纖維素水熱炭化液相與玉米秸稈混合發(fā)酵有機(jī)物轉(zhuǎn)化與產(chǎn)氣特性

王浩，邸璐，王芳，張德俐，易維明，李永軍，沈秀麗

（1 山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255000；2 山東省清潔能源工程技術(shù)研究中心，山東淄博 255000；3 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)劃設(shè)計(jì)研究院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)廢棄物能源化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100125）

生物質(zhì)作為零碳資源的一種，其無害化利用對(duì)于節(jié)能減排和農(nóng)業(yè)循環(huán)發(fā)展具有重要的意義。然而，目前許多生物質(zhì)仍存在被丟棄或直接焚燒等現(xiàn)象[1]，既導(dǎo)致環(huán)境污染，又造成資源浪費(fèi)，因此對(duì)生物質(zhì)資源的有效利用逐漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。

生物質(zhì)可以通過物理、熱化學(xué)、生物轉(zhuǎn)化等方式轉(zhuǎn)化為固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)等燃料。水熱炭化技術(shù)是近年來逐漸興起的一種生物質(zhì)熱化學(xué)轉(zhuǎn)化方式，生物質(zhì)在180～280℃的溫度范圍內(nèi)經(jīng)歷一系列水解、脫水、脫羧和縮聚等化學(xué)反應(yīng)[2]，最終形成水熱炭。水熱炭化技術(shù)比較適合含水量較高的生物質(zhì)[3]，憑借其相對(duì)豐富的含氧官能團(tuán)與良好的脫氧脫灰性能等特點(diǎn)，在吸附材料、儲(chǔ)能材料、催化劑等領(lǐng)域具有極高的潛在應(yīng)用價(jià)值[4]。然而，由于水的存在，生物質(zhì)中的部分有機(jī)物會(huì)溶解到水熱炭化液相中，形成小分子酸、還原糖、呋喃類和酚類化合物等可溶物質(zhì)[5]，通常這部分水相的化學(xué)需氧量（chemical oxygen demand，COD）和總有機(jī)碳（total organic carbon，TOC）的含量為10～40g/L和5～20g/L[6]，直接將水熱廢液排放會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的影響，因此水熱廢液的無害化處理已經(jīng)成為水熱炭化技術(shù)發(fā)展中必須要解決的瓶頸問題。

厭氧發(fā)酵是一種處理廢水的常用技術(shù)，已有研究證明利用厭氧發(fā)酵技術(shù)可實(shí)現(xiàn)水熱炭化液相中有機(jī)組分的甲烷化轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)能量的二次回收。Aragón-Brice?o 等[7]對(duì)污泥進(jìn)行水熱炭化處理，其中水熱液相發(fā)酵的甲烷產(chǎn)量達(dá)到了總能量的58%。Erdogan 等[8]以橙渣為原料獲得的水相產(chǎn)物甲烷總產(chǎn)氣量在195～213mL/g COD，在經(jīng)濟(jì)上可行。Posmanik 等[9]通過對(duì)竹渣炭化水熱液相和魚加工處理廢物混合發(fā)酵的研究得知，厭氧發(fā)酵技術(shù)處理水熱炭化液相，有機(jī)物的去除率為58%～90%，甲烷累積產(chǎn)氣量在136～286mL/g COD。將厭氧發(fā)酵與水熱炭化技術(shù)結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)中有機(jī)質(zhì)逐級(jí)利用，固體與氣體燃料聯(lián)產(chǎn)，具有較高的商業(yè)價(jià)值。

但是，水熱炭化液相產(chǎn)物在單獨(dú)進(jìn)行厭氧消化時(shí)也存在著一些問題。由于其中含有較多的酸，可能會(huì)在厭氧消化早期出現(xiàn)酸抑制現(xiàn)象[10]。并且生物質(zhì)中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素在水熱過程中會(huì)生成糠醛、羥甲基糠醛、乙酰丙酸和酚類化合物等有機(jī)物，對(duì)后續(xù)厭氧發(fā)酵具有不同程度的抑制作用[11]。近年來，隨著厭氧發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展和原料的多樣化，多基質(zhì)厭氧發(fā)酵得到了廣泛的研究與應(yīng)用?；旌习l(fā)酵可以稀釋有毒化合物，保持營(yíng)養(yǎng)平衡，不同原料之間的協(xié)同作用可以提高厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的沼氣生產(chǎn)效率[12]。將水熱炭化液相和秸稈類原料進(jìn)行混合發(fā)酵，一方面可以補(bǔ)充水熱炭化液相中有機(jī)質(zhì)含量，稀釋水相中的呋喃類及酚類等抑制物，平衡水相產(chǎn)物的酸度，提高發(fā)酵系統(tǒng)穩(wěn)定性；另一方面可以促進(jìn)秸稈類原料水解，加速產(chǎn)氣速率。

纖維素是木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)中的重要成分之一，其在水熱炭化過程中會(huì)發(fā)生水解產(chǎn)生糖類、酸類和呋喃衍生物等物質(zhì)，是生物質(zhì)水解的主要產(chǎn)物[13]。其中糖和酸是厭氧發(fā)酵過程中重要的代謝產(chǎn)物；而呋喃衍生物對(duì)產(chǎn)甲烷微生物代謝過程具有一定的抑制作用。因此，本研究針對(duì)纖維素水熱炭化水解液與玉米秸稈混合發(fā)酵開展研究，通過分析纖維素水熱炭化液相與秸稈混合發(fā)酵過程中有機(jī)物的轉(zhuǎn)化和微生物菌群結(jié)構(gòu)，探究二者厭氧發(fā)酵過程中相互作用及水熱炭化液相產(chǎn)物降解機(jī)制，本研究可為水熱液相和秸稈混合厭氧發(fā)酵工藝優(yōu)化提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

用于水熱炭化實(shí)驗(yàn)的纖維素為微晶纖維素，阿拉丁公司，其粒徑為250μm。用于混合厭氧發(fā)酵的玉米秸稈，山東省淄博市，將玉米秸稈自然干燥，并粉碎至1～2cm。厭氧消化所用接種物沼渣，山東省濰坊市沼氣工程，使用前將其在37℃的恒溫條件下富集培養(yǎng)7 天，其中富集培養(yǎng)基包括CHNaO25g、NaAc 5g、甲醇5mL、半胱氨酸0.5g、酵母膏1g、NH4Cl 1g、KH2PO40.4g、K2HPO40.4g、水1000mL。玉米秸稈與接種物特性如表1所示。

表1 秸稈與接種物特性（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%）

1.2 水熱炭化實(shí)驗(yàn)

水熱炭化實(shí)驗(yàn)在高壓反應(yīng)釜（WZEM250）中進(jìn)行。將纖維素和水以質(zhì)量比1∶20混合后置于反應(yīng)器中，反應(yīng)器溫度分別設(shè)置為200℃和230℃，并在設(shè)定的溫度下保持30min、60min 和120min。當(dāng)反應(yīng)終止時(shí)，冷卻至室溫，通過真空過濾器將其固液分離，然后將液相產(chǎn)物儲(chǔ)存于細(xì)口瓶中密封備用。

1.3 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

混合厭氧實(shí)驗(yàn)發(fā)酵利用全自動(dòng)甲烷測(cè)試系統(tǒng)（AMPTS II）進(jìn)行，反應(yīng)器容積為500mL。實(shí)際發(fā)酵所用容積為400mL，發(fā)酵系統(tǒng)的有機(jī)負(fù)荷率為65g/L VS；將水熱炭化液相與玉米秸稈按質(zhì)量比3∶1添加于消化器中，所加接種物占發(fā)酵系統(tǒng)VS 總含量的30%，發(fā)酵系統(tǒng)TS 總含量通過蒸餾水調(diào)節(jié)至10%。將在200℃的條件下、保溫時(shí)間為30min、60min和120min的纖維素水熱廢液的混合發(fā)酵組分別命名為H1、H2 和H3；將在230℃的條件下、保溫時(shí)間為60min的纖維素水熱液相的混合發(fā)酵組命名為H4。此外，為進(jìn)行對(duì)比分析，設(shè)置了玉米秸稈單發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，命名為CS。在實(shí)驗(yàn)期間每隔1h 開啟一次攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速為200r/min，攪拌時(shí)間持續(xù)60s?；旌习l(fā)酵在37℃水浴環(huán)境中持續(xù)60天，設(shè)置三組平行實(shí)驗(yàn)，分析結(jié)果取其平均值。

1.4 分析方法

TS 和VS 含量分別采用恒溫干燥箱110℃烘干法和馬弗爐550℃灼燒法測(cè)定；pH 測(cè)定使用數(shù)字pH 計(jì)（FE28，梅特勒-托萊多）；水熱炭化液相產(chǎn)物的TOC 由總有機(jī)炭分析儀（vario TOC select）測(cè)量；發(fā)酵液的總氨氮濃度（total nitrogen ammonia concentration，TAN）由全自動(dòng)凱氏氮分析儀（K9860 Hanon）測(cè)定；COD 使用多功能水質(zhì)分析儀（LY-4DA）根據(jù)重鉻酸鉀氧化法測(cè)定；水熱液相產(chǎn)物和發(fā)酵液里的呋喃及其衍生物使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）（GC6890/MS5973N，安捷倫）測(cè)定；揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid concentration, VFA）使用高效液相色譜儀（1260，安捷倫）定量測(cè)量。

1.5 微生物群落

通過Miseq平臺(tái)測(cè)序分析第25天厭氧發(fā)酵液中細(xì)菌和古菌群落的分布。使用E.Z.N.A?Mag-Bind Soil DNA Kit 提取試劑盒從厭氧消化漿液樣本中提取基因組DNA，利用Qubit3.0 DNA 檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA 精確定量，以確定PCR 反應(yīng)應(yīng)加DNA量。對(duì)細(xì)菌和古菌進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，細(xì)菌的PCR 擴(kuò)增需要兩輪，第一輪PCR 擴(kuò)增所用的引物已經(jīng)融合了測(cè)序平臺(tái)的16SV3-V4引物，第二輪擴(kuò)增引入Illumina 橋式PCR 兼容引物。古菌引用巢式PCR 擴(kuò)增有三輪：第一輪使用GU1ST-340F、GU1ST-1000R引物擴(kuò)增；第二輪使用第一輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 所用的引物已經(jīng)融合了測(cè)序平臺(tái)的V3-V4 通用引物；第三輪擴(kuò)增引入Illumina橋式PCR兼容引物。PCR 擴(kuò)增完成后，將得到的樣品利用Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序并利用數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 水熱炭化水相產(chǎn)物

如表2 所示，在200℃的條件下，隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，水熱液相的pH 從4.00 波動(dòng)到3.68，TOC的含量從877.66mg/L上升到963.04mg/L，表明在水熱過程中隨著停留時(shí)間的增加，水相中總有機(jī)碳含量增加，同時(shí)酸性物質(zhì)含量增加。將溫度升高到230℃時(shí)，水熱液相的pH降低到2.84，TOC含量上升到1994.52mg/L，表明水熱溫度升高加速了纖維素的解聚，使更多有機(jī)物進(jìn)入到了液相之中。

表2 纖維素水熱炭化液相的特性

從表2中可以看出，隨著保溫時(shí)間延長(zhǎng)，糠醛和5-羥甲基糠醛的總含量從41.23% 上升到55.86%，當(dāng)溫度從200℃升高到230℃，糠醛和5-羥甲基糠醛的總含量從44.98%上升到76.99%?？啡┖?-羥甲基糠醛是常見的呋喃醛，來源于戊糖和己糖在木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的預(yù)處理和水解過程中脫水[14]。研究表明水熱炭化液相的呋喃及其衍生物會(huì)抑制水解細(xì)菌及產(chǎn)甲烷細(xì)菌的生長(zhǎng)，不利于厭氧發(fā)酵過程的進(jìn)行[12]。

2.2 混合發(fā)酵產(chǎn)氣過程

圖1是水熱炭化液相產(chǎn)物與玉米秸稈混合發(fā)酵的累計(jì)甲烷產(chǎn)量和日產(chǎn)甲烷量。由圖1(a)可知，水熱炭化液相與玉米秸稈混合發(fā)酵、單發(fā)酵相比，累計(jì)產(chǎn)氣量有了明顯的提升，在200℃保溫30min、60min、120min的條件下產(chǎn)氣量分別提升了7.32%、4.42%、22.08%，在230℃保溫60min的條件下提升了21.76%。厭氧消化前5天，水熱炭化液相和玉米秸稈混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組的甲烷累積產(chǎn)氣量明顯高于秸稈單發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)組，這表明纖維素水熱炭化液相的加入提高了混合基質(zhì)啟動(dòng)階段的產(chǎn)甲烷速率[15]，200℃條件下的水熱炭化液相與秸稈混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組的啟動(dòng)速率早于230℃水熱炭化液相與秸稈混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組，表明較高濃度的呋喃及其衍生物在發(fā)酵初期對(duì)產(chǎn)氣產(chǎn)生了不利影響。厭氧發(fā)酵的第5～10天，5個(gè)實(shí)驗(yàn)組甲烷的產(chǎn)氣量都較低，此階段處于厭氧發(fā)酵的水解產(chǎn)酸階段，發(fā)酵系統(tǒng)的環(huán)境不利于產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)是產(chǎn)氣較低的主要原因[16-17]。在厭氧消化的第10～30天，甲烷產(chǎn)量快速積累，其中H4 組在此階段累積產(chǎn)氣量最高，達(dá)到了總產(chǎn)氣量的69.76%，CS 單發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組在此階段的甲烷累積產(chǎn)氣量占總產(chǎn)氣的46.05%，H1、H2、H3混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組的甲烷產(chǎn)氣量在此階段超過了秸稈單發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)組CS 實(shí)驗(yàn)組，它們?cè)诖穗A段的甲烷產(chǎn)氣量分別達(dá)到了總產(chǎn)氣量的53.45%、54.59%、51.75%；而在厭氧消化的第15～20 天，H1、H2、H3 的甲烷產(chǎn)氣量低于CS，表明200℃的條件下水熱液在厭氧發(fā)酵前期對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)生了不利的影響，可能的原因是該條件下水熱液中的抑制物在前期抑制了產(chǎn)甲烷菌的活性，但這種抑制很輕微，在第20 天左右200℃條件下的混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組甲烷累積產(chǎn)氣量超越了秸稈單發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組，也證明了抑制不會(huì)一直存在；水熱液相的加入明顯加速了厭氧發(fā)酵過程的進(jìn)行，使甲烷在厭氧發(fā)酵的中期獲得更高的累積量。在厭氧發(fā)酵的第30～60天，CS實(shí)驗(yàn)組在第30～35天甲烷產(chǎn)量依舊有明顯的上升趨勢(shì)，混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組在第30天以后產(chǎn)氣量逐漸降低，其中H4實(shí)驗(yàn)組的甲烷累積量?jī)H為總產(chǎn)氣量的9.89%，表明水熱炭化液相添加可有效縮短玉米秸稈發(fā)酵時(shí)間。最終秸稈單發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組的甲烷累積產(chǎn)量為1136mL，混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組H1、H2、H3、和H4 的甲烷累積產(chǎn)量分別達(dá)到了1218mL、1186mL、1387mL和1383mL。

圖1 甲烷產(chǎn)氣量

由圖1(b)可知，在厭氧發(fā)酵的前10天，甲烷的產(chǎn)氣速率總體較低；在發(fā)酵第10～30 天，H4 實(shí)驗(yàn)組首先進(jìn)入發(fā)酵過程的產(chǎn)氣高峰且峰值最高。CS組產(chǎn)氣高峰開始時(shí)間略早于H1、H2、H3實(shí)驗(yàn)組但峰值比其他實(shí)驗(yàn)組低，其中H4 首先進(jìn)入產(chǎn)氣高峰的原因可能為水熱液相中較高的酸性物質(zhì)含量促進(jìn)了厭氧發(fā)酵過程中產(chǎn)甲烷階段的進(jìn)行?；旌习l(fā)酵與秸稈單發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組相比，產(chǎn)氣高峰的結(jié)束時(shí)間明顯早于秸稈單發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組，峰值也明顯高于秸稈單發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組。在厭氧發(fā)酵的第30～60天，混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組的產(chǎn)氣高峰已經(jīng)基本結(jié)束，而秸稈單發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組CS的產(chǎn)氣高峰一直持續(xù)到第35天左右，比混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組延長(zhǎng)了至少5 天。H4 實(shí)驗(yàn)組在此階段產(chǎn)氣速率較低，而H1、H2、H3在此階段依舊有小的產(chǎn)氣高峰，H3 實(shí)驗(yàn)組在此階段的產(chǎn)氣高峰明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組。

由最終累計(jì)甲烷產(chǎn)量和日產(chǎn)甲烷量可知，纖維素水熱炭化液相中抑制物對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣的負(fù)面作用并不明顯，在厭氧發(fā)酵過程中，糠醛和5-甲基糠醛二者同時(shí)存在時(shí)糠醛會(huì)被優(yōu)先轉(zhuǎn)化[18]，5-甲基糠醛含量最高的H4 實(shí)驗(yàn)組的產(chǎn)氣總量最高且產(chǎn)氣高峰到來得最早，表明厭氧消化過程可以在早期就將發(fā)酵系統(tǒng)中的呋喃及其衍生物分解，解除其抑制作用并轉(zhuǎn)化為甲烷。混合發(fā)酵與秸稈單發(fā)酵相比，產(chǎn)氣效果有了明顯的提升，且其甲烷產(chǎn)氣高峰結(jié)束時(shí)間提前秸稈單發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組至少5天。

2.3 混合發(fā)酵過程中發(fā)酵液

2.3.1 發(fā)酵液有機(jī)物

表3顯示了第10天不同的水熱炭化液相和玉米秸稈混合發(fā)酵液中主要有機(jī)成分的半定量分析。在H1、H2、H3實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵液中，并沒有發(fā)現(xiàn)呋喃類化合物，在230℃的條件下水熱炭化液相與秸稈混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組提取的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了3.01%呋喃衍生物1-(呋喃基)乙二醇，表明呋喃類化合物可以在厭氧消化過程中被轉(zhuǎn)化為其他有機(jī)物，進(jìn)而被降解。結(jié)合產(chǎn)氣過程發(fā)現(xiàn)，該反應(yīng)過程在厭氧發(fā)酵的前期和中期完成，呋喃類化合物對(duì)混合發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程抑制并不明顯。有研究顯示，較高的呋喃及其衍生物濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生負(fù)面影響時(shí)，可能導(dǎo)致厭氧消化速率降低，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，甲烷收率降低；然而，當(dāng)呋喃及其衍生物濃度較低時(shí)，厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中微生物可以將其作為碳源進(jìn)行轉(zhuǎn)化和利用，進(jìn)而促進(jìn)甲烷的產(chǎn)生[19]。從甲烷總產(chǎn)氣量及產(chǎn)氣速率可知，在發(fā)酵過程中，水熱炭化液相中的呋喃及其衍生物可以作為碳源被分解轉(zhuǎn)化為甲烷，纖維素水熱炭化產(chǎn)生的抑制物濃度對(duì)厭氧發(fā)酵的抑制效果并不明顯，進(jìn)一步表明混合厭氧發(fā)酵稀釋了抑制物對(duì)厭氧發(fā)酵的影響。

表3 第10天厭氧發(fā)酵提取液的特性（相對(duì)峰面積，%）

VFA 是厭氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生的主要有機(jī)物，為探究不同條件下水熱炭化液相和玉米秸稈混合發(fā)酵過程中物質(zhì)變化，對(duì)發(fā)酵過程中乙酸、丙酸、丁酸三種VFA進(jìn)行了進(jìn)一步定量分析，如圖2所示。

圖2 揮發(fā)性脂肪酸濃度

在厭氧發(fā)酵的第5 天，H3 實(shí)驗(yàn)組的VFA 總量最高，其次是H1 實(shí)驗(yàn)組，CS、H2、H4 實(shí)驗(yàn)組沒有較大的差別，此時(shí)乙酸的累積量明顯高于丙酸和丁酸，但VFA 的總量較低，甲烷產(chǎn)氣量也相對(duì)較低。在第10 天左右VFA 總含量達(dá)到了最高，并且CS 實(shí)驗(yàn)組VFA 的累積量高于混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組，一般情況下，VFA 的積累反映了酸生產(chǎn)者和分解者之間的不平衡[20]，其中乙酸的大量積累表明發(fā)酵系統(tǒng)中的產(chǎn)甲烷菌不夠活躍，研究表明當(dāng)反應(yīng)器內(nèi)VFA 大于10mL/L 時(shí)，會(huì)抑制產(chǎn)甲烷菌活性[17]，這也是第5～10 天甲烷累積量較低的原因之一。在第10～25 天，大量的VFA 被消耗，其中H1、H2、H3實(shí)驗(yàn)組的VFA 含量持續(xù)降低，VFA 的消耗量超越積累量，表明此時(shí)的產(chǎn)甲烷菌分解酸產(chǎn)甲烷的速度超越了水解菌水解產(chǎn)酸的速度[21]；而CS和H4實(shí)驗(yàn)組VFA 的含量在第10～15天下降明顯，但在第15～20 天出現(xiàn)了回升，CS 出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能為產(chǎn)甲烷菌分解酸產(chǎn)甲烷的速度落后于水解菌水解產(chǎn)酸的速度。而H4 出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因?yàn)椋涸谄洚a(chǎn)氣高峰后，甲烷菌消耗大量乙酸導(dǎo)致系統(tǒng)中的產(chǎn)甲烷基質(zhì)相對(duì)含量不足，產(chǎn)甲烷速率變緩，水解菌繼續(xù)工作將底物水解，VFA 含量上升。數(shù)據(jù)顯示乙酸的大量消耗時(shí)間與甲烷的產(chǎn)氣高峰時(shí)間幾乎吻合，表明發(fā)酵過程中乙酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧淄槭钱a(chǎn)氣的主要路徑。秸稈單發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組CS 的VFA 累積量在此階段明顯高于混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組，表明混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組在此階段VFA 的轉(zhuǎn)化效率要高于秸稈單發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組，可能的原因是水熱液相的加入促進(jìn)了部分產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)。厭氧發(fā)酵第35～60天，此時(shí)處于厭氧發(fā)酵的后期，VFA 的總含量明顯降低，甲烷累積產(chǎn)氣量相對(duì)較低，乙酸含量也處于較低的水平，表明發(fā)酵系統(tǒng)中的基質(zhì)已經(jīng)消耗殆盡；丁酸的含量在整個(gè)厭氧發(fā)酵過程中未發(fā)生大的波動(dòng)，可能的原因是發(fā)酵過程中缺乏將丁酸轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。H3、H4實(shí)驗(yàn)組在厭氧發(fā)酵后期VFA 出現(xiàn)了輕微積累，對(duì)應(yīng)H3 實(shí)驗(yàn)組在第40 天左右迎來一個(gè)小的產(chǎn)氣高峰，H4 實(shí)驗(yàn)組的產(chǎn)氣量卻沒有明顯的增長(zhǎng)，可能的原因是H4實(shí)驗(yàn)組的有機(jī)質(zhì)已消耗殆盡。

2.3.2 氨氮、pH、COD

圖3 為發(fā)酵系統(tǒng)中pH、氨氮濃度和化學(xué)需氧量在發(fā)酵過程中的變化趨勢(shì)。如圖3(a)所示，在厭氧發(fā)酵前期pH 總體呈下降趨勢(shì)，第10 天左右pH達(dá)到最低，之后開始回升，到第20 天左右保持穩(wěn)定，至發(fā)酵結(jié)束一直維持在7.7～8.2 的范圍內(nèi)?；旌习l(fā)酵實(shí)驗(yàn)組與秸稈單發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組相比，在厭氧消化前10 天，H1、H2、H3 的pH 明顯低于秸稈單發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組；在厭氧發(fā)酵第20～55 天pH 保持穩(wěn)定后各實(shí)驗(yàn)組沒有出現(xiàn)較大的差距。如圖3(b)所示，H1、H2、H3 和CS 的氨氮濃度在厭氧發(fā)酵過程中總體呈上升趨勢(shì)，而H4 實(shí)驗(yàn)組氨氮濃度保持相對(duì)穩(wěn)定。在厭氧發(fā)酵前15 天，混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組的氨氮濃度高于秸稈單發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組，其中H4 實(shí)驗(yàn)組氨氮濃度在前10 天明顯領(lǐng)先于其他實(shí)驗(yàn)組，厭氧微生物分解有機(jī)物的同時(shí)可以將有機(jī)物中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為無機(jī)氮[22]，H4 氨氮濃度領(lǐng)先于其他實(shí)驗(yàn)組的原因可能為230℃條件下水熱液的加入對(duì)秸稈厭氧發(fā)酵前期水解速度的促進(jìn)作用最好。在第20～35 天，各實(shí)驗(yàn)組的氨氮濃度保持相對(duì)穩(wěn)定，沒有較大差距；在第35～45天，H1、H2、H3和CS實(shí)驗(yàn)組濃度出現(xiàn)了提升，而H4 實(shí)驗(yàn)組氨氮濃度出現(xiàn)了小幅度的下滑，表明H4 中銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)（可能被微生物利用轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C(jī)氨，在此階段H4的VFA 和COD 含量有明顯的下降趨勢(shì)，表明產(chǎn)甲烷菌在正常工作。）。H1、H2、H3實(shí)驗(yàn)組的氨氮濃度的上升趨勢(shì)相似，表明混合發(fā)酵過程中水熱液相的保溫時(shí)間對(duì)氨氮濃度影響并不明顯。

圖3 pH、氨氮濃度和化學(xué)需氧量在發(fā)酵過程中的變化趨勢(shì)

如圖3(c)所示，COD在厭氧發(fā)酵初期主要呈上升趨勢(shì)，在中后期開始呈下降趨勢(shì)；其中混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組在5天左右開始下降，而秸稈單發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組在15 左右開始有明顯的下降。發(fā)酵系統(tǒng)中主要有機(jī)物成分為碳水化合物，在厭氧發(fā)酵第5～10 天，水解產(chǎn)生大量VFA、還原性糖和氨基酸等小分子物質(zhì)[23]，VFA 快速累積是整個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)pH 下降明顯的主要原因，而CS 實(shí)驗(yàn)組在第5 天的VFA 濃度高于混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組H1、H2、H3，pH 卻低于混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組H1、H2、H3，原因可能為CS 實(shí)驗(yàn)組較高的氨氮濃度緩沖了VFA 的作用；在厭氧發(fā)酵第10～25 天，pH 和氨氮濃度保持相對(duì)穩(wěn)定，COD 有明顯的下降趨勢(shì)，COD 的下降表明產(chǎn)甲烷菌將發(fā)酵系統(tǒng)中的基質(zhì)轉(zhuǎn)化為甲烷；在厭氧發(fā)酵的25～55 天，pH 依舊趨于穩(wěn)定，氨氮濃度在此期間有了明顯的升高，仍遠(yuǎn)低于產(chǎn)甲烷微生物的抑制值1.7g/L[24]，化學(xué)需氧量總體仍呈下降趨勢(shì)，表明發(fā)酵系統(tǒng)中的產(chǎn)甲烷基質(zhì)持續(xù)減少，基質(zhì)中的含碳有機(jī)物被甲烷產(chǎn)氣菌分解產(chǎn)氣，氨氮含量開始累積，導(dǎo)致整個(gè)系統(tǒng)的C/N比失衡，這可能是厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣在后期停滯的原因之一。

2.4 微生物群落

圖4為第25天通過對(duì)厭氧發(fā)酵提取液進(jìn)行測(cè)序獲得的細(xì)菌在門和屬水平上的相對(duì)豐度。

圖4 細(xì)菌相對(duì)豐度

圖4(a)為第25 天時(shí)細(xì)菌在門水平上的相對(duì)豐度，由圖4(a)可知，厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中細(xì)菌群落最主要的兩個(gè)門是Bacteroidetes和Firmicutes。在秸稈單發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組CS 中，Bacteroidetes和Firmicutes占整個(gè)細(xì)菌群落總量的83.58%；在秸稈與水熱炭化液相混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組中，H1、H3 和H4 實(shí)驗(yàn)組和CS實(shí)驗(yàn)組相比，Bacteroidetes和Firmicutes的相對(duì)豐度有所提升，達(dá)到89.05%、86.53%、96.18%，而H2和CS相比，Bacteroidetes和Firmicutes的相對(duì)豐度下降，為74.09%。Bacteroidetes和Firmicutes作為厭氧消化過程中最重要的兩個(gè)門，它們可將有機(jī)物水解為乙酸、氫氣和二氧化碳等小分子物質(zhì)，從而產(chǎn)生甲烷[25]。H4實(shí)驗(yàn)組的Bacteroidetes和Firmicutes相對(duì)豐度明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組，也印證了230℃的條件下的纖維素水熱液相可以促進(jìn)水解菌的生長(zhǎng)，解釋了H4產(chǎn)氣高峰領(lǐng)先于其他實(shí)驗(yàn)組的原因。

圖4(b)為第25天時(shí)細(xì)菌在屬水平上的相對(duì)豐度。玉米秸稈單發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組和混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組中細(xì)菌的種類差別較小，但其相對(duì)豐度卻存在明顯差別。秸稈單發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)組Firmicutes在屬級(jí)別的主要細(xì)菌為unclassified_Clostridiales（11.18%）、Lysinibacillus（5.18%）、unclassifiedLachospiraceae（2.25%）、Tissierella（2.56%）、Sedimentibacter（2.27%）、Clostridium_III（1.29%）。秸稈和水熱液相混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組中，Clostridium_III 在H1、H2、H3、H4的相對(duì)分度分別為0.89%、1.67%、0.21%、1.59%；由已有的研究得知，Clostridium_III 可以將糠醛和5-羥甲基糠醛轉(zhuǎn)化為糠基醇和5-羥甲基糠醛醇[26]，因此在H4實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵液有機(jī)物分析中發(fā)現(xiàn)了1-(呋喃基)乙二醇，1-(呋喃基)乙二醇被進(jìn)一步分解為小分子有機(jī)物并最終轉(zhuǎn)化為甲烷，第10 天時(shí)在其他實(shí)驗(yàn)組未發(fā)現(xiàn)呋喃及其衍生物與呋喃醇，表明濃度較低的呋喃類有機(jī)物在前期已經(jīng)被轉(zhuǎn)化為甲烷。Tissierella和Sedimentibacter屬于Clostridiales_Incerta e_Sedis_XI，Tissierella在加入水熱炭化廢液的實(shí)驗(yàn)組H1、H2、H3、H4相對(duì)豐度分別為4.09%、8.09%、3.17%、7.71%，除了H3實(shí)驗(yàn)組外，其相對(duì)豐度與CS 實(shí)驗(yàn)組相比都有明顯的提升；Sedimentibacter可以將有機(jī)物發(fā)酵產(chǎn)生二氧化碳、氫和乙酸等，其在水熱炭化液相與玉米秸稈混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組H2和H4中相對(duì)豐度有所提升，分別達(dá)到了2.34% 和2.61%；H1 和H3 中此菌屬的相對(duì)豐度有所下降，分別為1.55%和1.31%。水熱液相的加入明顯促進(jìn)了Tissierella的生長(zhǎng)，該細(xì)菌可以將基質(zhì)中的糖、氨基酸、脂肪酸等有機(jī)物分解，產(chǎn)生乙酸、氨鹽和二氧化碳，是混合基質(zhì)中產(chǎn)乙酸的主要微生物之一[27]。

UnclassifiedLachospiraceae在加入水熱炭化液相的實(shí)驗(yàn)組H1、H2、H3、H4中，其相對(duì)豐度分別為0.87%、0.48%、0.32%、3.57%，除H4 外其他實(shí)驗(yàn)組該菌屬的相對(duì)豐度明顯減少，表明水熱炭化液相的加入抑制了該菌屬的生長(zhǎng)。Lysinibacillus屬于Planocospiraceae，在混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組H1、H2、H3、H4 相 對(duì) 豐 度 為4.48%、4.40%、23.91%、1.82%，H3實(shí)驗(yàn)組中，水熱炭化液相的加入促進(jìn)了Lysinibccillus在的生長(zhǎng)。Lysinibacillus可以發(fā)酵糖、氨基酸、脂肪酸等基質(zhì)，產(chǎn)生己酸[28]，其厭氧消化的基質(zhì)與Clostridiales_Incertae_Sedis_XI 相似，二者存在競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制；然而Lysinibccillus發(fā)酵產(chǎn)物為己酸，因此Clostridiales_Incertae_Sedis_XI 更有利于產(chǎn)氣，H3 的產(chǎn)氣滯后于其他實(shí)驗(yàn)組及丁酸含量明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組的原因即Lysinibccillus在競(jìng)爭(zhēng)中處于優(yōu)勢(shì)地位。Bacteroidetes中的主要細(xì)菌為unclassified_Porphyromonadaceae，在秸稈單發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組CS 中，unclassified_Porphyromonadaceae的相對(duì)豐度為43.02%，在水熱液相與秸稈混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組H1、H2、H3、H4 中，該菌屬的比例分別為50.86%、32.02%、43.12%、53.58%，其相對(duì)豐度除H2 之外皆超過了秸稈單發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組CS，表明水熱液相的加入可以促進(jìn)unclassified_Porphyromonadaceae的生長(zhǎng)。該菌屬可以參與復(fù)雜碳水化合物、蛋白質(zhì)和多肽的厭氧降解，并在水解階段參與揮發(fā)性脂肪酸的生成[29]。unclassified_Porphyromonadaceae作為最重要的水解細(xì)菌，在厭氧發(fā)酵過程中起著至關(guān)重要的作用。

圖5為第25天通過對(duì)發(fā)酵提取液進(jìn)行測(cè)序獲得的古菌屬水平上的相對(duì)豐度。Methanosarcina是古菌中的優(yōu)勢(shì)菌屬，Methanosarcina屬于乙酸產(chǎn)甲烷途徑，它可以將發(fā)酵系統(tǒng)中的乙酸還原為甲烷[30]，在秸稈單發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組CS中，Methanosarcina的相對(duì)豐度為94.21%；在混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組中，H1、H2、H3、H4 中相對(duì)豐度分別為88.01%、87.22%、76.67%、94.11%，H3 實(shí)驗(yàn)組Methanosarcina相對(duì)豐度低于混合發(fā)酵其他實(shí)驗(yàn)組的原因可能是H3 實(shí)驗(yàn)組中Lysinibacillus的相對(duì)豐度高于其他實(shí)驗(yàn)組導(dǎo)致丁酸含量過高，不利于Methanosarcina的生長(zhǎng)；混合發(fā)酵H1、H2、H3 中Methanosarcina的相對(duì)豐度低于秸稈單發(fā)酵CS 實(shí)驗(yàn)組表明糠醛抑制了Methanosarcina的 生 長(zhǎng)。Methanomassiliicoccus、Methanobacterium、Methanoculleus和Methanobrevibacter屬于氫還原二氧化碳產(chǎn)甲烷途徑，秸稈單發(fā)酵 中，Methanomassiliicoccus、Methanobacterium、Methanoculleus和Methanobrevibacter的 相 對(duì) 豐 度 分別為2.69%、0.42%、0.72%和0.60%；混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組H1、H2、H3、H4 中，Methanomassiliicoccus的相對(duì)豐度為3.03%、4.47%、10.49%、1.15%，Methanobacterium的相對(duì)豐度為1.64%、1.17%、4.67%、0.90%，Methanoculleus的相對(duì)豐度為4.16%、4.27%、4.14%、1.95%，Methanobrevibacter的相對(duì)豐度為1.65%、1.38%、3.37%、0.41%?；旌习l(fā)酵H1、H2、H3 的Methanomassiliicoccus、Methanobacterium、Methanoculleus和Methanobrevibacter相對(duì)豐度明顯高于CS和H4實(shí)驗(yàn)組，證明水熱炭化液相可以促進(jìn)氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌生長(zhǎng)。H4在第25天時(shí)古菌的相對(duì)豐度更接近秸稈單發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組，表明此時(shí)其產(chǎn)氣途徑與秸稈單發(fā)酵相同，可能的原因是H4 實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)氣高峰領(lǐng)先其他實(shí)驗(yàn)組，在厭氧發(fā)酵前期水熱液相中的基質(zhì)已經(jīng)消耗完畢，其厭氧發(fā)酵中期的發(fā)酵環(huán)境不利于氫還原二氧化碳產(chǎn)甲烷的生長(zhǎng)。

圖5 古菌屬水平相對(duì)豐度

由于核心微生物群中的細(xì)菌群落和產(chǎn)甲烷菌之間的代謝相互作用，底物特異性將厭氧發(fā)酵引向特定的產(chǎn)甲烷路徑[31]。圖6為纖維素水熱炭化液相產(chǎn)物與玉米秸稈混合厭氧發(fā)酵過程中有機(jī)物轉(zhuǎn)化甲烷路徑圖。

圖6 纖維素水熱炭化液相產(chǎn)物與玉米秸稈混合厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷路徑

在厭氧發(fā)酵過程中，水熱炭化液相的加入促進(jìn)了氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)。在發(fā)酵過程中，微生物在厭氧發(fā)酵過程中相互生存、相互依賴使得復(fù)雜有機(jī)物得以分解[32]，在實(shí)驗(yàn)厭氧發(fā)酵過程中最主要的產(chǎn)甲烷途徑為乙酸產(chǎn)甲烷途徑，水解菌（Porphyromonadaceae） 將木質(zhì)纖維素分解為小分子糖，小分子糖通過發(fā)酵細(xì)菌（Tissierella、Sedimentibacter、Lysinibacillus）將小分子有機(jī)物發(fā)酵分解為VFA （主要為乙酸），最終產(chǎn)甲烷菌（Methanobacterium）將乙酸轉(zhuǎn)化為甲烷。水熱液相的加入促進(jìn)了氫還原二氧化碳產(chǎn)甲烷途徑，混合基質(zhì)中糠醛及其衍生物可以被Clostridium_III 轉(zhuǎn)化為糠 醛 醇， 糠 醛 醇 通 過 細(xì) 菌 （Tissierella、Sedimentibacter）還原為氫氣和二氧化碳，最終通過氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌（Methanomassiliicoccus、Methanobacterium、Methanoculleus和Methanobrevibacter）將氫氣和二氧化碳轉(zhuǎn)化為甲烷。此過程中不同功能的微生物相互作用，相互依賴[33]，共同促進(jìn)產(chǎn)氣。

3 結(jié)論

（1）纖維素水熱炭化液相和秸稈混合發(fā)酵與秸稈單發(fā)酵相比，產(chǎn)氣量有明顯的提高，在200℃保溫30min、60min、120min 的條件下產(chǎn)氣分別提升了7.32%、4.42%、22.08%，在230℃保溫60min 的條件下提升了21.76%；表明在一定范圍內(nèi)，水熱炭化溫度升高和保溫時(shí)間延長(zhǎng)獲得的水熱炭化液相對(duì)甲烷產(chǎn)氣具有正向的促進(jìn)作用。

（2）水熱炭化液相中的有機(jī)物可以提高混合發(fā)酵厭氧消化潛力，纖維素水熱廢液中的呋喃及其衍生物在濃度較低的情況下對(duì)厭氧發(fā)酵過程并不會(huì)產(chǎn)生明顯的抑制作用。

（3）微生物群落分析表明，纖維素水熱炭化液相和秸稈厭氧共消化可以促進(jìn)氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)，協(xié)同乙酸產(chǎn)甲烷途徑，促進(jìn)了甲烷生產(chǎn)。同時(shí)微生物群落中存在Clostridium_III，可以將糠醛和5-羥甲基糠醛轉(zhuǎn)化為糠基醇類有機(jī)物，促進(jìn)產(chǎn)氣。