博來霉素誘導的肺纖維化大鼠肺組織病理和超微結(jié)構(gòu)變化*

廖一羲，王 搏，邱志廣，李明艷，張彩麗，田燕歌，

（1呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南省中醫(yī)藥防治呼吸病重點實驗室，河南 鄭州 450046；2中醫(yī)藥科學院，河南 鄭州 450046）

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是由多種因素（包括遺傳、感染和環(huán)境暴露等）引起的一種間質(zhì)性肺疾病，其主要病理表現(xiàn)為肺泡結(jié)構(gòu)破壞、肺成纖維細胞增殖和細胞外基質(zhì)沉積，導致廣泛瘢痕形成，臨床表現(xiàn)為進行性呼吸困難和肺功能進行性惡化［1-3］。隨著全球老齡化的進展，PF發(fā)病率呈逐年上升趨勢，預后不良［4-5］。目前缺乏有效的治療手段，符合臨床病理特征的動物模型是探討疾病發(fā)病機理、尋求有效療法的關(guān)鍵。一次性氣管內(nèi)滴注博來霉素（bleomycin，BLM）是目前研究中最為常用的PF 模型制備方法［6］。然而，目前對于此模型成模特點評價仍較為片面，且評價時間多為造模后28 d。因此，本研究基于此造模方法，于模型建立42 d通過檢測肺功能、肺部CT、肺組織病理、肺組織超微結(jié)構(gòu)變化等指標，較為全面地評價模型的成模特點，為基礎研究應用提供參考。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

清潔級6～8 周齡雄性SD 大 鼠24 只，體 質(zhì)量（200～240）g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，合格證號為SCYK（京）2019-0015，動物質(zhì)量合格證號為110324220102348616，飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學動物中心，已通過倫理審核，倫理編號為DWLL202208003。

2 主要試劑

鹽酸博來霉素（批號：610740）購自日本化藥株式會社；蘇木素染液（批號：20220516）、伊紅染液（批號：ZH192715）、Masson 三色染色試劑盒（批號：20180708）和Gluta 固定液（批號：20221026）購自索萊寶生物科技有限公司；異氟烷（批號：031217015，河北金達福藥業(yè)有限公司）；SPI-PON 812 Epoxy Resin Monomer（批號：1260804）和SPI Chem Accelerator，DY064（批號：1260810）購自SPI。

3 主要儀器

高分辨離活一體微型CT NEMO?Micro CT（平生醫(yī)療科技有限公司）；RM2145 型自動切片機（Leica）；TEM1400 透射電鏡（JEOL）；MCR 302e 型流變儀（Anton Paar）；EMTP 型全自動樹脂處理機（Leica）；CK40 倒置相差顯微鏡（Olympus）；Pannoramic MIDI型掃描儀（3D HISTECH）；FinePointe?series 動物肺功能檢測系統(tǒng)（BUXCO）。

4 實驗方法

4.1 PF 模型建立 24 只動物按照隨機數(shù)字表法隨機分為2 組，包括對照（control）組和模型（model）組，每組12 只。采用1%戊巴比妥鈉50 mg/kg 進行大鼠麻醉，使麻醉后的大鼠平躺在動物操作臺上，在咽喉部冷光源照射下，使用氣管導管經(jīng)聲門裂進行氣管插管，模型組滴入3 mg/kg BLM 后，即令大鼠懸垂并旋轉(zhuǎn)，以便藥物在肺內(nèi)均勻分布，對照組注入等量的生理鹽水。造模完成后觀察大鼠狀態(tài)，待大鼠完全清醒后歸籠。密切觀察大鼠生存狀態(tài)，記錄大鼠死亡時點，進行生存曲線繪制。造模方案及試劑劑量均參照本實驗室有關(guān)前期研究［7-8］，造模后42 d 進行模型評價。

4.2 肺部CT 大鼠造模第42 天，采用異氟烷吸入麻醉法，氣體流量調(diào)節(jié)為500～700 mL/min，誘導濃度調(diào)節(jié)為3%～4%，待麻醉劑充滿誘導盒，約1 min 后，將動物放入誘導盒，隨即關(guān)閉，等待動物完全麻醉。此時維持濃度調(diào)節(jié)為2%～2.5%，從誘導盒取出動物，使其俯臥于高分辨離活一體微型CT 的專用板上，持續(xù)吸入麻醉，調(diào)節(jié)各項參數(shù)后進行肺部CT 掃描。掃描結(jié)束后采用Recon 軟件的迭代算法進行肺部CT 重構(gòu)。將重構(gòu)后的CT 圖像導入Mimics Research 21.0 進行圖片采集。參數(shù)：管電壓60 KV，管電流0.15 mA。

4.3 肺功能 采用1%戊巴比妥鈉按照50 mg/kg 的劑量麻醉后，大鼠行氣管插管后，用FinePointe?series 動物肺功能檢測系統(tǒng)檢測大鼠的用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）及動態(tài)肺順應性（dynamic lung compliance，Cdyn）等指標［9］。

4.4 肺組織硬度測試 使用流變儀 MCR 302e測量小鼠肺組織的儲能模量（G'）和損耗模量（G''），進而獲得其楊氏模量（Young's modulus）［10］。相應的楊氏模量使用以下公式計算：E = 2G（1 + υ）；G = G'2 +G''2。公式中：E：楊氏模量，υ：材料的泊松比（肺組織為0.4），G：剪切模量，G'：儲能模量，G''：損耗模量。

4.5 肺組織病理檢測 肺組織用甲醛固定，梯度脫水，石蠟包埋。

4.5.1 HE 染色 石蠟切片逐級脫蠟至水；蘇木素染色4 min，1%鹽酸乙醇分化，流水沖洗；伊紅染液中染色4 min，流水沖洗；切片依次逐級放入濃度更高的乙醇及二甲苯中透明，晾干后，中性樹膠封片。采用Pannoramic MIDI 掃描儀進行掃描，用slide-viewer軟件進行圖片采集，采用Szapiel 評分系統(tǒng)［11］進行肺泡炎評分，見表1。

表1 Szapiel評分系統(tǒng)Table 1. Szapiel score system

4.5.2 Masson染色 與HE切片的脫蠟方法相同；切片放入重鉻酸鉀浸泡過夜；放入蘇木素染液浸染，流水沖洗后，1%鹽酸乙醇分化；切片放入麗春紅酸性品紅浸染，流水沖洗；分別于磷鉬酸水溶液浸染后于苯胺藍染液染；1%冰醋酸分化后，無水乙醇脫水。切片透明、封片以及圖片采集與HE 染色方法相同。采用Ashcroft 半定量評分系統(tǒng)［12］進行肺部纖維化評分，見表2。

4.6 透射電鏡觀察 肺組織切成1 mm×1 mm×1 mm 后于2.5%戊二醛電鏡固定液中固定4 h，PBS 洗后以1%鋨酸固定液固定1.5 h，梯度乙醇逐級脫水，丙酮脫水，812 環(huán)氧樹脂包埋過夜，聚合后行超薄切片，飽和醋酸雙氧鈾水溶液染色10 min，檸檬酸鉛溶液染色8 min 后烘干。采用日本電子TEM1400 透射電鏡觀察以下超微結(jié)構(gòu)：膠原纖維；II 型肺泡上皮細胞（alveolar type II epithelial cells，AEC II）中的板層小體（lamellar bodies，LBs）、線粒體（mitochondrion，Mi）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）；巨噬細胞；呼吸膜形態(tài)變化（并測量呼吸膜厚度）。該實驗委托河南中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥科學院電鏡中心完成。

5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，采用GraphPad Prism 8 軟件進行繪圖。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 生存曲線

模型組大鼠的生存曲線如圖1所示。結(jié)果顯示，造模第2天死亡1只，解剖見肺淤血較嚴重，可能為造模不耐受死亡；第14～28 天死亡2 只，解剖均見雙肺肺門部有大片白色斑片出現(xiàn)，可能為肺部病變較重死亡；至42 d，模型組有9只存活，存活率為75%。

2 肺部CT

對照組雙肺支氣管走行光滑規(guī)則、血管分布均勻，肺紋理清晰；模型組以肺門部病變較嚴重，可見牽張性支氣管擴張/細支氣管擴張，雙肺可見蜂窩影及網(wǎng)狀密度增高影，部分可見肺不張現(xiàn)象，見圖2。

Figure 2. CT images of rat lungs in control group （A） and model group （B）. Atelectasis in the left lung with honeycomb and lattice shadows in the hilar region of both lungs （solid arrows）.圖2 大鼠肺CT圖像

3 大鼠肺功能及肺組織硬度變化

與對照組比較，模型組大鼠用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）和動態(tài)肺順應性（dynamic lung compliance，Cdyn）均顯著降低（P＜0.05），見圖3A；與對照組比較，模型組大鼠肺組織硬度顯著升高（P＜0.05），見圖3B。

4 大鼠肺外觀及肺組織病理

4.1 肺外觀 造模42 d，解剖可見對照組大鼠肺臟呈淡紅色，顏色均勻，質(zhì)地柔軟且均一；模型組大鼠肺顏色較暗淡，肺組織較腫脹，肺上可見散在暗紅色出血點及白色斑塊狀病變，顏色及質(zhì)地不均勻，質(zhì)地較對照組偏硬，見圖4A。

4.2 肺組織病理的變化 HE 染色分析可見，與對照組相比，模型組可見肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，炎癥反應細胞浸潤，肺泡壁增厚，纖維條索出現(xiàn)，見圖4A。病理評分顯示，模型組肺泡炎較為嚴重，與對照組相比具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖4B。Masson 染色分析可見，與對照組相比，模型組在在肺泡及細支氣管壁出現(xiàn)纖維增生，且肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺組織中可見大量膠原纖維成片狀生成，見圖4A。病理評分顯示，模型組纖維化較為嚴重，與對照組相比具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖4C。

5 超微結(jié)構(gòu)

5.1 膠原沉積情況 對照組大鼠肺組織膠原纖維沉積較少，在動脈中膜及內(nèi)皮下層可見少量膠原纖維；模型組大鼠肺組織中可見大片膠原纖維沉積，肺泡上皮細胞、內(nèi)皮細胞周圍可見大量膠原纖維，且排列紊亂，部分成束狀定向排列，纖維直徑較均一，見圖5。

5.2 AEC II 電鏡下對照組AEC II 結(jié)構(gòu)清晰，包膜完整，細胞未見腫脹，細胞表面可見較多排列整齊的微絨毛，細胞核居中，染色質(zhì)均勻；胞質(zhì)豐富，ER、LBs 等細胞器結(jié)構(gòu)未見明顯異常；Mi 膜清晰，嵴排列均勻，未見明顯腫脹。模型組可見細胞包膜破壞，胞內(nèi)基質(zhì)局部溶解，細胞分界不清，細胞表面的微絨毛減少且排列不齊；細胞核成不規(guī)則多邊形，較皺縮，核染色質(zhì)凝集粗塊狀，異染色質(zhì)較多；胞質(zhì)中細胞器結(jié)構(gòu)破壞；Mi 腫脹，嵴斷裂及空泡化。模型組Mi 顯著減少（P＜0.05）；ER 擴張，出現(xiàn)脫顆粒現(xiàn)象；LBs 數(shù)量顯著減少（P＜0.05），呈現(xiàn)空泡化。見圖6。

5.3 巨噬細胞 對照組巨噬細胞呈卵圓形，表面出現(xiàn)長度不一的扁平狀胞質(zhì)突起；細胞核大而圓，染色質(zhì)細密，異染色質(zhì)多集中于核周邊；細胞質(zhì)內(nèi)含有較多的溶酶體，初級溶酶體較多。模型組間質(zhì)巨噬細胞及肺泡腔內(nèi)巨噬細胞數(shù)量顯著增多，細胞體積較大，胞質(zhì)內(nèi)溶酶體豐富，次級溶酶體及殘體較多。與對照組相比，模型組大鼠肺間質(zhì)巨噬細胞數(shù)量顯著增多（P＜0.01）。見圖7。

Figure 7. Ultrastructure of macrophages. A： ultrastructure of macrophages in control and model groups （scale bar=10 μm for original electron microscopic images； scale bar=2 μm for detail electron microscopic image in control group； scale bar=5 μm for detailed electron microscopic image in model group）； B： macrophage counts. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs control group.圖7 巨噬細胞超微結(jié)構(gòu)

5.4 呼吸膜 對照組呼吸膜厚薄均勻、質(zhì)地平滑、層次清晰；模型組呼吸膜結(jié)構(gòu)破壞，可見斷裂現(xiàn)象，顯著增厚（P＜0.01），且厚度不均勻，部分呈凸起狀，以肺泡上皮基膜增厚與毛細血管基膜間隙增寬為主，見圖8。

Figure 8. Ultrastructure of respiratory membrane. A： ultrastructure of respiratory membrane in control and model groups （scale bar=1 μm）； B： analysis of respiratory membrane thickness in control and model groups. Mean±SD. n=9. **P＜0.01 vs control group.圖8 呼吸膜超微結(jié)構(gòu)

討 論

PF 是一種慢性、進行性的間質(zhì)性肺疾?。?3］。目前PF 的發(fā)病機制尚未完全明確，普遍認為是肺泡上皮細胞反復損傷及異常修復后，大量細胞因子及生長因子的釋放，導致膠原過度沉積等病理改變［14-15］?；颊叱霈F(xiàn)進行性肺功能下降、呼吸困難甚至呼吸衰竭死亡，嚴重危害患者的心理健康和生存質(zhì)量，給社會造成巨大的經(jīng)濟負擔［16-17］。

動物模型是研究肺纖維化病理變化及新藥研究的主要工具。BLM 誘導的肺纖維化模型以其良好的可重復性和易于誘導性，且能夠重現(xiàn)PF 的許多表征，成為目前使用廣泛的動物模型［18-20］。因此，基于文獻及前期研究，本研究選擇SD 大鼠，采用經(jīng)口咽部無創(chuàng)一次性氣管內(nèi)滴注BLM（3 mg/kg）的方法誘導PF 模型［8］，以造模后42 d 作為模型評價的時點，以評價模型的特點及穩(wěn)定性。

本組研究資料顯示，BLM 誘導42 d 大鼠出現(xiàn)肺組織中肺泡結(jié)構(gòu)破壞，纖維條索形成，肺功能下降。肺組織超微結(jié)構(gòu)顯示，肺泡上皮、內(nèi)皮細胞周圍大量膠原纖維沉積，AEC II 表面微絨毛減少，Mi 腫脹，ER擴張，LBs 空泡化。在PF 發(fā)生發(fā)展中，AEC II 一方面通過上皮間質(zhì)化獲得間充質(zhì)表型，分化為肌成纖維細胞產(chǎn)生大量細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），導致PF；另一方面AEC II 的上皮間質(zhì)化導致肺泡上皮的修復能力降低并加速PF 的發(fā)展［21］。Mi功能障礙在PF 中出現(xiàn)較早且是上皮細胞損傷的標志之一，可導致AEC II 對應激不耐受［22-23］。同時AEC II 通過表面活性劑的產(chǎn)生和分泌維持有效的氣體交換，表面活性劑儲存于LBs 中，發(fā)揮保持表面張力、維持肺泡正常空間結(jié)構(gòu)的作用［24］，故LBs 是鑒別AEC II 分泌功能是否正常的最直接方法［25］。因此，本研究顯示的PF 大鼠AEC II 周圍大量膠原沉積，可能與上皮間質(zhì)化有關(guān)；Mi作為細胞的能量中心，其數(shù)量減少及腫脹表明AEC II 的增殖及修復功能下降；LBs 減少及空泡化表明AEC II 對于表面活性劑的分泌功能降低，難以維持肺泡正常結(jié)構(gòu)而致其塌陷或不張，與本研究CT表征一致。

電鏡觀察到PF 大鼠肺泡巨噬細胞數(shù)量增多，聚集在肺泡腔中，表明機體仍處于炎癥狀態(tài)，肺損傷較嚴重，巨噬細胞募集以驅(qū)動組織修復。巨噬細胞分泌巨噬細胞集落刺激因子進行自我維持，并產(chǎn)生血小板衍生生長因子亞基A、精氨酸酶1、基質(zhì)金屬蛋白肽酶13 等，同時大量表達促纖維化趨化因子，募集纖維細胞，促進纖維化形成。在巨噬細胞組織修復過程中，產(chǎn)生白細胞介素4等，促進巨噬細胞向M2極化［26］。

呼吸膜由肺表面活性物質(zhì)的液體層、肺泡上皮細胞層、上皮基底膜、肺泡上皮與毛細血管膜之間的間隙、毛細血管基膜、毛細血管內(nèi)皮細胞層構(gòu)成，是維持正常氣體交換的主要結(jié)構(gòu)［27］，PF 大鼠呼吸膜層次不清，邊緣模糊，可能與肺泡上皮和內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)破壞有關(guān)，呼吸膜增厚導致有效氣體交換面積減少，因而出現(xiàn)肺功能下降。臨床上表現(xiàn)為肺彌散功能下降可能與此有關(guān)。

可見，BLM 導致AEC II結(jié)構(gòu)和功能受損，修復能力有限，合成和分泌的肺泡表面活性物質(zhì)減少，肺泡結(jié)構(gòu)塌陷。呼吸膜增厚，有效氣體交換面積減少，影響肺通氣功能，故出現(xiàn)肺功能下降。炎癥細胞浸潤，膠原纖維及細胞外基質(zhì)沉積，片狀纖維斑片出現(xiàn)，纖維條索形成，使肺組織硬度增加。

然而，PF大鼠CT影像表現(xiàn)與尋常型間質(zhì)性肺炎（usual interstitial pueumonia，UIP）患者在基底及胸膜下出現(xiàn)纖維化的CT 表現(xiàn)稍有出入，可能與氣管內(nèi)滴注的誘導方式具有一定關(guān)系，并且部分PF 大鼠可見肺不張現(xiàn)象，可能因大量纖維沉積導致肺實變出現(xiàn)，進而出現(xiàn)肺痿廢不用［28-31］。

總之，一次性氣管內(nèi)滴注3 mg/kg BLM 可成功誘導PF 模型。因BLM 的肺毒性導致的蜂窩樣改變是間質(zhì)性肺疾病的特征表現(xiàn)，亦出現(xiàn)特征性斑片狀實質(zhì)炎癥、反應性上皮增生以及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、ECM 沉積等表現(xiàn)，與特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmoanry fibrosis，IPF）的表現(xiàn)相似。因此，該模型可用于建立IPF模型［32］。然而，盡管該模型已被證實與臨床纖維化發(fā)生的許多細胞及分子機制具有一致性，但仍存在許多局限性。從纖維化分布來看，臨床UIP多以下肺近胸膜部為主［3］，而誘導的PF 模型纖維化區(qū)域多集中在支氣管周圍，以肺門部較為嚴重；從疾病進程來看，誘導的PF 模型在誘導的前7 d 為初始炎癥期，炎癥消退后的纖維化期才與臨床PF 表現(xiàn)相似［33］；從可逆性來看，臨床PF 為慢性、不可逆性疾病，而誘導的PF 模型通常具有自限性及可逆性［27］；另外，臨床PF 好發(fā)于中老年人群，衰老因素對疾病的影響較大，由于實驗時間及條件的限制，誘導老年動物PF 模型的研究較少［34］。因此，進一步研究將致力于構(gòu)建更為接近人類病理特征的PF動物模型。