋好的NGF 與TrkA 一抗，置于4 ℃冰箱過(guò)夜孵育，其中部分組織用PBS 以代替一抗，作為陰性對(duì)照，再依次滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG 和辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育，洗滌后滴加現(xiàn)配的DAB 顯色液進(jìn)行顯色觀(guān)察，待出現(xiàn)黃棕色時(shí)立即終止，后經(jīng)常規(guī)脫水透明后用中性樹(shù)膠封片，晾干后用光學(xué)顯微鏡觀(guān)察拍照并留存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 qRT-PCR 檢測(cè) 將凍存于液氮中的端腦組織迅速取出置于冰盒上，分別稱(chēng)取約0.2 g左右的組織樣品于5 mL 離心管中，加入TriQuick Reagent 總RNA 提取試劑后置于提前預(yù)冷的高通量組織研磨儀中充分研磨后，進(jìn)行常規(guī)的分離沉淀操作。將提取得到的總RNA經(jīng)測(cè)濃度后依次進(jìn)行定量，根據(jù)Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟進(jìn)行cDNA 反轉(zhuǎn)錄，并進(jìn)行qRTPCR，反應(yīng)體系20 μL：SYBR High-Sensitivy qPCR SuperMix 10 μL、0.2 μmol·mL-1上下游引物各1 μL、300 ng·μL-1模板cDNA 1 μL、ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序：50 ℃預(yù)熱2 min；95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火45 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，采用2-ΔΔCt定量分析法計(jì)算NGF和TrkA基因的相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)NCBI 已有的牦牛NGF（NM_001099362.1）、牦牛TrkA（XM_024989929.1）、牦牛β-actin內(nèi)參基因（NM_173979.3）序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生物工程股份有限公司合成，引物信息見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物信息Table 1 Information for qRT-PCR primers

1.3.3 WB 檢測(cè) 將凍存于液氮中的端腦組織迅速取出置于冰盒上，分別稱(chēng)取約0.2 g的組織樣品于5 mL離心管中，加入RIPA 組織快速裂解液（RIPA lysis buffer）置于已預(yù)冷的高通量組織研磨儀中充分研磨，經(jīng)冰浴裂解及離心后，取120 μL上清液，與40 μL 4×蛋白上樣緩沖液混合，放置于金屬浴中95 ℃變性10 min，冷卻至室溫，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）后根據(jù)指示標(biāo)記（marker）切膠轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，接著加入以1∶700 稀釋的NGF 與TrkA 一抗，β-actin 則以1∶3 000 稀釋?zhuān)? ℃過(guò)夜孵育，磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate buffered solution+Tween-20，PBST）洗滌后加入以1∶5 000 稀釋的二抗，室溫孵育2 h，PBST緩沖液充分洗滌，用ECL 在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光，獲取蛋白條帶。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 20.0 軟件對(duì)NGF和TrkA基因與其蛋白相對(duì)表達(dá)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），所有數(shù)據(jù)均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean ± SD）”表示，并采用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 IHC染色定位結(jié)果

2.1.1 NGF 及其受體TrkA 蛋白在牦牛端腦不同區(qū)域中的表達(dá)與分布 經(jīng)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)（圖1），NGF 和TrkA 陽(yáng)性細(xì)胞在牦牛端腦中的分布及定位趨勢(shì)一致。在額葉皮質(zhì)、顳葉皮質(zhì)、頂葉皮質(zhì)及枕葉皮質(zhì)構(gòu)成的大腦皮質(zhì)區(qū)域中，NGF 和TrkA 蛋白主要在馬丁諾提（Martinotti）細(xì)胞、顆粒細(xì)胞的胞質(zhì)以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)；大腦白質(zhì)中，NGF 和TrkA 蛋白主要在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)；海馬中，NGF 和TrkA 蛋白主要在錐體細(xì)胞層中表達(dá)，在多型細(xì)胞層和分子細(xì)胞層少量表達(dá)；胼胝體中，NGF 和TrkA 蛋白主要定位于多型細(xì)胞胞質(zhì)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。其中，陰性對(duì)照均無(wú)免疫陽(yáng)性表達(dá)。

圖1 牦牛端腦不同區(qū)域中NGF和TrkA蛋白分布Fig.1 Distribution of NGF and TrkA proteins in different regions of the yaks telencephalon

圖2 黃牛端腦不同區(qū)域中NGF和TrkA蛋白分布Fig.2 Distribution of NGF and TrkA proteins in different regions of the cattles telencephalon

2.1.2 NGF 及其受體TrkA 蛋白在黃牛端腦不同區(qū)域中的表達(dá)與分布 經(jīng)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與牦牛相似，NGF 和TrkA 陽(yáng)性細(xì)胞在黃牛端腦中的分布及定位趨勢(shì)一致。大腦皮質(zhì)各區(qū)域中，NGF 和TrkA 蛋白主要在Martinotti 細(xì)胞、顆粒細(xì)胞胞質(zhì)以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)；大腦白質(zhì)中，NGF 和TrkA 蛋白則主要在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)；海馬中，NGF 和TrkA 蛋白主要在錐體細(xì)胞層中表達(dá)，在多型細(xì)胞層和分子細(xì)胞層少量表達(dá)；胼胝體中，NGF 和TrkA 蛋白主要定位于多型細(xì)胞胞質(zhì)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。其中，陰性對(duì)照均無(wú)免疫陽(yáng)性表達(dá)。

2.1.3 NGF 及其受體TrkA 蛋白在牦牛與黃牛端腦中表達(dá)與分布的比較結(jié)果 NGF 和TrkA 蛋白在牦牛端腦各區(qū)域中的分布及定位趨勢(shì)與黃?；疽恢?，但二者在端腦各區(qū)域中的免疫陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)度整體為牦牛強(qiáng)于黃牛（圖1、2）。

2.2 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)qRT-PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，牦牛端腦內(nèi)NGFmRNA在頂葉皮質(zhì)和顳葉皮質(zhì)中表達(dá)量最高，且顯著高于其他組織（P＜0.05），其次分別為枕葉皮質(zhì)、額葉皮質(zhì)、海馬、胼胝體和大腦白質(zhì)，除頂葉皮質(zhì)與顳葉皮質(zhì)差異不顯著外，其余區(qū)域間表達(dá)差異顯著（P＜0.05，圖3）；黃牛端腦內(nèi)NGFmRNA 在額葉皮質(zhì)中表達(dá)量最高，顯著高于其他組織（P＜0.05），其次分別為頂葉皮質(zhì)、枕葉皮質(zhì)、顳葉皮質(zhì)、海馬、大腦白質(zhì)、胼胝體，其中海馬與大腦白質(zhì)之間差異不顯著，其余區(qū)域間表達(dá)差異顯著（P＜0.05，圖3）。NGFmRNA 僅在額葉皮質(zhì)、枕葉皮質(zhì)及大腦白質(zhì)中的表達(dá)量為牦牛低于黃牛或與黃牛無(wú)顯著差異，而在其余區(qū)域中表達(dá)量均為牦牛顯著高于黃牛。

圖3 牦牛與黃牛端腦不同區(qū)域中NGF基因的表達(dá)情況Fig.3 The expression of NGF gene in different regions of the yaks and cattles telencephalon

牦牛端腦內(nèi)TrkAmRNA 在海馬中表達(dá)量最高，且顯著高于其他組織（P＜0.05），其次分別為頂葉皮質(zhì)、枕葉皮質(zhì)、胼胝體、顳葉皮質(zhì)、額葉皮質(zhì)和大腦白質(zhì)，其中除胼胝體與顳葉皮質(zhì)之間表達(dá)不顯著外，其余區(qū)域間表達(dá)差異均顯著（P＜0.05，圖4）；在黃牛頂葉皮質(zhì)和海馬中表達(dá)量最高，顯著高于其他組織（P＜0.05），其次分別為枕葉皮質(zhì)、胼胝體、顳葉皮質(zhì)、額葉皮質(zhì)、大腦白質(zhì)，其中頂葉皮質(zhì)和海馬之間差異不顯著，其余區(qū)域間表達(dá)差異顯著（P＜0.05，圖4）。TrkAmRNA 僅在大腦白質(zhì)中表達(dá)量為牦牛與黃牛無(wú)顯著差異，其余區(qū)域中表達(dá)量均為牦牛顯著高于黃牛。

圖4 牦牛與黃牛端腦不同區(qū)域中TrkA基因表達(dá)情況Fig.4 The expression of TrkA gene in different regions of the yaks and cattles telencephalon

2.3 WB檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)WB 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，牦牛端腦內(nèi)NGF 蛋白在頂葉皮質(zhì)中表達(dá)量最高，且顯著高于其他組織（P＜0.05），其次為顳葉皮質(zhì)、枕葉皮質(zhì)、額葉皮質(zhì)、海馬、胼胝體、大腦白質(zhì)，其中胼胝體和大腦白質(zhì)之間差異不顯著，其余區(qū)域間表達(dá)差異顯著（P＜0.05，圖5）；在黃牛額葉皮質(zhì)和頂葉皮質(zhì)中表達(dá)量最高，顯著高于其他組織（P＜0.05），其次分別為枕葉皮質(zhì)、顳葉皮質(zhì)、海馬、大腦白質(zhì)、胼胝體，其中額葉皮質(zhì)與頂葉皮質(zhì)、顳葉皮質(zhì)與海馬之間表達(dá)差異不顯著，其余區(qū)域間表達(dá)差異均顯著（P＜0.05，圖5）。與黃牛相比，NGF 蛋白在大腦白質(zhì)中的表達(dá)量為牦牛低于黃牛，其他區(qū)域中表達(dá)量均為牦牛顯著高于黃牛。

圖5 牦牛與黃牛端腦不同區(qū)域中NGF蛋白表達(dá)情況Fig.5 Expression of NGF protein in different regions of the yaks and cattles telencephalon

牦牛端腦內(nèi)TrkA 蛋白在海馬中表達(dá)量最高，且顯著高于其他組織（P＜0.05），其次分別為頂葉皮質(zhì)、枕葉皮質(zhì)、胼胝體、顳葉皮質(zhì)、額葉皮質(zhì)、大腦白質(zhì)，且彼此之間表達(dá)差異顯著（P＜0.05，圖6）；在黃牛海馬中表達(dá)量亦為最高，也顯著高于其他組織（P＜0.05），其次依次為額葉皮質(zhì)、頂葉皮質(zhì)、枕葉皮質(zhì)、大腦白質(zhì)、胼胝體、顳葉皮質(zhì)，其中枕葉皮質(zhì)與大腦白質(zhì)之間無(wú)顯著差異，其余區(qū)域間表達(dá)差異顯著（P＜0.05，圖6）。與黃牛相比，TrkA 蛋白在額葉皮質(zhì)和大腦白質(zhì)表達(dá)量為牦牛低于黃牛，在枕葉皮質(zhì)中表達(dá)量與黃牛間差異不顯著，其余區(qū)域中表達(dá)量均為牦牛顯著高于黃牛。

圖6 牦牛與黃牛端腦不同區(qū)域中TrkA蛋白表達(dá)情況Fig.6 Expression of TrkA protein in different regions of the yaks and cattles telencephalon

3 討論

NGF 存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，通過(guò)結(jié)合高親和力受體TrkA 可激活與神經(jīng)元存活和分化相關(guān)的下游通路［18］，參與協(xié)調(diào)神經(jīng)內(nèi)分泌及晝夜節(jié)律性活動(dòng)［16，19-20］，且廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的基底前腦、皮質(zhì)及海馬區(qū)域［21-22］，這與本研究中NGF和TrkAmRNA 及蛋白在牦牛與黃牛端腦不同區(qū)域均有表達(dá)的結(jié)果一致，表明NGF 和TrkA 在端腦各區(qū)域?qū)λ呒坝X(jué)醒等生理活動(dòng)具有重要的調(diào)控作用。此外，Liu 等［23］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，NGF 在正常大腦各區(qū)域中廣泛分布，但在大腦皮質(zhì)和海馬中明顯高表達(dá)，與本研究NGF 在牦牛與黃牛大腦皮質(zhì)和海馬中高表達(dá)的結(jié)果一致，由此推測(cè)其高表達(dá)與NGF 自分泌途徑激活有關(guān)，通過(guò)上調(diào)NGF 的表達(dá)量去維持大腦皮質(zhì)和海馬涉及情緒認(rèn)知及學(xué)習(xí)記憶相關(guān)功能的正常運(yùn)行。Sofroniew 等［3］研究發(fā)現(xiàn)，NGF 表達(dá)受缺血缺氧影響而上調(diào)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了大腦白質(zhì)外，NGF 在牦牛端腦其他區(qū)域中表達(dá)水平顯著高于黃牛，推測(cè)上述結(jié)果與牦牛的低氧適應(yīng)性有關(guān)，即牦牛能夠通過(guò)上調(diào)NGF 表達(dá)量以增強(qiáng)端腦組織對(duì)低氧的耐受性。此外，本研究發(fā)現(xiàn)NGF 在牦牛端腦的皮質(zhì)區(qū)域中表達(dá)量最高，其次為海馬，這與黃英［24］對(duì)I125-NGF在缺氧新生鼠腦內(nèi)的吸收分布研究中的描述不一致，推測(cè)這種差異與動(dòng)物機(jī)體缺氧周期有關(guān)，對(duì)于長(zhǎng)期處于低氧狀態(tài)的牦牛，內(nèi)源性NGF 可能在其端腦各部的神經(jīng)通路中相互聯(lián)動(dòng)，以維持端腦各區(qū)域的穩(wěn)態(tài)平衡。

TrkA 是由原癌基因酪氨酸蛋白激酶編碼的一種可跨膜蛋白，是NGF 的功能性受體［25］，NGF 通過(guò)與膜受體TrkA 結(jié)合在胞內(nèi)磷酸化，繼而激活并發(fā)揮生物學(xué)活性［26］。有研究表明，NGF及其受體TrkA的表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中同步升高，可以有效改善機(jī)體的記憶和認(rèn)知功能［27］，結(jié)合本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種因子在端腦部分區(qū)域中表達(dá)的同步性可能也與改善機(jī)體記憶及認(rèn)知有關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，NGF在牦牛端腦的皮質(zhì)區(qū)域中表達(dá)量最高，TrkA 在牦牛海馬中表達(dá)量最高；而楊傳紅等［28］關(guān)于內(nèi)源性NGF 在缺血性老年大鼠部分腦區(qū)及小腦中的表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中對(duì)缺血敏感的區(qū)域是海馬、大腦皮質(zhì)以及小腦蒲肯野細(xì)胞，提示大腦皮質(zhì)和海馬是牦牛端腦組織中對(duì)低氧最為敏感的區(qū)域。牦牛與黃牛相比，TrkAmRNA 除了在牦牛大腦白質(zhì)中表達(dá)量與黃牛無(wú)差異之外，在其他區(qū)域中表達(dá)量均顯著高于黃牛；TrkA 蛋白則在枕葉皮質(zhì)中表達(dá)量與黃牛無(wú)差異，在額葉皮質(zhì)和大腦白質(zhì)中表達(dá)量均低于黃牛，在其他區(qū)域表達(dá)量顯著高于黃牛，推測(cè)這可能與TrkA 受體膜表面運(yùn)輸通路有關(guān)，以網(wǎng)絡(luò)蛋白依賴(lài)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入胞質(zhì)的TrkA 蛋白與溶酶體結(jié)合后被降解［29］，進(jìn)而導(dǎo)致TrkAmRNA 和蛋白表達(dá)具有差異。

免疫組化結(jié)果顯示，NGF在大腦皮質(zhì)、海馬及胼胝體各區(qū)域主要分布在神經(jīng)元胞質(zhì)中，大腦白質(zhì)中NGF主要分布在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，這與前人的研究結(jié)果一致［30-31］，說(shuō)明NGF和TrkA對(duì)端腦的神經(jīng)保護(hù)作用主要依賴(lài)于以上神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的存活去維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，同時(shí)也參與神經(jīng)系統(tǒng)抗損傷過(guò)程。TrkA 蛋白在牦牛與黃牛端腦中的分布與定位特征與NGF 蛋白相似，提示二者可能在功能上具有協(xié)同性。此外，有研究表明，NGF陽(yáng)性表達(dá)隨腦缺血時(shí)長(zhǎng)而增強(qiáng)［32］，本研究發(fā)現(xiàn)，牦牛端腦各區(qū)中NGF 和TrkA蛋白免疫陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)度整體強(qiáng)于黃牛，推測(cè)這一現(xiàn)象可能與牦牛低氧適應(yīng)性有關(guān)，在長(zhǎng)期的低氧刺激下，上述細(xì)胞被激活并大量產(chǎn)生NGF，進(jìn)而誘導(dǎo)受體TrkA 磷酸化，及時(shí)糾正因低氧所導(dǎo)致的腦功能紊亂，協(xié)同對(duì)端腦各區(qū)域進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)作用。

4 結(jié)論

本研究在成年牦牛與黃牛端腦組織中檢測(cè)了NGF及其受體TrkA的表達(dá)和分布。結(jié)果表明，NGF和TrkA主要依賴(lài)于端腦組織中的神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)作用同時(shí)經(jīng)牦牛與黃牛對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，NGF 和TrkA 除了共同參與調(diào)控動(dòng)物機(jī)體正常的生理活動(dòng)之外，在受到低氧刺激時(shí)，也可通過(guò)表達(dá)上調(diào)以增強(qiáng)牦牛端腦組織對(duì)低氧的耐受性。