低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos通過(guò)抑制肺血管EndMT緩解低氧性肺動(dòng)脈高壓*

王玉香，劉川川，張晴晴，黃 攀，劉 紅，馬有剛，王小波，王亞婷，馬 蘭△

（1青海大學(xué)醫(yī)學(xué)部，青海 西寧 810016；2青海大學(xué)附屬醫(yī)院包蟲(chóng)病實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810001；3青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810001）

低氧性肺動(dòng)脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）是由于肺血管收縮和血管重構(gòu)所致的肺動(dòng)脈壓力持續(xù)增高，導(dǎo)致右心肥厚甚至衰竭［1］。肺血管重構(gòu)是HPH 發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，表現(xiàn)為肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞過(guò)度增殖、肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和肺血管纖維化［2］。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是肺血管重構(gòu)的關(guān)鍵因素［3］。內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生不可逆增殖，失去其內(nèi)皮表型轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)樣表型，即發(fā)生內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（endothelial-mesenchymal transition，EndMT）。EndMT 可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成增多、降解減少，引起血管纖維化，促進(jìn)HPH 的形成。阻斷HPH 病理改變的多個(gè)環(huán)節(jié)，才能有效阻止或逆轉(zhuǎn)疾病的進(jìn)展，因此調(diào)節(jié)EndMT可能是一項(xiàng)新的治療方式。

隨著再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）具有免疫原性低和多向分化能力等優(yōu)勢(shì)，展示出良好的治療潛力。然而，有研究表明移植后的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）主要通過(guò)旁分泌起作用，其分泌的外泌體（exosomes，Exos）具有源細(xì)胞的生物學(xué)活性且易于存儲(chǔ)［4］，成為無(wú)細(xì)胞療法的研究熱點(diǎn)。Exos 是由MSCs 分泌的直徑為30～200 nm 的具有雙層脂質(zhì)膜包裹的囊泡，可攜帶源細(xì)胞的蛋白質(zhì)、DNA 和RNA 等而進(jìn)行物質(zhì)交換和信息傳遞［5］。hUCMSC-Exos 在組織修復(fù)、抗炎和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［6］。

有研究報(bào)道，經(jīng)低氧預(yù)處理后hUCMSCs 活力增強(qiáng)，促進(jìn)其Exos 的釋放［7］；且低氧預(yù)處理MSCs 釋放的Exos 比常氧Exos 更能減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)［8］。目前，低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos 對(duì)HPH 肺血管EndMT的作用尚不清楚。因此，本研究旨在探討低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos對(duì)HPH肺血管EndMT的影響。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞

人臍帶組織均來(lái)源于青海大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科健康產(chǎn)婦的新生兒，經(jīng)產(chǎn)婦和家屬簽訂知情同意書(shū)后采集。本課題已通過(guò)青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（No. Y2022-99）。4～5 周齡SPF 級(jí)雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠24 只，體質(zhì)量125～150 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（合格證號(hào)為No.110011230104604254）。人肺小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（human pulmonary arteriole endothelial cells，HPAECs）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

2 主要試劑和儀器

DMEM/F12 培養(yǎng)液和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；ECM培養(yǎng)液和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑（endothelial cell growth supplement，ECGS）購(gòu)自ScienCell；Matrix-GelTM基質(zhì)膠購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒和VE-cadherin 抗體購(gòu)自Thermo Scientific；β-actin 抗體購(gòu)自Abclonal；CD31、vimentin 和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體購(gòu)自Abcam。JEM-1400FLASH 透射電鏡購(gòu)自JEOL；LSM880共聚焦顯微鏡和AxioVert. A1 倒置生物顯微鏡購(gòu)自Zeiss；Amersham Imager 600 超靈敏多功能成像儀購(gòu)自GE。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 hUCMSCs 的分離和培養(yǎng) 無(wú)菌狀態(tài)下收集長(zhǎng)約6～8 cm 的臍帶組織。在超凈臺(tái)中用無(wú)菌PBS溶液沖洗臍帶殘留血液4～5 次，并剔除臍動(dòng)脈、靜脈。分離華通膠并剪成3 mm×3 mm×3 mm 大小的塊狀，用組織塊貼壁法將組織塊貼在潔凈的培養(yǎng)皿上，37 ℃培養(yǎng)箱中靜置30 min 后加入含20% FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)液。每5 d 更換1 次培養(yǎng)液，待組織塊周?chē)莱黾?xì)胞且融合度達(dá)90%時(shí)，用0.125%胰蛋白酶消化成單個(gè)細(xì)胞并加入DMEM/F12 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中，取第2～6代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2 hUCMSCs 免疫表型及分化能力的鑒定 將第2 代hUCMSCs 用0.125%胰蛋白酶消化離心后加入CD34、CD45、CD29、CD90 和CD44 抗體孵育，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)以上表面標(biāo)志物的表達(dá)。參考文獻(xiàn)方法［7］，成脂成骨誘導(dǎo)分化液培養(yǎng)21 d后用油紅O和茜素紅S染液檢測(cè)hUCMSCs成脂和成骨分化能力。

3.3 hUCMSC-Exos 的提取、鑒定與共培養(yǎng) 待hUCMSCs 融合度達(dá)到80%時(shí)更換為無(wú)血清DMEM/F12 培養(yǎng)液，置于CO2培養(yǎng)箱（5% CO2+21% O2+74% N2）或三氣培養(yǎng)箱（5% CO2+1% O2+94% N2）培養(yǎng)48 h后，收集常氧或低氧培養(yǎng)液。參考文獻(xiàn)方法［9］用超濾法提取hUCMSC-Exos。取10 μL hUCMSC-Exos 滴加于2 mm 的銅網(wǎng)上，室溫孵育1 min 后用3%醋酸雙氧鈾孵染3 min，室溫晾干后在透射電鏡下觀察并拍照。采用納米顆粒跟蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）技術(shù)檢測(cè)hUCMSC-Exos 粒徑；采用Western blot法檢測(cè)hUCMSC-Exos表面標(biāo)志蛋白CD9、Alix 和Tsg101 表達(dá)水平。用PKH26 標(biāo)記hUCMSCExos，與HPAECs 在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)24 h，激光共聚焦顯微鏡下觀察HPAECs對(duì)hUCMSCExos的攝取情況并拍照。

3.4 動(dòng)物分組及模型的建立 用隨機(jī)數(shù)字法將SD大鼠隨機(jī)分為常氧（normaxia，N）組、低氧（hypoxia，H）組、低氧+常氧hUCMSC-Exos（H-NExo）組和低氧+低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos（H-HExo）組，每組6 只。將N組大鼠置于常氧環(huán)境（21% O2），后3組大鼠置于模擬海拔5 000 m 的低壓氧艙（10% O2），每組大鼠均可自由進(jìn)食水。后3組大鼠在低氧第3、5、7、10和14天時(shí)經(jīng)尾靜脈分別注射200 μg 常氧hUCMSC-Exos、低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos 或等體積PBS。21 d 后檢測(cè)各組大鼠相關(guān)指標(biāo)的變化。

3.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

3.5.1 右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure，RVSP）檢測(cè) 各組大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后仰臥位固定，參考文獻(xiàn)方法［10］分離大鼠右側(cè)頸外靜脈，將PE-50 導(dǎo)管經(jīng)右側(cè)頸外靜脈緩慢插入大鼠右心室后得到穩(wěn)定的波形，記錄RVSP。

3.5.2 右心室肥厚指數(shù)（right ventricular hypertrophy index，RVHI）檢測(cè)與肺動(dòng)脈分離 大鼠頸椎脫臼后剪開(kāi)胸腔取出心肺組織，分離心臟去除左右心耳，沿室間隔剪下右心室，吸干水分后分別稱(chēng)量右心室（right ventricle，RV）及左心室加室間隔（left ventricular plus septum，LV+S）的重量（weight，W），計(jì)算RVHI，RVHI=WRV/WLV+S。將新鮮肺組織取出用PBS沖洗殘留血液，固定在泡沫板上并浸泡在預(yù)冷的PBS中，沿肺動(dòng)脈主干向下逐級(jí)分離肺動(dòng)脈。PBS洗凈肺動(dòng)脈殘留血液后保存在-80 ℃用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.5.3 肺組織病理學(xué)檢測(cè) 取各組大鼠右下肺葉固定于4%多聚甲醛中，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后制成4 μm 切片。切片經(jīng)HE 染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察肺血管病理改變，用Image-Pro Plus 6.0 軟件計(jì)算分析血管壁面積占血管總面積的百分率（percentage of vascular wall area，WA%）和血管壁厚度占血管外徑的百分率（percentage of vascular wall thickness，WT%）。

3.6 HPAECs 培養(yǎng)及分組 HPAECs 用含5% FBS和1% ECGS 的ECM 培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取第2～4 代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。HPAECs長(zhǎng)至60%時(shí)，用無(wú)血清ECM 培養(yǎng)液饑餓處理12 h 后隨機(jī)分為常氧對(duì)照（N-Con）組、低氧模型（H-Con）組、低氧+常氧hUCMSC-Exos（Hy-NExo）組和低氧+低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos（Hy-HExo）組。N-Con 組細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱（5% CO2+21% O2+74% N2），其余3組細(xì)胞置于三氣培養(yǎng)箱（5% CO2+1% O2+94% N2）并加100 mg/L（此濃度源于之前的研究［12］）常氧hUCMSCExos、低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos 或等體積PBS，培養(yǎng)48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)［11］。

3.7 細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

3.7.1 免疫熒光染色 用0.125%胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HPAECs，接種2×104個(gè)細(xì)胞于共聚焦培養(yǎng)皿中。將各組干預(yù)后的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定20 min，0.1% Triton X-100 室 溫 通 透10 min 后 加 入CD31、VE-cadherin和α-SMA抗體（1：100）4 ℃孵育過(guò)夜。次日PBS 洗滌后加入Cy3 標(biāo)記的山羊抗兔及FITC 標(biāo)記的山羊抗小鼠熒光Ⅱ抗（1∶300）室溫避光孵育1 h。PBS 洗滌后加入DAPI 室溫避光染細(xì)胞核10 min。在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，并用ImageJ軟件計(jì)算熒光強(qiáng)度。

3.7.2 Transwell 實(shí)驗(yàn) 將各組HPAECs 消化離心后用無(wú)血清ECM培養(yǎng)液重懸，將1×104個(gè)細(xì)胞接種于Transwell 上室，下室中加入600 μL ECM 培養(yǎng)液。培養(yǎng)12 h后棄去上室和下室培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛室溫固定20 min。用1%結(jié)晶紫室溫染色20 min，PBS 洗滌后在顯微鏡下觀察并拍照，用ImageJ 軟件分析細(xì)胞遷移數(shù)。

3.7.3 小管形成實(shí)驗(yàn) 基質(zhì)膠用ECM 培養(yǎng)液按1∶3 稀釋后取100 μL 加入48 孔板將各組HPAECs 消化離心后用無(wú)血清ECM培養(yǎng)液重懸，按每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于鋪有基質(zhì)膠的48 孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育6 h。顯微鏡下拍照，用ImageJ 軟件分析小管總分支長(zhǎng)度。

3.8 Western blot 實(shí)驗(yàn) 將各組大鼠肺動(dòng)脈和消化離心后的HPAECs 中加入RIPA 裂解液，研磨后于冰上靜置15 min，4 ℃、13 200×g離心10 min 后取上清。BCA 蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度，加入5× Loading Buffer 并調(diào)整為等濃度等體積的蛋白樣品后99 ℃煮10 min；將蛋白樣品在10% SDS-PAGE 凝膠上電泳；再將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入CD31、VE-cadherin、α-SMA 和vimentin抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜；TBST 洗滌后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗（1∶5 000）孵育1 h；用ECL超敏發(fā)光液在超靈敏多功能成像儀下對(duì)蛋白條帶顯影；用ImageJ軟件分析條帶灰度值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 hUCMSCs形態(tài)及鑒定

組織塊貼壁法培養(yǎng)臍帶組織14～21 d后，鏡下觀察到組織塊周?chē)写罅砍衫w維細(xì)胞樣細(xì)胞爬出（圖1A）；經(jīng)傳代后細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，旋渦狀生長(zhǎng)（圖1B）。茜素紅S和油紅O染色結(jié)果顯示，成骨和成脂誘導(dǎo)分化21 d后出現(xiàn)鈣化和脂肪滴（圖1C）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，hUCMSCs 高表達(dá)CD29、CD44 和CD90，不表達(dá)CD34和CD45（圖1D）。

Figure 1. Morphology and characterization of hUCMSCs. A： spindle-shaped of cells growing from the tissue mass after 21 d of culture（scale bar=100 μm）； B： representative image showing the fibroblast-like morphology of cultured hUCMSCs （scale bar=100 μm）； C： differentiation potential of hUCMSCs observed by alizarin red S and oil red O staining （white arrows indicate the calcium mineralization，while red arrows indicate the fat drops； scale bar=100 μm）； D： surface markers of hUCMSCs analyazed by flow cytometry （positive for CD29，CD44 and CD90，but negative for CD34 and CD45）.圖1 hUCMSCs形態(tài)及鑒定

2 hUCMSC-Exos形態(tài)及鑒定

透射電鏡觀察到hUCMSC-Exos 呈杯狀、圓形囊泡狀，外周可見(jiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)，中央含低密度成分（圖2A）。NTA 結(jié)果顯示，hUCMSC-Exos 直徑在30～200 nm 之間（圖2B）。Western blot 結(jié)果顯示，hUCMSCExos 表達(dá)CD9、Alix 和Tsg101，而hUCMSCs 不表達(dá)以上蛋白（圖2C）。

Figure 2. Morphology and characterization of hUCMSC-Exos. A： morphology of hUCMSC-Exos was assessed by transmission electron microscopy （scale bar=100 nm）； B： particle size of hUCMSC-Exos was assessed by nanoparticle tracking analysis； C： the expression of CD9，Tsg101 and Alix was detected by Western blot.圖2 hUCMSC-Exos形態(tài)及鑒定

3 HPAECs攝取hUCMSC-Exos情況

經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察hUCMSC-Exos 在HPAECs 中的歸巢現(xiàn)象，結(jié)果顯示PKH26 標(biāo)記的hUCMSC-Exos可以被HPAECs成功攝?。▓D3）。

Figure 3. Uptake of hUCMSC-Exos by HPAECs was observed by immunofluorescence staining （scale bar=20 μm）.圖3 HPAECs攝取hUCMSC-Exos

4 低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos 對(duì)大鼠RVSP 和RVHI的影響

與N 組相比，H 組大鼠RVSP 和RVHI 均顯著升高（P＜0.01）；與H 組相比，H-NExo 組和H-HExo 組大鼠RVSP 均下降（P＜0.01），且H-HExo 組比H-NExo組大鼠RVSP 下降更顯著（P＜0.01），常氧或低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos 干預(yù)后大鼠RVHI 顯著降低（P＜0.05），但H-HExo 組與H-NExo 組間相比RVHI 無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)圖4。

Figure 4. Effects of hypoxia-preconditioned hUCMSC-Exos （HExo）on right ventricular systolic pressure （RVSP； A） and right ventricular hypertrophy index （RVHI； B） of the rats. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs normoxia （N） group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs hypoxia （H） group； △△P＜0.01 vs hypoxia+normoxic hUCMSC-Exos （H-NExo） group.圖4 低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos 對(duì)大鼠RVSP 和RVHI 的影響

5 低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos 對(duì)大鼠肺血管重構(gòu)的影響

HE染色結(jié)果顯示，與N組相比，H組大鼠肺血管管壁顯著增厚，WA%和WT%顯著升高（P＜0.01）；與H 組相比，加入常氧或低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos 后WA%和WT%顯著降低（P＜0.01）；與H-NExo 組相比，H-HExo 組WA%和WT%顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖5。

Figure 5. Effect of hypoxia-preconditioned hUCMSCs-Exos （HExo） on pulmonary vascular remodeling in rats. A： representative histopathological images of rat pulmonary vessels with HE staining （the upper scale bar=40 μm； the lower scale bar=20 μm）；B： comparsion of percentage of vascular wall area （WA%） in each group； C： comparsion of percentage of vascular wall thickness （WT%） in each group. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs normoxia （N） group； ##P＜0.01 vs hypoxia （H） group； △△P＜0.01 vs hypoxia+normoxic hUCMSC-Exos （H-NExo） group.圖5 低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos對(duì)大鼠肺血管重構(gòu)的影響

6 低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos 對(duì)大鼠肺血管End-MT蛋白水平的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與N 組相比，H 組α-SMA和vimentin 表達(dá)水平顯著升高，CD31 和VE-cadherin表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）；與H 組相比，H-NExo 組EndMT 相關(guān)蛋白水平無(wú)顯著差異（P＞0.05）；與H-NExo 組相比，H-HExo 組CD31 和VEcadherin 表達(dá)水平顯著升高，α-SMA 和vimentin 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

Figure 6. Effects of hypoxia-preconditioned hUCMSCs-Exos （HExo） on the protein expression levels of CD31，VE-cadherin，α-smooth muscle actin （α-SMA） and vimentin in rat pulmonary vessels were detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs normoxia （N） group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs hypoxia （H） group； △P＜0.05 vs hypoxia+normoxic hUCMSCExos （H-NExo） group.圖6 低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos對(duì)大鼠肺血管中CD31、VE-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表達(dá)水平的影響

7 HPAECs形態(tài)及鑒定

倒置顯微鏡下觀察，HPAECs呈鵝卵石樣生長(zhǎng)，分布規(guī)則，見(jiàn)圖7A。免疫熒光染色結(jié)果顯示，HPAECs高表達(dá)CD31 和VE-cadherin，幾乎不表達(dá)α-SMA，見(jiàn)圖7B。

8 低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos 對(duì)HPAECs 遷移的影響

Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與N-Con 組相比，HCon 組HPAECs 發(fā)生遷移，且遷移數(shù)顯著增多（P＜0.01）；常氧或低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos可顯著抑制HPAECs 遷移（P＜0.01）；與Hy-NExo 組相比，Hy-HExo組細(xì)胞遷移數(shù)顯著減少（P＜0.05），見(jiàn)圖8。

Figure 8. Effect of hypoxia-preconditioned hUCMSC-Exos （HExo） on migration ability of human pulmonary arteriole endothelial cells（HPAECs） was detected by Transwell assay （crystal violet staining，scale bar=50 μm）. Red arrows indicate migratory cells. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs normoxic control（N-Con） group； ##P＜0.01 vs hypoxic control（H-Con） group； △P＜0.05 vs hypoxia+normoxic hUCMSC-Exos （Hy-NExo） group.圖8 低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos對(duì)HPAECs遷移能力的影響

9 低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos 對(duì)HPAECs 小管形成的影響

小管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與N-Con 組相比，HCon 組HPAECs 小管形成能力增強(qiáng)，總分支長(zhǎng)度顯著增加（P＜0.01）；與H-Con 組相比，加入常氧或低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos 后HPAECs 小管形成減少，總分支長(zhǎng)度顯著縮短（P＜0.01），且Hy-HExo 組比Hy-NExo 組小管總分支長(zhǎng)度顯著縮短（P＜0.05），見(jiàn)圖9。

Figure 9. Effect of hypoxia-preconditioned hUCMSC-Exos（HExo） on tube formation of human pulmonary arteriole endothelial cells（HPAECs） was observed by Matrigel tube formation assay （scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs normoxic control （N-Con） group； ##P＜0.01 vs hypoxic control （H-Con） group； △P＜0.05 vs hypoxia+normoxic hUCMSC-Exos （Hy-NExo） group.圖9 低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos對(duì)HPAECs小管形成的影響

10 低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos對(duì)HPAECs中End-MT的影響

免疫熒光雙染（圖10）和Western blot（圖11）結(jié)果顯示，與N-Con 組相比，H-Con 組內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31熒光強(qiáng)度顯著減弱，間充質(zhì)標(biāo)志物α-SMA 熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（P＜0.01），內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31 和VE-cadherin 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），間充質(zhì)標(biāo)志物α-SMA 和vimentin 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與H-Con 組相比，Hy-NExo 組CD31 熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，α-SMA熒光強(qiáng)度顯著減弱（P＜0.01），CD31 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），VE-cadherin、α-SMA 和vimentin 蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著差異（P＞0.05）；與Hy-NExo 組相比，Hy-HExo 組CD31 熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（P＜0.05），α-SMA 熒光強(qiáng)度顯著減弱（P＜0.01），α-SMA（P＜0.05）和vimentin（P＜0.01）蛋白表達(dá)水平顯著降低，CD31和VE-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。

Figure 10. Effect of hypoxia-preconditioned hUCMSC-Exos （HExo） on endothelial-mesenchymal transition in human pulmonary arteriole endothelial cells （HPAECs）. The expression of CD31 and α-smooth muscle actin （α-SMA） in HPAECs was observed by double immunofluorescence staining （green： CD31； red： α-SMA； blue： DAPI； scale bar=50 μm； zoom in：the Merged local magnification，scale bar=20 μm）. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs normoxic control （N-Con） group； ##P＜0.01 vs hypoxic control （H-Con） group； △P＜0.05，△△P＜0.01 vs hypoxia+normoxic hUCMSC-Exos （Hy-NExo） group.圖10 低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos對(duì)HPAECs內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

Figure 11. Effects of hypoxia-preconditioned hUCMSC-Exos （HExo） on the protein expression levels of CD31，VE-cadherin，α-smooth muscle actin （α-SMA） and vimentin in human pulmonary arteriole endothelial cells （HPAECs） were detected by Western blot. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs normoxic control （N-Con） group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs hypoxic control （H-Con）group； △P＜0.05，△△P＜0.01 vs hypoxia+normoxic hUCMSC-Exos （Hy-NExo） group.圖11 低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos對(duì)HPAECs中CD31、VE-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表達(dá)水平的影響

討 論

HPH 是一種以持續(xù)的肺血管阻力升高和肺血管重構(gòu)為特征的進(jìn)行性疾?。?3］。脈血管阻力升高是肺動(dòng)脈高壓的特征，肺血管重構(gòu)是肺動(dòng)脈高壓的病理標(biāo)志［14］。盡管越來(lái)越多的證據(jù)表明藥物治療可以提高HPH 患者的生存率，但仍無(wú)法治愈。因此，迫切需要真正逆轉(zhuǎn)HPH血管重塑的新策略。

hUCMSCs 由于具有易獲取、較快的自我更新能力和較高的增殖能力等優(yōu)點(diǎn)［15］，被認(rèn)為是再生醫(yī)學(xué)中最具潛力的種子細(xì)胞之一。研究表明，移植后的MSCs 存在存活率及分化歸巢率低等問(wèn)題，而其可能是通過(guò)旁分泌Exos 來(lái)發(fā)揮作用［16］。Exos 是由MSCs通過(guò)胞吐作用釋放的細(xì)胞外囊泡，具有與源細(xì)胞相似的功能，是細(xì)胞間通信、代謝和免疫調(diào)節(jié)的重要載體［17］。氧濃度在MSCs的自我更新、分化和旁分泌功能中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)相對(duì)氧含量為21%，而大多數(shù)MSCs 存在于體內(nèi)氧含量2%～8%的環(huán)境中［18］，且低氧預(yù)處理MSCs來(lái)源的Exos更能減少炎癥因子的表達(dá)，抑制炎癥免疫反應(yīng)［19］。因此，低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos 可能是治療HPH 的更好選擇。

本研究中，首先成功分離出原代hUCMSCs，用流式細(xì)胞術(shù)鑒定hUCMSCs 免疫表型，通過(guò)成脂成骨誘導(dǎo)分化驗(yàn)證hUCMSCs 具有多向分化能力。通過(guò)超濾法成功提取hUCMSC-Exos，分別從動(dòng)物和細(xì)胞水平驗(yàn)證低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos對(duì)低氧誘導(dǎo)的肺血管和HPAECs 中EndMT 的影響。將大鼠于模擬海拔5 000 m的低壓氧艙（10% O2）中飼養(yǎng)21 d，RVSP顯著升高，右心室肥厚，肺動(dòng)脈內(nèi)側(cè)壁增厚及管腔狹窄閉塞，提示HPH 大鼠模型建立成功；經(jīng)低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos 干預(yù)后可顯著降低大鼠RVSP，緩解右心室肥厚程度，逆轉(zhuǎn)肺血管重塑。以上結(jié)果提示低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos 可緩解HPH，抑制肺血管重塑。

在HPH 發(fā)展過(guò)程中，HPAECs 發(fā)生EndMT 是肺血管重塑中關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)［20］。低氧可誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子表達(dá)激活內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)EndMT 過(guò)程將其轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)樣細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙［21］。內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndMT 時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物如CD31 和VE-cadherin 丟失，間充質(zhì)樣細(xì)胞標(biāo)志物如α-SMA 和vimentin 表達(dá)增加，導(dǎo)致細(xì)胞連接松散向內(nèi)膜下遷移，獲得增殖和遷移的能力［22］。動(dòng)物水平研究結(jié)果顯示，HPH 大鼠模型中肺血管CD31 和VE-cadherin表達(dá)下降，α-SMA 和vimentin 表達(dá)增多，提示肺血管發(fā)生EndMT。在細(xì)胞水平上驗(yàn)證低氧（1% O2）可誘導(dǎo)HPAECs發(fā)生EndMT，同時(shí)HPAECs遷移和小管形成增加。低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos干預(yù)后可部分上調(diào)肺血管和HPAECs中CD31和VE-cadherin 的表達(dá)，下調(diào)α-SMA 和vimentin 的表達(dá)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndMT，進(jìn)而抑制肺血管重塑。

本研究結(jié)果表明，低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos 可抑制肺血管發(fā)生EndMT，但其作用機(jī)制尚未證實(shí)，其可能與miRNA 調(diào)控有關(guān)。有研究表明低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos 富集miR-126，可識(shí)別并結(jié)合HIF-1α啟動(dòng)子序列中的缺氧反應(yīng)元件，調(diào)控HIF-1α 的表達(dá)［23］。也有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-146a-5p 在低氧預(yù)處理的MSCs的細(xì)胞外囊泡中含量相對(duì)豐富［24］。

綜上所述，低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos 可以通過(guò)抑制EndMT過(guò)程，保持肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，進(jìn)而減輕肺血管重塑。因此，低氧預(yù)處理hUCMSC-Exos可能是一種潛在治療HPH 的方式，然而其作用機(jī)制還需進(jìn)一步探索。