結(jié)節(jié)病樣肉芽腫動(dòng)物模型的研究進(jìn)展*

韓悅殷，劉夢(mèng)遠(yuǎn)，代華平△，王 辰

（1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京 100730；2中日友好醫(yī)院呼吸中心呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，國(guó)家呼吸醫(yī)學(xué)中心，國(guó)家呼吸臨床研究中心，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院呼吸病學(xué)研究院，北京 100029）

結(jié)節(jié)?。╯arcoidosis）是以非干酪樣壞死性上皮樣肉芽腫為病理特征的系統(tǒng)性肉芽腫性疾病，以肺和胸內(nèi)淋巴結(jié)受累最為常見(jiàn)。肉芽腫病變分為中心區(qū)和周邊區(qū)兩部分，中心區(qū)由淋巴細(xì)胞包繞上皮樣細(xì)胞或多核巨細(xì)胞而成；周邊區(qū)由淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞組成［1］。結(jié)節(jié)病的病因和發(fā)病機(jī)制至今尚未被闡明，其臨床表現(xiàn)異質(zhì)性大，疾病進(jìn)程難以預(yù)測(cè)。目前認(rèn)為，結(jié)節(jié)病的發(fā)生是由于遺傳易感者受到特定的抗原刺激，巨噬細(xì)胞或樹(shù)突狀細(xì)胞識(shí)別、提呈抗原，引起免疫應(yīng)答過(guò)度激活，其中的免疫病理機(jī)制包括巨噬細(xì)胞功能改變、輔助性T 細(xì)胞1（T helper 1 cells，Th1）免疫反應(yīng)過(guò)度激活、Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）失衡等［2-3］。動(dòng)物模型作為研究人類疾病的重要手段，能模擬疾病的發(fā)生發(fā)展，有助于闡明疾病的病因和發(fā)病機(jī)制。本研究著重就結(jié)節(jié)病動(dòng)物模型的構(gòu)建背景、構(gòu)建方法及近年來(lái)相關(guān)研究概況作一介紹。

1 痤瘡丙酸桿菌（Propionibacterium acnes，P. acnes）

1.1P.acnes與結(jié)節(jié)病的臨床聯(lián)系P.acnes是寄生于皮膚與黏膜的一種革蘭陽(yáng)性無(wú)莢膜厭氧菌，可作為機(jī)會(huì)致病菌引起內(nèi)源性感染。日本學(xué)者Ishige等［4］對(duì)來(lái)自結(jié)節(jié)病、結(jié)核和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者的淋巴結(jié)進(jìn)行P.acnes16S核糖體RNA基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)病患者淋巴結(jié)中P.acnes豐度遠(yuǎn)高于非結(jié)節(jié)病患者，提示P.acnes可能與結(jié)節(jié)病的發(fā)生相關(guān)。此外，P.acnes在結(jié)節(jié)病患者的肺、心臟、眼和皮膚的檢出頻率均高于非結(jié)節(jié)病患者［5-7］。Negi 等［8］通過(guò)電鏡和P.acnes特異性抗原染色，發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)病患者肺組織肉芽腫內(nèi)含有缺乏細(xì)胞壁的Hamazaki-Wesenberg小體（HW 小體），且其P.acnes特異性抗原染色呈陽(yáng)性，由此推測(cè)HW 小體是由細(xì)胞壁缺陷的P.acnes所形成。關(guān)于P.acnes的研究多來(lái)自日本，而中國(guó)與歐洲的研究也有相關(guān)報(bào)道：與非結(jié)節(jié)病患者相比，結(jié)節(jié)病患者的淋巴結(jié)內(nèi)P.acnes豐度升高［9-10］；中國(guó)學(xué)者Zhou 等［11］分析65 例結(jié)節(jié)病和95 例非結(jié)節(jié)?。ńY(jié)核、肺癌和非特異性淋巴腺炎）患者淋巴結(jié)內(nèi)P.acnes16S 核糖體RNA 拷貝數(shù)，以50.5 拷貝/毫升作為臨界值進(jìn)行結(jié)節(jié)病的診斷，其敏感度為73.8%，特異度為92.6%，曲線下面積為84.3%。這些研究結(jié)果提示P.acnes可能與結(jié)節(jié)病的發(fā)生相關(guān)。

1.2P.acnes動(dòng)物模型及相關(guān)研究 McCaskill等［12］預(yù)先對(duì)C57BL/6 小鼠腹腔注射滅活P.acnes使其致敏，第14天予滅活P.acnes氣管注射，于第21天誘導(dǎo)出沿支氣管血管束分布的肉芽腫模型。肉芽腫以CD68+細(xì)胞為核心，周邊CD4+T 細(xì)胞和B 細(xì)胞散在分布。此模型被多個(gè)研究者所采用［13-15］，后由Jiang等［14］改進(jìn)，在預(yù)先腹腔注射使小鼠致敏后，分別于第14 和28 天氣管注射滅活P.acnes，成功誘導(dǎo)出肉芽腫后繼發(fā)纖維化的模型。研究結(jié)果顯示，在重復(fù)氣管注射滅活P.acnes后，小鼠肺部膠原沉積增加，I、III 型膠原蛋白表達(dá)升高，肺組織和支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 表達(dá)上調(diào)，提示肉芽腫進(jìn)一步發(fā)展形成纖維化可能是持續(xù)的P.acnes刺激所致。經(jīng)滅活P.acnes刺激的小鼠肉芽腫模型具備部分結(jié)節(jié)病的特征，如早期肺組織血管緊張素轉(zhuǎn)化酶水平升高［12］，干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等Th1 細(xì)胞因子上調(diào)［12，14］，BALF中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)增加［12，14］，以及外周血和BALF 中Th17/Treg 比值上調(diào)［15］等。此外，姜丁源［16］以同樣方法對(duì)白細(xì)胞介素17A（interleukin-17A，IL-17A）基因敲除小鼠進(jìn)行滅活P.acnes刺激，但并沒(méi)有觀察到肉芽腫，提示在肉芽腫的形成過(guò)程中，IL-17A 是必不可少的關(guān)鍵因子。這個(gè)發(fā)現(xiàn)在Song等［15］的研究中也得到驗(yàn)證，盡管兩者構(gòu)建模型的方法略有不同——后者預(yù)先腹腔注射使小鼠致敏后，分別于第14、28 和42 天氣管注射滅活P.acnes。Werner 等［17］從結(jié)節(jié)病患者淋巴結(jié)中分離出具有活性的P.acnes，隨后在小鼠中予以單次氣管注射，9 d 后誘導(dǎo)出肉芽腫模型。隨后，該團(tuán)隊(duì)分別敲除髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）和細(xì)胞色素b-245 β 鏈（cytochrome b-245 beta chain，CybB）基因，以同樣方法進(jìn)行P.acnes刺激，發(fā)現(xiàn)在兩種基因敲除小鼠肺中均誘導(dǎo)出比野生型（wild-type，WT）小鼠更嚴(yán)重的肉芽腫炎癥。與WT小鼠相比，MyD88基因敲除小鼠肺組織C-X-C 基序趨化因子配體1（C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1）、CXCL2 和IL-1α 表達(dá)減少，CybB基因敲除小鼠肉芽腫內(nèi)巨噬細(xì)胞中有更多的P.acnes殘留，提示肉芽腫的發(fā)生可能是MyD88通路介導(dǎo)的促炎信號(hào)通路缺陷，或CybB 通路產(chǎn)生活性氧減少而造成細(xì)菌清除能力受損所致。

此外，部分研究者采用滅活P.acnes皮下注射致敏，再予靜脈注射滅活P.acnes激發(fā)免疫應(yīng)答的方法制作肉芽腫模型。Ichiyasu 等［18］預(yù)先以滅活P.acnes加入弗氏不完全佐劑（incomplete Freund's adjuvant，IFA）進(jìn)行皮下注射，再經(jīng)靜脈注射滅活P.acnes，在家兔中成功誘導(dǎo)出以上皮樣巨噬細(xì)胞為中心的肺部肉芽腫模型。Kishi 等［19］以相同的方式制作小鼠模型，但結(jié)果顯示肉芽腫病變多數(shù)在肝臟出現(xiàn)，而肺部極少，提示相對(duì)于小鼠而言，家兔對(duì)滅活P.acnes經(jīng)靜脈途徑誘導(dǎo)的肺部免疫應(yīng)答可能更為強(qiáng)烈［20］。同時(shí)，他們預(yù)先將經(jīng)滅活P.acnes體外誘導(dǎo)成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞與滅活P.acnes混合后進(jìn)行皮下注射，再將上述混合物靜脈注射入小鼠體內(nèi)，結(jié)果表明相對(duì)于直接注射滅活P.acnes，此方法誘導(dǎo)的肺部肉芽腫數(shù)量增多、直徑增大，且出現(xiàn)多核巨細(xì)胞，表明樹(shù)突狀細(xì)胞是啟動(dòng)肉芽腫細(xì)胞免疫的關(guān)鍵免疫細(xì)胞。

2 分枝桿菌

2.1 分枝桿菌與結(jié)節(jié)病的臨床聯(lián)系 Esteves 等［21］采用薈萃分析發(fā)現(xiàn)分枝桿菌［包含結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）和非結(jié)核分枝桿菌］和P.acnes都與結(jié)節(jié)病患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，比值比分別為6.8 和18.8，提示分枝桿菌也可能是結(jié)節(jié)病的潛在病原之一。曾有研究者在結(jié)節(jié)病患者的肺和淋巴結(jié)中檢測(cè)到分枝桿菌DNA［22-23］。分枝桿菌特異性抗原，如超氧化物歧化酶A（superoxide dismutase A，sodA）、6 kD 早期分泌性抗原靶蛋白（early secreted antigenic target 6-kD protein，ESAT-6）、過(guò)氧化氫酶-過(guò)氧化物酶（catalase-peroxidase，KatG）等，可以被結(jié)節(jié)病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）和BALF 中的T 細(xì)胞識(shí)別并引起Th1型免疫反應(yīng)［24-25］。Chen等［25］發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于已接受治療或處于非活動(dòng)期的結(jié)節(jié)病患者，未經(jīng)治療并且處于活動(dòng)期的患者BALF 中的T 細(xì)胞經(jīng)分枝桿菌抗原刺激誘發(fā)的Th1 型免疫反應(yīng)更加劇烈，提示這些對(duì)分枝桿菌敏感的T 細(xì)胞可能與疾病進(jìn)展相關(guān)。Drake 等［26］進(jìn)行了一項(xiàng)隨機(jī)雙盲安慰劑對(duì)照的多中心臨床試驗(yàn)（CLEAR試驗(yàn)）以評(píng)估抗結(jié)核藥物對(duì)結(jié)節(jié)病的療效。該研究招募了97名患者，其中49名患者接受CLEAR 方案［前8 周左氧氟沙星500 mg/d，乙胺丁醇1 200 mg/d，阿奇霉素250 mg/d 和利福平600 mg/d（或利福丁300 mg/d），后8 周根據(jù)個(gè)人耐受度服用上述4 種藥物中的2 種］，48 名患者接受安慰劑。結(jié)果顯示，抗結(jié)核藥物治療除了減輕PBMCs 受ESAT-6 刺激而誘發(fā)的免疫反應(yīng)外，對(duì)用力肺活量、6 min步行距離、圣喬治呼吸問(wèn)卷評(píng)分等指標(biāo)均無(wú)明顯改善。盡管出現(xiàn)此陰性結(jié)果的原因可能是分枝桿菌并非結(jié)節(jié)病的病因的假設(shè)所引起，但研究設(shè)計(jì)中的方法缺陷也提供了可能的解釋，如納入患者處于疾病穩(wěn)定期、服藥時(shí)間不足、結(jié)局指標(biāo)不敏感等?？傊壳暗难芯拷Y(jié)果提示分枝桿菌在結(jié)節(jié)病的發(fā)病中可能起到一定的作用，但證據(jù)并不十分充足。

2.2 分枝桿菌動(dòng)物模型及相關(guān)研究 目前多數(shù)研究采用MTB來(lái)源的抗原進(jìn)行結(jié)節(jié)病樣動(dòng)物模型的構(gòu)建。MTB直接感染動(dòng)物被用于構(gòu)建結(jié)核病模型［27-28］，而單純MTB抗原可以用來(lái)制作結(jié)節(jié)病樣非壞死性上皮樣肉芽腫模型。Swaisgood 等［29］預(yù)先以20 μg sodA加入IFA 中，通過(guò)皮下注射使小鼠致敏，2 周后將sodA 與瓊脂糖珠偶聯(lián)并經(jīng)靜脈注射激發(fā)免疫應(yīng)答。該實(shí)驗(yàn)的原理是瓊脂糖珠和抗原偶聯(lián)可以減緩抗原的降解，經(jīng)靜脈流經(jīng)肺部毛細(xì)血管網(wǎng)時(shí)，由于瓊脂糖珠不能通過(guò)毛細(xì)血管基底膜，因而形成微小栓塞駐留于肺間質(zhì)中，其偶聯(lián)的抗原得以持續(xù)激活肺部免疫應(yīng)答［30］。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠肺內(nèi)巨噬細(xì)胞圍繞瓊脂糖珠聚集形成肉芽腫結(jié)構(gòu)。肉芽腫以巨噬細(xì)胞為核心，CD4+T 細(xì)胞和B 細(xì)胞散在分布，且存在少許多核巨細(xì)胞；BALF 中IL-2 和IFN-γ 表達(dá)升高，IL-4和IL-5 水平無(wú)變化，呈Th1 型免疫反應(yīng)。此外，路聰哲［30］采用與Swaisgood 等［29］相似的造模方法（50 μg sodA，其余相同）構(gòu)建小鼠模型，結(jié)果顯示sodA 能夠引起Th17/Treg 失衡及相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、IL-17 表達(dá)升高。Zhang 等［31］也采用與前者等相似的造模方法（20 μg sodA，其余相同），7周后仍然能觀察到散在的肉芽腫。此時(shí)肉芽腫由上皮樣細(xì)胞構(gòu)成，周?chē)⒃诜植剂馨图?xì)胞和漿細(xì)胞；BALF 內(nèi)CD4/CD8 比值升高；淋巴結(jié)中CD4+IFN-γ+T細(xì)胞比例升高而CD4+IL-4+T 細(xì)胞比例不變，符合Th1 型免疫反應(yīng)。此外，Gon?ales 等［32］以同樣的方式（20 μg sodA）在正五聚蛋白3（pentraxin 3，PTX3）基因敲除小鼠中進(jìn)行sodA的刺激，結(jié)果表明巨噬細(xì)胞中PTX3的缺失能夠引起C5a介導(dǎo)補(bǔ)體通路的異常激活，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞代謝重編程，導(dǎo)致其增生、聚集。

Perez 等［33］將海藻糖6，6'-二霉菌酸酯（trehalose 6，6'-dimycolate，TDM）與礦物油VR6 混合后靜脈注射入小鼠體內(nèi)，于5 d 后誘導(dǎo)出肉芽腫炎癥，于14 d后消退。該模型肺組織TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達(dá)升高，而IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、L-10 等Th1 和Th2 型細(xì)胞因子水平無(wú)變化。結(jié)合結(jié)節(jié)病患者肺泡巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達(dá)升高這一研究報(bào)道［34］，上述結(jié)果提示該模型誘導(dǎo)的肉芽腫炎癥可能處于極早期的巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答階段，后續(xù)的細(xì)胞免疫應(yīng)答還未激活。Huppertz 等［35］將TDM 加入IFA 中靜脈注射，1周后誘導(dǎo)出以巨噬細(xì)胞為核心的小鼠肺肉芽腫模型。結(jié)果顯示肉芽腫內(nèi)巨噬細(xì)胞高表達(dá)IL-1β；同時(shí)該研究在結(jié)節(jié)病患者肉芽腫內(nèi)也發(fā)現(xiàn)IL-1β 和胱天蛋白酶1（caspase-1）表達(dá)升高。已知核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體通過(guò)激活caspase-1 促進(jìn)IL-1β 的成熟和分泌［36］。該研究團(tuán)隊(duì)在NLRP3-/-小鼠（NLRP3 表達(dá)減少）和mir-223-/-小鼠（NLRP3 表達(dá)升高）中進(jìn)行上述TDM 靜脈注射，結(jié)果表明前者肉芽腫數(shù)量減少而后者數(shù)量增多，提示NLRP3/IL-1β 信號(hào)通路活性上調(diào)能促進(jìn)結(jié)節(jié)病肉芽腫的發(fā)生。

3 外源性粒子

3.1 外源性粒子與結(jié)節(jié)病的臨床聯(lián)系 Beijer 等［37］的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)節(jié)病患者PBMCs 經(jīng)金屬（鋁、鈹、鋯）或硅刺激后淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)反應(yīng)增強(qiáng)。淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)和記憶淋巴細(xì)胞免疫刺激試驗(yàn)（memory lymphocyte immuno-stimulation assay，MELISA）用于評(píng)估患者對(duì)抗原的超敏反應(yīng)［38-39］。Fireman 等［40］納入13 例肺活檢確診為非壞死性肉芽腫患者（11 例結(jié)節(jié)病，2例慢性鈹疾?。┻M(jìn)行MELISA。結(jié)果顯示9/13患者對(duì)至少一種金屬（包括鎳、鈦、鉻、鈹?shù)龋┑腗ELISA試驗(yàn)呈陽(yáng)性反應(yīng)。同時(shí)，F(xiàn)ireman 等［41］利用能量色散X射線譜對(duì)患者病理切片進(jìn)行金屬成分分析，發(fā)現(xiàn)在12/13 患者的肉芽腫內(nèi)識(shí)別出至少一種金屬的存在。這些結(jié)果均提示肉芽腫的出現(xiàn)可能與環(huán)境暴露相關(guān)。一項(xiàng)針對(duì)消防員的研究結(jié)果指出，與醫(yī)務(wù)工作者和歷史對(duì)照相比，消防員結(jié)節(jié)病平均年發(fā)病率和點(diǎn)患病率升高。此外，美國(guó)911 事件發(fā)生后，環(huán)境中可吸入顆粒物和環(huán)境污染物含量增多，Izbicki 等［42］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)叵绬T結(jié)節(jié)病年發(fā)病率與往年相比顯著升高，同樣提示環(huán)境暴露在結(jié)節(jié)病發(fā)病中的重要作用。

3.2 外源性粒子動(dòng)物模型及相關(guān)研究 多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotube，MWCNT）由燃料燃燒而成，廣泛存在于室內(nèi)和室外環(huán)境中，是空氣中粒徑小于2.5 μm 顆粒物（PM2.5）的組成部分［43］。Huizar 等［44］對(duì)小鼠進(jìn)行氣管注射MWCNT，病理結(jié)果顯示肺部出現(xiàn)大量MWCNT 沉積，沉積物旁形成以巨噬細(xì)胞和CD3+T 細(xì)胞為主的肉芽腫；同時(shí)發(fā)現(xiàn)肺組織TNF-α、IL-18 等Th1 型細(xì)胞因子和C-C 基序趨化因子配體7（C-C motif chemokine ligand，CCL7）、IL-10、IL-13等Th2型細(xì)胞因子表達(dá)增加，呈現(xiàn)混合T淋巴反應(yīng)。Mohan 等［45］收集MWCNT 模型小鼠肺泡巨噬細(xì)胞和結(jié)節(jié)病患者BALF細(xì)胞，分別以健康小鼠和健康志愿者為對(duì)照進(jìn)行基因表達(dá)差異性分析，結(jié)果表明在MWCNT 模型小鼠及結(jié)節(jié)病患者中均發(fā)現(xiàn)適應(yīng)性免疫通路、T 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、IL-12/IL-17信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和氧化磷酸化通路活性上調(diào)，提示MWCNT 模型小鼠與結(jié)節(jié)病患者具有相似的免疫特征。Mular 等［46］對(duì)小鼠進(jìn)行MWCNT 和ESAT-6 氣管注射。結(jié)果顯示，相比于單獨(dú)氣管注射MWCNT，同時(shí)將MWCNT和ESAT-6氣管注射入小鼠能誘導(dǎo)出更加嚴(yán)重的肺部肉芽腫炎癥；且小鼠肺肉芽腫內(nèi)纖連蛋白1 表達(dá)增加，出現(xiàn)膠原纖維沉積；BALF 內(nèi)骨橋蛋白、CCL2、基質(zhì)金屬蛋白酶12 等促纖維化因子表達(dá)上調(diào)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果佐證了結(jié)節(jié)病可能是由多個(gè)病原引起的觀點(diǎn)。此外，先前研究發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)病患者的肺泡巨噬細(xì)胞中過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor-γ，PPARγ）表達(dá)減弱［47］，因此該研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了條件性巨噬細(xì)胞PPAR-γ基因敲除模型，隨后以相同方法在PPAR-γ基因敲除小鼠中進(jìn)行MWCNT 和ESAT-6 氣管注射。結(jié)果表明PPAR-γ缺乏能夠促進(jìn)ESAT-6 潴留，增加巨噬細(xì)胞中唾液酸結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素F（sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin F，Siglec-F）的表達(dá)，并促使IL-13、血小板源性生長(zhǎng)因子A、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 等促纖維化因子表達(dá)上調(diào)，提示PPAR-γ在結(jié)節(jié)病纖維化進(jìn)展中的重要作用。

4 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

Linke 等［48］在小鼠髓系來(lái)源細(xì)胞中條件性敲除結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合癥2（tuberous sclerosis complex 2，Tsc2）基因，激活巨噬細(xì)胞中的哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）通路，導(dǎo)致肺、淋巴結(jié)、肝中巨噬細(xì)胞肥大、增生和聚集。這些巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出M2型極化的特點(diǎn)，其高表達(dá)半乳糖凝集素3（galectin 3）、幾丁質(zhì)酶樣蛋白3（chitinase-like protein 3）等M2 型極化因子，低表達(dá)M1 型極化因子——誘導(dǎo)型一氧化氮合酶。將Tsc2基因敲除小鼠與WT 小鼠來(lái)源的巨噬細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)E2F 轉(zhuǎn)錄因子靶基因集在Tsc2基因敲除小鼠中高度富集。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）能通過(guò)激活E2F 促使細(xì)胞周期由G1期向S 期轉(zhuǎn)變［49］。該研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Tsc2/mTORC1 通路通過(guò)激活CDK4 促進(jìn)代謝重編程，同時(shí)該通路的異常激活能夠抑制核因子κB 信號(hào)通路以及減緩細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致肉芽腫的發(fā)生。該研究隨后在結(jié)節(jié)病患者中進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示結(jié)節(jié)病患者肉芽腫內(nèi)巨噬細(xì)胞高表達(dá)p-S6（mTORC1 激活標(biāo)志）和Ki-67；同時(shí)分析一個(gè)納入自限性和進(jìn)展性結(jié)節(jié)病的肺組織數(shù)據(jù)集，結(jié)果表明進(jìn)展性結(jié)節(jié)病肺組織中mTORC1 通路、E2F 通路及糖酵解通路活性上調(diào)，提示巨噬細(xì)胞中Tsc2/mTORC1信號(hào)通路異常激活促進(jìn)肉芽腫的發(fā)生發(fā)展。

5 小結(jié)和展望

現(xiàn)有的動(dòng)物模型是基于結(jié)節(jié)病可能的病因而構(gòu)建的，但由于病因和發(fā)病機(jī)制不明，導(dǎo)致目前尚沒(méi)有一個(gè)公認(rèn)的結(jié)節(jié)病動(dòng)物模型。在臨床上，結(jié)節(jié)病的診斷需綜合臨床、影像和病理學(xué)資料進(jìn)行判斷，幾乎所有結(jié)節(jié)?。ǔ薒?fgren 綜合征）的確診均需提供病變區(qū)域非干酪樣壞死性上皮樣細(xì)胞肉芽腫的病理結(jié)果。因此病理觀察到肉芽腫結(jié)構(gòu)是目前評(píng)價(jià)結(jié)節(jié)病模型構(gòu)建是否成功的金標(biāo)準(zhǔn)。

由于構(gòu)建模型方法不完全一致，不同研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建的動(dòng)物模型組織學(xué)和免疫學(xué)特點(diǎn)不盡相同。（1）在組織學(xué)上，sodA誘導(dǎo)的肉芽腫內(nèi)可見(jiàn)多核巨細(xì)胞，而單純P.acnes誘導(dǎo)的肉芽腫內(nèi)難以見(jiàn)到多核巨細(xì)胞，將誘導(dǎo)成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞與滅活P.acnes混合后注射，方看到多核巨細(xì)胞的形成；MWCNT 誘導(dǎo)的肉芽腫內(nèi)許多巨噬細(xì)胞形態(tài)為紡錘形，呈“漩渦樣”生長(zhǎng)；Tsc2基因敲除小鼠肉芽腫內(nèi)的巨噬細(xì)胞胞體增大，胞質(zhì)增多，體現(xiàn)出“過(guò)度肥大”的特征。（2）在免疫學(xué)上，P.acnes和sodA誘導(dǎo)的動(dòng)物模型以Th1型免疫反應(yīng)為主，BALF 內(nèi)淋巴細(xì)胞比例增加，體現(xiàn)結(jié)節(jié)病患者以CD4+Th1 型淋巴反應(yīng)為主的特點(diǎn)；TDM 誘導(dǎo)的小鼠肉芽腫炎癥可能處于極早期的巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答階段；MWCNT 與ESAT-6 同時(shí)吸入小鼠模型佐證了結(jié)節(jié)病可能由多個(gè)病因引起的觀點(diǎn)；sodA 靜脈注射、重復(fù)P.acnes吸入和MWCNT 吸入的小鼠能誘導(dǎo)出持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的肉芽腫，其中重復(fù)P.acnes吸入小鼠和MWCNT 吸入小鼠模型肉芽腫內(nèi)出現(xiàn)膠原沉積，體現(xiàn)肉芽腫后期進(jìn)展為纖維化的特征；Tsc2基因敲除小鼠體現(xiàn)了結(jié)節(jié)病出現(xiàn)系統(tǒng)性肉芽腫（肺、淋巴結(jié)、肝、皮膚）的特征?，F(xiàn)有的動(dòng)物模型均有各自不足之處，如P.acnes誘導(dǎo)需要多次氣管注射，可能增加操作的難度；TDM 誘導(dǎo)的小鼠模型只能引起為期10 d 的肉芽腫炎癥［35］；MWCNT 吸入小鼠模型BALF內(nèi)炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)沒(méi)有升高［44，50］，與結(jié)節(jié)病患者的臨床表現(xiàn)不相符等等。

盡管目前的動(dòng)物模型不能完全復(fù)刻結(jié)節(jié)病的特征，但它們?yōu)檠芯拷Y(jié)節(jié)病的發(fā)生發(fā)展提供了許多新思路，如通過(guò)P.acnes小鼠模型發(fā)現(xiàn)IL-17A 在結(jié)節(jié)病肉芽腫形成中的重要作用；通過(guò)MTB 抗原小鼠模型發(fā)現(xiàn)PTX3缺失能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞增生、聚集，以及發(fā)現(xiàn)NLRP3/IL-1β 通路的異常活化與肉芽腫的形成相關(guān)；通過(guò)MWCNT 模型發(fā)現(xiàn)PPAR-γ 在結(jié)節(jié)病纖維化中的作用；通過(guò)Tsc2基因敲除小鼠模型發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞中mTORC1 的激活對(duì)肉芽腫的發(fā)生和維持具有重要作用等等。在動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，結(jié)合臨床樣本進(jìn)行分析，有望進(jìn)一步揭示結(jié)節(jié)病的發(fā)病機(jī)制。