蘋果酸脫氫酶協同纖維素酶水解纖維素：理論分析與實驗

董友情，唐愛星，劉幽燕，李青云，2

（1 廣西大學化學化工學院，廣西 南寧 530004；2 廣西生物煉制重點實驗室，廣西 南寧 530003）

木質纖維素是地球上最豐富的生物聚合物，廣泛存在于各種形式的可再生生物質中[1]。將木質纖維素材料轉化為燃料和化學品是解決人類社會能源和資源可持續(xù)發(fā)展的途徑[2]，其轉化過程涉及預處理、水解和發(fā)酵[3]。由于纖維素結構復雜，通過水解作用使纖維素解構是實現纖維素資源化利用的關鍵步驟。目前研究纖維素水解方法包括物理機械法[4]、化學法[5]和酶法[6]等。采用纖維素酶水解纖維素相較于其他方法具有清潔、節(jié)能、安全等顯著優(yōu)勢，而解決纖維素酶對纖維素的可及性對提高酶法水解效率尤為關鍵。

以糖苷鍵連接葡萄糖單體為結構特征的纖維素分子由于存在氫鍵的作用，使其具有較高的剛性而難以被纖維素酶接觸，因此破壞纖維素分子的糖苷鍵、氫鍵網絡結構，降低纖維素的結晶度是提高纖維素酶可及性的重要途徑，采用添加纖維素降解輔助蛋白的策略被認為是達到這個目的的有效手段[7]。纖維素降解輔助蛋白是一類本身不具有纖維素酶活力，但是可以通過降低纖維素的結晶度、破壞纖維素鏈間的氫鍵以及提高纖維素表面的粗糙程度等方式破壞纖維素的結晶結構，從而促進纖維素酶與底物結合，顯著提高纖維素酶活的蛋白[8]。目前發(fā)現碳水化合物結合模塊、擴展蛋白、膨脹素、輔助活性家族等蛋白對纖維素酶都具有協同作用[9]，糖苷水解酶也被發(fā)現具有協同纖維素酶水解的作用，例如糖苷水解酶家族GH7 中的TrCel7 可以通過減少纖維素酶對纖維素的非生產性吸附來提高纖維素酶的水解效率[10]。膨脹素SWO Ⅰ與糖苷水解酶家族GH10中的木聚糖酶結合后能有效避免纖維素酶的非生產性吸附，從而提高纖維素酶的水解效率[6]。而糖苷水解酶家族GH4 中的α-葡萄糖苷酶則通過破壞纖維素分子的糖苷鍵來促進纖維素水解[10]。Varrot 等[11]在研究糖苷水解酶家族GH4時發(fā)現，α-葡萄糖苷酶與蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）的序列同源，并且二者的蛋白折疊結構極為相似[12]，由此猜測MDH 可能對纖維素酶水解也具有協同作用。

基于對MDH 的功能假設，本研究以結晶度高的濾紙纖維素為研究對象，首先通過分子對接進行理論分析，然后開展MDH 協同纖維素酶水解纖維素的實驗考察。MDH 是三羧酸循環(huán)過程中的關鍵酶，廣泛存在于各類生物中[13]，研究MDH 對纖維素酶水解纖維素的協同作用，不僅拓展和豐富了纖維素降解輔助蛋白的資源來源，而且為纖維素水解效率的進一步提高提供了理論指導與方法基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

蘋果酸脫氫酶（MDH），來源于大腸桿菌，上海源葉生物有限公司，分子量34kDa，酶活力為670U/mg，比活力為200U/mg；纖維素酶C1184，來源于黑曲霉，Sigma公司，酶活力為0.3U/mg；結晶纖維素、纖維二糖和羧甲基纖維素，索萊寶生物有限公司；檸檬酸、檸檬酸鈉，國藥集團化學試劑有限公司，皆為分析純；乙腈，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，色譜純；Whatman 1號濾紙，索萊寶生物有限公司，裁剪成1cm×3cm 的濾紙條，待用。

高效液相色譜儀UltiMate 3000，美國賽默飛世爾科技公司；蒸發(fā)光檢測器SEDEX85，法國SEDERE公司；酶標儀BioTek，美國伯騰儀器有限公司；X 射線衍射儀（XRD）SmartLab SE，日本Rigaku 公司；傅里葉紅外光譜儀（FTIR）Nicolet iS 50，美國賽默飛世爾公司；掃描電子顯微鏡（SEM）Sigma 300，德國Zeiss公司；水浴培養(yǎng)振蕩器SHZ-88，金壇市器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 MDH與結晶纖維素的分子對接

通過PDB數據庫（https://www.rcsb.org）[14]篩選同樣來源于大腸桿菌、分子量為34kDa的蘋果酸脫氫酶，選擇PDB序號為2CMD[13]的MDH作為分子模擬的受體蛋白。分別采用Epript 3[15]和PyMOL[16]軟件對MDH 與序號為1OBB 的α-葡萄糖苷酶[17]進行氨基酸序列比對和蛋白結構對比，獲取MDH 蛋白結構與功能的基本信息。從PubChem[18]庫中選擇結晶纖維素作為小分子配體，以MDH 作為受體，使用AutoDock tools (Vina)[19]進行分子對接，理論分析MDH對結晶纖維素的作用。

1.2.2 MDH協同纖維素酶水解纖維素的實驗研究

1.2.2.1 MDH協同纖維素酶的水解反應

稱量（50.00±0.50）mg濾紙條，分別添加0.06FPU（濾紙纖維素酶活力）的纖維素酶C1184 和150μg MDH，用0.1mol/L 的檸檬酸緩沖液（pH=4.80）補足反應體系的總體積為2.00mL，在120r/min、50℃恒溫水浴震蕩條件下水解反應24h。由于纖維素酶C1184本身有還原糖，因此以未添加濾紙的樣品作為空白組扣除，通過DNS法[20]測定還原糖產量，計算協同蛋白MDH 對纖維素酶的增效活性，結果以平均值表示，見式(1)。

式中，A為纖維素酶和MDH 共同作用的還原糖產量；B為纖維素酶單獨作用的還原糖產量。

1.2.2.2 MDH 協同纖維素酶水解纖維素的影響因素

單因素考察MDH 添加量（0、50μg、150μg、300μg）、纖維素酶量（0、0.020FPU、0.040FPU、0.060FPU、0.10FPU、0.50FPU、1.0FPU、2.0FPU）以及酶解時間對MDH 協同纖維素酶水解纖維素的影響。每個樣品做3個平行，通過測定還原糖的產量來計算MDH 對纖維素酶的平均增效活性。采用SPSS 25對MDH添加量和纖維素酶添加量的實驗結果進行單因素ANOVA 分析，P＜0.05(*)表示有顯著差異，P＜0.01(**)表示有極顯著差異。

1.2.3 MDH對纖維素酶活的影響

分 別 稱 量（20.00±0.20）mg 羧 甲 基 纖 維 素（carboxymethylcellulose，CMC）、（20.00±0.20）mg結晶纖維素（crystalline cellulose，MCC）以及（10.00±0.10）mg 纖維二糖[D-(+)-cellobiose]為底物，添加0.06FPU 的纖維素酶C1184 和150μg 的MDH，在上述相同條件下水解反應60min，反應結束測定還原糖產量。其中，纖維二糖的產物葡萄糖通過高效液相色譜和蒸發(fā)光檢測器（HPLC-ELSD）的聯合使用進行測定[21]。

1.2.4 MDH作用濾紙的表征分析

將水解反應結束后的濾紙用去離子水洗滌，除去附著在底物上的還原糖等物質，60℃烘干后分別進行SEM、XRD和FTIR的表征分析。

將濾紙樣品噴金處理，在加速電壓為3.0kV的條件下進行SEM 分析。XRD 的檢測條件[22]為：管電壓45kV，管電流40mA，掃描范圍為5°～40°，掃描速度為4°/min，計算并比較MDH 作用濾紙前后的結晶度指數，見式(2)。

式中，CrI 表示結晶度指數；hcr 表示2θ=22.8°左右的主衍射峰高度；ham 表示2θ=18.0°處無定形組分的散射強度。

將濾紙和KBr以1∶100的比例進行混合，反復研磨直至均勻混合，然后制成壓片進行FTIR 檢測分析[22]，掃描分辨為4cm-1，波數為4000～400cm-1。

2 結果與分析

2.1 MDH協同作用的理論分析

根據Varrot 等[11]和Lodge 等[17]提出α-葡萄糖苷酶與蘋果酸脫氫酶MDH序列同源的結論，將MDH與α-葡萄糖苷酶進行氨基酸序列比對，兩種蛋白的序列同源性為17%，該數值與文獻報道的結果相一致[11]。進一步將MDH 與α-葡萄糖苷酶的蛋白結構進行對比，得到的均方根誤差（RMSD） 值2.84?（1?=0.1nm）小于3.00?，圖1(a)顯示，MDH的蛋白結構與α-葡萄糖苷酶的蛋白結構疊合良好。使用InterPro 數據庫[23]進行蛋白功能注釋分析，發(fā)現MDH與α-葡萄糖苷酶、6-磷酸β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶等GH4 家族的蛋白屬于同源超家族（homologous superfamily），它們同為羅斯曼折疊形式。已知α-葡萄糖苷酶可以破壞纖維素分子鏈的糖苷鍵而協同促進纖維素酶的水解，由此推測MDH 很可能對纖維素的結晶區(qū)域結構也具有破壞作用，因此采用結晶纖維素為模型底物與MDH 進行分子對接。計算所得RMSD 值為1.03?，結合能為-8.32kcal/mol（1kcal/mol=4.18kJ/mol），處于文獻報道的RMSD≤3.00?、在結合能小于0 的范圍，說明對接結果良好[24]。圖1(b)所示，MDH的活性口袋附近有精氨酸（Arg）、甘氨酸（Gly）和異亮氨酸（Ile）等氨基酸殘基，Arg是起保護作用的氨基酸，參與底物羧酸部分的結合，并且有研究發(fā)現該氨基酸能促進氫鍵的形成[11]；Gly 和Ile是疏水殘基，這些疏水氨基酸形成的疏水表面有利于與纖維素微纖維的疏水表面相接觸[24]。MDH 通過Arg80、Gly7、Gly11、Gly13、Gly78 和Ile12 這6 個氨基酸形成的氫鍵作用與結晶纖維素結合，鍵長分別為2.10?、3.10?、3.20?、2.20?、2.10? 和2.70?。此外，與文獻報道的其他纖維素降解輔助蛋白的結構不同，例如TlEXLX1、CxEXL22等典型擴展蛋白活性中心的N 端包含一個雙-psiβ-桶狀折疊（DPBB）結構域，C端包含一個β-三明治折疊結構域[25-26]，而羅斯曼折疊的蛋白結構其活性中心主要位于N末端的β 折疊片層上，該片層為疏水結構[17]，這也有利于MDH 與纖維素的結合。由上述理論分析可知，MDH 可能通過氫鍵和疏水作用與纖維素結合，由此破壞纖維素鏈間的氫鍵網絡結構，降低纖維素的凝聚，使得更多纖維素暴露出來，從而提高纖維素酶的可及性[26]，協同促進纖維素酶的水解。

圖1 MDH蛋白結構和功能的理論分析

2.2 MDH協同作用及影響因素的實驗分析

基于上述MDH 的蛋白結構與功能分析，通過實驗考察MDH對纖維素酶水解纖維素的協同作用。結果如圖2 所示，MDH 本身對濾紙纖維素沒有水解作用，0.06FPU 纖維素酶單獨作用24h 的還原糖產量為(0.013±0.002)mg，當在體系中同時加入纖維素酶和150μg MDH 之后，還原糖產量增加至(0.045±0.004)mg，是纖維素酶單獨作用時的(3.47±0.28)倍，表明MDH 顯著促進了纖維素酶對纖維素的水解，MDH 對纖維素酶的增效活性達到247%±28%。文獻報道的濾紙體系中，添加200μg擴展蛋白BsEXLX1作用24h 后，BsEXLX1 對纖維素酶的增效活性為67.7%±3.5%[27]。Qin 等[28]發(fā)現添加700μg/g（底物）的擴展蛋白POEP1作用24h，POEP1對纖維素酶的增效活性達到364%；而最近報道的來源于菌株Arthrobotryssp.CX1 的 擴 展 蛋 白CxEXL22[26]，添 加5μg 水解反應48h，其對纖維素酶的增效活性達到240%；當以結晶纖維素為底物時，水解反應40h對纖維素酶的增效活性高達690%。由此可見，MDH 與擴展蛋白BsEXLX1、POEP1 和CxEXL22 的作用類似，能有效促進纖維素酶水解濾紙。

圖2 添加MDH對纖維素酶的協同作用

進一步研究MDH 添加量、纖維素酶量、水解時間對濾紙纖維素水解的影響。圖3(a)所示，與纖維素酶單獨作用相比，添加MDH 后的還原糖產量顯著增加，當MDH 添加量由50μg 增大至300μg時，還原糖的產量變化不顯著，這反映一定纖維素酶量下的纖維素水解結果。MDH 對纖維素酶的增效活性在其添加量為150μg 時達到最大值232%，而在添加量為300μg 時卻減小至196%，此現象可以用Kim等[27]提出的擴展蛋白與纖維素酶的協同作用存在飽和的觀點進行解釋。單因素方差分析結果表明，與未添加MDH的樣品相比，添加MDH后對還原糖產量有極顯著的影響（P＜0.01），反映了MDH對纖維素酶水解纖維素具有顯著的協同作用。圖3(b)顯示，在添加150μg MDH的情況下，體系中的還原糖產量隨著纖維素酶添加量的增加而增大，但是MDH 對纖維素酶的增效活性在較低纖維素酶量情況下最為顯著（在0.06FPU 時達到最高值229%），隨著纖維素酶量的增加，增效活性反而降低，MDH 在較低纖維素酶量情況下所表現出的顯著協同作用與文獻報道的輔助蛋白Cel9A[29]、POEP1[28]等的研究結果相一致。顯著性分析結果表明，當纖維素酶量在0.02～0.06FPU 范圍時對還原糖產量無顯著影響（P＞0.05），當纖維素酶量大于0.06FPU 時有極顯著影響（P＜0.01），說明0.06FPU對本體系來說是纖維素酶用量的關鍵點。圖3(c)為濾紙水解全過程的產物跟蹤監(jiān)測，圖中所示，在0.06FPU纖維素酶、150μg MDH的體系中，還原糖產量隨著時間的延長顯著增加，酶解反應100h 后基本達到平衡，此時還原糖的產量達到0.199mg，而僅有纖維素酶的體系中，酶解反應12h后還原糖產量無明顯增加，最終產量僅有0.0248mg，這與水解反應采用較低的纖維素酶量有關。通常纖維素酶的活性會受到水解產物葡萄糖抑制作用的影響，有研究發(fā)現當葡萄糖濃度為100g/L 時對工業(yè)纖維素酶產生高達50%的抑制作用[30]，也有研究發(fā)現葡萄糖濃度為30g/L 時對纖維素酶有抑制作用[31]，而Kim 等[27]和Qin 等[28]采 用 輔 助 蛋 白BsEXLX1、POEP1 協同纖維素酶水解時，纖維素酶的活性并沒有因為還原糖產量的增加而降低。在本研究中也觀察到相似的實驗現象，這可能緣于使用較低用量的纖維素酶進行水解反應，使得產物的生成量相應也較少，因此未發(fā)生產物抑制的問題，添加MDH后還原糖產量的顯著增加反映了MDH 對纖維素酶水解具有良好的協同作用。

圖3 MDH與纖維素酶協同作用的影響因素

2.3 MDH對纖維素酶活的影響分析

目前普遍認為纖維素的超分子結構是由結晶區(qū)和無定形區(qū)交錯結合形成，結晶區(qū)域的纖維素分子鏈通過分子內與分子間的氫鍵網絡有序排列，無定形區(qū)域則由分子鏈的無序排列構成[32]。纖維素酶對纖維素的水解包括內切葡聚糖酶（endo-1,4-β-Dglucanase，EG）、外切葡聚糖酶（exo-1,4-β-Dglucannase，CBH） 和β-葡萄糖苷酶（β-1,4-glucosidase，BG）等酶的綜合協同作用。EG 主要作用于纖維素的無定形區(qū)域，將纖維素長鏈降解為小分子纖維素或寡糖鏈，CBH與EG協同作用于纖維素的結晶區(qū)域，將纖維素鏈剝離并水解β-1,4-糖苷鍵釋放纖維二糖，BG 主要將EG 和CBH 作用產生的寡糖鏈和纖維二糖水解為葡萄糖[33]。為了考察MDH 是否提高了纖維素酶系中某種或多種關鍵酶的活性[34]，分別測定了纖維素酶對羧甲基纖維素、結晶纖維素以及纖維二糖不同底物的水解情況。圖4 顯示MDH 能協同纖維素酶水解結晶纖維素和纖維二糖，使得纖維素酶的增效活性分別達到23.1%和26.2%，但是對纖維素酶水解羧甲基纖維素無明顯增效，說明MDH 對纖維素的無定形區(qū)域不起作用。纖維素之所以難以水解，主要在于其結晶區(qū)域廣泛的氫鍵網絡具有高度抗化學和生物降解性[32]。相對結晶區(qū)域而言，無定形區(qū)域分子間的作用力較弱，氫鍵含量較少，在水解過程中更容易受到酶的攻擊而使糖苷鍵斷鍵[35-36]，因此解決纖維素結晶區(qū)域的剛性問題是研究纖維素水解的一個重要關注點。目前文獻報道的Zea h[37]、TlEXLX1[25]和CxEXL22[26]等纖維素降解輔助蛋白都是通過作用于纖維素的結晶區(qū)域，協同提高了纖維素酶的酶活。在本研究中，MDH 對纖維素的作用同樣發(fā)生在結晶區(qū)域，結合前述分子對接的結果可知，MDH 對纖維素氫鍵網絡結構的破壞有利于促進纖維素酶與纖維素的接觸，使得CBH 和BG 的水解更易進行，意味著MDH 協同提高了纖維素酶系中CBH 和BG的酶活。

圖4 MDH分別與EG、CBH、BG的協同作用

2.4 MDH作用濾紙的表征分析

基于上述實驗結果與分析，對MDH作用后的濾紙分別進行SEM、XRD和FTIR表征。SEM表征結果如圖5所示，與未處理濾紙的形貌相比[圖5(a)中空白樣品]，添加纖維素酶[圖5(b)]或者MDH[圖5(c)]作用后的濾紙表面出現更多微小、細長的纖維結構，說明濾紙的結晶區(qū)域發(fā)生改變，濾紙結構由致密變得松散。Li等[26]分析擴展蛋白CxEXL22對纖維素酶的協同作用認為，CxEXL22 通過β-片層的疏水表面與纖維素分子鏈結合，破壞纖維素鏈中分子間和分子內的氫鍵，從而顯著減少微原纖維的團聚，促進纖維素結晶結構的解聚。在本研究中，添加MDH 的樣品中[圖5(c)]發(fā)現濾紙纖維素的結構發(fā)生了斷裂（圓圈處），基于上述分子對接與水解實驗的數據結果，可以認為這些斷裂主要緣于MDH 對纖維素的氫鍵網絡產生了破壞。與圖5(b)纖維素酶單獨作用相比，圖5(d)的樣品顯示濾紙結構變得更容易斷裂（圓圈處），反映了MDH協同促進了纖維素酶對纖維素的水解。

圖5 不同處理后的濾紙SEM圖

XRD的表征結果如圖6所示，與未處理濾紙相比，MDH 處理的濾紙衍射峰強度顯著降低。通過計算結晶度指數可知，MDH 處理的濾紙結晶度指數為81.64%，比未處理（85.86%）時降低了4.22%，該結果與文獻報道的纖維素降解輔助蛋白CxEXL22[26]（結晶度指數降低8.50%）、POEP1[28]（結晶度指數降低6.70%）的作用結果類似，說明MDH能破壞濾紙的結晶區(qū)域，降低濾紙的結晶度。

圖6 不同處理后的濾紙XRD圖

FTIR的分析結果如圖7所示，不同處理的濾紙紅外光譜具有一致的吸收曲線，沒有新的吸收峰出現，說明沒有新鍵的生成。與未處理濾紙相比，纖維素酶和MDH單獨作用的樣品在3300cm-1處的O—H伸縮振動有所增強，說明經過MDH 處理后的濾紙分子內和分子間的氫鍵發(fā)生斷裂[22]。在1030cm-1處的吸收峰強度同樣也增強，說明分子內的C—OH發(fā)生了骨架拉伸，表明經MDH 處理后的濾紙在水解過程中有水分子進入結晶區(qū)域，使得纖維素暴露更多氫鍵，促進纖維素結晶部分的斷裂[36]。XRD和FTIR 的實驗結果與前述分子對接的理論分析相吻合，MDH 通過氫鍵和疏水作用降低了纖維素的凝聚，使得纖維素鏈間的氫鍵斷裂，有效降低了纖維素結晶結構的剛性，協同促進了纖維素酶的水解，這與擴展蛋白CxEXL22的作用方式相似[26]。

圖7 不同處理后的濾紙FTIR圖

3 結論

（1）利用分子對接模擬了MDH 和結晶纖維素之間的相互作用，發(fā)現MDH 可能通過氫鍵和疏水的作用來降低纖維素的凝聚，從而提高纖維素酶的可及性。

（2）對MDH 的協同作用進行了實驗研究，MDH本身對纖維素沒有水解作用，當向(50±0.50)mg濾紙體系添加0.06FPU纖維素酶、150μg MDH反應24h后，MDH的增效活性為247%±28%。通過比較纖維素酶對不同底物的水解結果，發(fā)現MDH 能協同提高纖維素酶系中外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的酶活。

（3）利用SEM、XRD 和FTIR 進一步進行表征分析，結果表明，MDH 主要通過破壞纖維素鏈間的氫鍵網絡而促進纖維素解聚，MDH 處理后的結晶度指數降低了4.22%。

（4）MDH 與其他纖維素降解輔助蛋白的功能相似，其本身不能水解纖維素，但是通過破壞纖維素的結晶區(qū)域、降低纖維素的結晶度來提高纖維素酶的可及性，協同纖維素酶水解，顯著提高了纖維素酶的活力。