超微粉碎聯(lián)合超聲波輔助提取鴨屎香單樅茶多糖工藝及活性研究

丁莫 胡蕾 劉謀泉 王忠合 林婉玲 王錦旭

摘要? ［目的］提高茶多糖的提取得率。［方法］采用超微粉碎技術對鴨屎香單樅茶進行前處理，利用超聲波輔助結合正交試驗對其多糖提取工藝進行優(yōu)化，并考察鴨屎香單樅茶多糖的抗氧化和抑菌活性。［結果］最優(yōu)提取條件為提取時間150 min、提取溫度70 ℃、提取2次和料液比（g/mL）1∶30，在該提取條件下，鴨屎香單樅茶多糖的平均提取得率達到6.72%。體外抗氧化結果得出，鴨屎香單樅茶多糖對ABTS+和DPPH自由基均具有較強的清除作用，其清除率變化趨勢與茶多糖濃度呈正相關；體外抑菌活性研究表明，茶多糖對4種菌株均具有抑制作用，且對大腸桿菌表現(xiàn)出較好的抑制效果，其最低抑菌濃度為3.125 mg/mL。［結論］茶多糖的提取工藝簡單，得率高，抗氧化活性好，為鴨屎香單樅茶多糖的進一步研究及新產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)和重要參考。

關鍵詞? 鴨屎香單樅茶；超微粉碎；多糖；抗氧化活性；抑菌活性

中圖分類號? TS272.7? 文獻標識碼? A? 文章編號? 0517-6611（2024）01-0159-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.01.035

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on Superfine Pulverization and Ultrasonic-assisted Extraction Process and Activity of Yashixiang Dancong Tea Polysaccharide

DING Mo1，2， HU Lei1， LIU Mou-quan1，2 et al

（1.College of Life Science and Food Engineering， Hanshan Normal University， Chaozhou， Guangdong 521041; 2.Guangdong Key Laboratory for Functional Substances in Medicinal Edible Resources and Healthcare Products， Chaozhou， Guangdong 521041）

Abstract? ［Objective］In order to improve the extraction yield of tea polysaccharide. ［Method］The superfine pulverization technology was used to pretreat Yashixiang Dancong tea， the ultrasonic-assisted and orthogonal experiment method was used to optimize the extraction conditions of tea polysaccharide， and then the antioxidant and antibacterial activity was investigated. ［Result］The optimized extraction conditions of superfine pulverization Yashixiang Dancong tea polysaccharide were the following： extraction time 150 min; extraction temperature 70 ℃; repetition of the extracting procedure 2 times and solid-liquid ration 1∶30 （g/mL）. Under such conditions， polysaccharide yield was 6.72%. The results of in vitro antioxidant results showed that tea polysaccharide from Yashixiang Dancong had strong scavenging effect on ABTS+ and DPPH free radicals， the trend of its scavenging activity changed was basically positively correlated with the concentration of tea polysaccharide; the in vitro antibacterial activity studies showed that Yashixiang Dancong tea polysaccharide had inhibitory effects on 4 bacterial strains， which the inhibitory activity was the strongest against Staphylococcus aureus， the value of MIC was 3.125 mg/mL. ［Conclusion］The extraction process of tea polysaccharide in this experiment is simple， with high yield and good antioxidant activity， which provides a theoretical basis and important reference for further research and new product development of Yashixiang Dancong tea polysaccharide.

Key words? Yashixiang Dancong tea;Superfine pulverization;Polysaccharide;Antioxidant activity;Antibacterial activity

基金項目? 韓山師范學院博士啟動項目（QD202124）；2021年韓山師范學院大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（2021242）。

作者簡介? 丁莫（1990—），男，安徽安慶人，實驗師，碩士，從事農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏研究。*通信作者，講師，博士，從事天然活性多糖研究。

收稿日期? 2023-02-16；修回日期? 2023-03-14

鳳凰單樅是我國傳統(tǒng)名茶，屬于烏龍茶，產(chǎn)于廣東省潮州市鳳凰山。單樅茶種植歷史悠久，茶樹大多生長在海拔1 000 m以上的山區(qū)，地區(qū)土壤肥沃且富含有機質(zhì)和多種微量元素，孕育出鳳凰單樅茶品種資源豐富，成茶品質(zhì)優(yōu)異，具有“形美、味甘、色翠、香郁”的特點［1-2］，其中代表香型有鴨屎香、蜜蘭香和桂花香等。因其獨特的生長環(huán)境和自然的發(fā)酵工藝，單樅茶除含有大量茶多酚、氨基酸等活性物質(zhì)外，還含有多糖類活性物質(zhì)。茶多糖是茶葉細胞壁中一類由葡萄糖、木糖、鼠李糖、甘露糖等單糖通過β-（1，3）糖苷鍵連接組成糖鏈，同時結合糖醛酸、蛋白質(zhì)和中性糖等物質(zhì)的酸性多糖或酸性糖蛋白［3］，具有抗氧化［4-5］、降血糖［6］、降血脂［7］、免疫調(diào)節(jié)［8-10］等功能，可作為天然食品提高免疫力及發(fā)揮保健功能的物質(zhì)基礎之一［11-12］。Scoparo等［13］以膿毒癥小鼠為研究對象，將紅茶多糖和綠茶多糖分別作用于膿毒癥小鼠，發(fā)現(xiàn)與對照組相比致死率明顯降低，其作用機制與其糖醛酸含量有關；Chen等［14］對粗茶多糖提取分離后多糖的抗氧化性進行研究，得出茶多糖具有抗氧化、清除自由基等作用，在調(diào)節(jié)人體機能方面具有重要的藥理活性。

超微粉碎技術是利用超細化的機械加工手段使顆粒固體克服內(nèi)部凝聚力，破壞植物細胞壁使之粉碎至10～25 μm新型物料破碎技術，與傳統(tǒng)粉碎技術相比，超微粉碎得到的物料粒度更小，超微粉體具有界面活性，且能明顯提高物料的分散性、溶解性和活性物質(zhì)的溶出性等［15-16］，因此超微粉碎技術廣泛應用于食品、中藥等加工領域。目前有關茶多糖的研究主要集中于綠茶、紅茶、白茶等茶類，如尚進等［17］研究表明，鐵觀音茶梗多糖提取工藝發(fā)現(xiàn)，在最優(yōu)條件下（溫度100 ℃、時間2 h、料液比1∶40）茶多糖提取率為2.97%；宋珊珊等［18］通過正交試驗，確定湄潭白茶茶多糖最佳提取工藝條件，進而對茶多糖的抑菌性做了研究，但對潮州鴨屎香單樅茶多糖提取和活性研究尚鮮見報道。筆者以潮州鴨屎香單樅茶為原料，利用球磨儀對茶葉顆粒進行超微粉碎并結合超聲波輔助提取茶多糖，采用熱水-乙醇沉淀法提取茶多糖，通過正交試驗設計對提取工藝進行優(yōu)化，研究茶多糖的抗氧化活性和抑菌性能，以期為鴨屎香單樅茶作為高附加值產(chǎn)品及茶資源開發(fā)利用提供參考，從而提高茶葉的經(jīng)濟價值。

1? 材料與方法

1.1? 材料與試劑

濃硫酸（分析純）、三氯乙酸，購于西隴化工股份有限公司；蒽酮（分析純），購于上海展云化工有限公司；無水葡萄糖（分析純）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），購于天津市北辰方正試劑；其他化學試劑均為分析純，購于西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

TG-16WS高速臺式離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；ML204/02精密電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋，上?！憧茖W儀器有限公司；V110Pro型可見分光光度計，翱藝儀器（上海）有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計；北京普析通用儀器有限責任公司；GZX-9146MBE電熱鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；JJ-2組織搗碎機，金壇區(qū)白塔新寶儀器廠；XW-80A微型旋渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；XQM-8行星球磨儀，長沙天創(chuàng)粉末技術有限公司；FDU-2110冷凍干燥機，上海愛朗儀器有限公司；N-1001旋轉蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；KQ-500DE型數(shù)顯超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；鴨屎香單樅茶，購于潮州市益緣茶業(yè)。

1.3? 試驗方法

1.3.1? 超微粉碎的茶粉制備。

取鴨屎香單樅茶葉在50 ℃條件下烘至恒重，用高速粉碎機粉碎后過篩（60目），再將茶葉粉末經(jīng)行星球磨儀粉碎得到鴨屎香單樅茶超微茶粉（粒徑＜100 μm），置于干燥皿內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2? 茶多糖提取工藝。

準確稱取10.0 g鴨屎香單樅茶超微茶粉于錐形瓶中，加入一定比例的蒸餾水，在一定的溫度、提取時間和提取次數(shù)的條件下進行超聲波輔助提?。?9］，提取液放置冷卻并進行離心（8 000 r/min，5 min），取上清液得到粗多糖提取液；向粗多糖提取液中加入等體積Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1，mL/mL），充分振蕩混勻，靜置20 min，收集上清液［20-21］，向上清液中加入4倍體積無水乙醇進行充分混勻，在4 ℃溫度下醇沉12 h以上，離心（8 000 r/min，5 min）取沉淀物，經(jīng)真空冷凍干燥6 h制得脫蛋白茶多糖樣品，備用。

1.3.3? 茶多糖提取率測定。

1.3.3.1? 葡萄糖標準曲線繪制。

采用苯酚-硫酸法測定［22］，取干燥并恒重的葡萄糖，分別配制濃度為0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 mg/mL葡萄糖溶液各1.0 mL，分別加入4.0 mL配制好的蒽酮-硫酸試劑，充分混勻后在100 ℃條件下水浴加熱6 min，充分反應并迅速冷卻后在波長490 nm 處測定吸光值。以標準溶液濃度（X）為橫坐標，吸光值（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得出回歸方程為Y =0.011 9X-0.003 5，R2=0.999 3，說明葡萄糖標準品在0.02～0.10 mg/mL呈良好的線性關系。

1.3.3.2? 茶多糖提取率測定。

取1 mL稀釋后的茶多糖上清液放入具塞試管中，按照“1.3.3.1”方法測定茶多糖樣品吸光值，代入標準曲線計算得到樣品溶液中多糖濃度，然后按下式（1）計算得到多糖的得率。

茶多糖得率（%）=C×V×NW×103×100（1）

式中：C為葡萄糖濃度（mg/mL）；V為樣品浸提后上清液體積（mL）；N為樣品浸提后上清液稀釋倍數(shù)；W為茶粉稱取量（g）。

1.3.4? 單因素試驗設計。

1.3.4.1? 提取時間對茶多糖提取得率的影響。

分別稱取10.0 g鴨屎香單樅茶超微茶粉，在料液比為1∶20、提取溫度為60 ℃固定條件下，提取時間分別為30、60、90、120和150 min時按照“1.3.2”中的方法進行多糖提取1次，測定多糖含量，確定最佳浸提時間。

1.3.4.2? 提取溫度對茶多糖提取得率的影響。

分別稱取10.0 g鴨屎香單樅茶超微茶粉，在料液比為1∶20、提取時間為60 min固定條件下，提取溫度分別為50、60、70、80和90 ℃時按照“1.3.2”中的方法進行多糖提取1次，測定多糖含量，確定最佳提取溫度。

1.3.4.3? 提取次數(shù)對茶多糖提取得率的影響。

分別稱取10.0 g鴨屎香單樅茶超微茶粉，在料液比為1∶20、水浴溫度為60 ℃、提取時間為60 min固定條件下，按照“1.3.2”中的方法進行多糖提取1、2、3、4和5次，測定多糖含量，確定最佳提取次數(shù)。

1.3.4.4? 料液比對茶多糖提取得率的影響。

分別稱取10.0 g鴨屎香單樅茶超微茶粉，在提取時間為60 min、提取溫度為60 ℃固定條件下，料液比分別1∶15、1∶20、1∶25、1∶30和1∶35時按照“1.3.2”中的方法進行多糖提取1次，測定多糖含量，確定最佳料液比。

1.3.5? 正交試驗設計。

基于單因素試驗結果，選取提取時間（A）、提取溫度（B）、提取次數(shù)（C）和料液比（D）為考察因素，將茶多糖的提取得率作為考察指標，采用4因素3水平L9（34）（表1）進行正交試驗優(yōu)化鴨屎香單樅茶多糖提取工藝，篩選不同提取方法中各因素對提取茶多糖的貢獻率及得率較高的試驗組。

1.3.6? ABTS+自由基清除能力。

參考Shen等［23］的測定方法并略加修改，ABTS母液制備：分別制備濃度為2.45 mmol/L K2S2O8溶液與濃度為7.00 mmol/L的ABTS并等體積混勻，在室溫避光反應12～16 h，制成ABTS母液。再將10 mmol/L、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液緩慢加到ABTS母液中，使得混合溶液在波長734 nm處的吸光度穩(wěn)定在1.100±0.020范圍內(nèi)即可得到ABTS工作液。

分別準確吸取100、200、300、400、500和600 μL待測的茶多糖樣品溶液，用蒸餾水定容至1 mL，然后分別加入4 mL ABTS工作液，充分均勻搖晃30 s孵育6 min后，記錄734 nm處的吸光度A1；按照相同方法，測定茶多糖樣品溶液和蒸餾水的吸光度為A2；ABTS工作液與蒸餾水的吸光度為A0。以VC溶液作為陽性對照。按式（2）計算：

ABTS+自由基清除率=（1-A1-A2A0）×100%（2）

1.3.7? DPPH自由基清除能力［24］。

用無水乙醇配制濃度為0.5 mg/mL的DPPH-乙醇溶液，備用。然后分別吸取100、200、300、400、500和600 μL濃度為1.0 mg/mL的茶多糖樣品溶液，用蒸餾水稀釋到1.0 mL后加4.0 mL DPPH-乙醇溶液，混勻靜置反應30 min，于波長517 nm處測定吸光值，按式（3）計算。相同的方法，以VC溶液作為陽性對照。

DPPH自由基清除率=（1-Aa-AbAc）×100%（3）

式（3）中：Aa為茶多糖和DPPH混合溶液吸光度；Ab為茶多糖溶液和無水乙醇吸光度，Ac為樣品空白對照組吸光度。

1.3.8? 抑菌活性研究。

1.3.8.1? 供試菌株抑菌活性測定。

茶多糖對供試菌株抑菌活性測定參照馮筱巍等［25］的方法，吸取50 μL供試菌液（密度為105 CFU/mL）均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，將已高壓滅菌的牛津杯放置其上，加入最佳工藝方案提取且過濾除菌的50 μL 100 mg/mL茶多糖溶液；陽性對照為50 μL 10 μg/mL抗生素環(huán)丙沙星溶液；陰性對照為50 μL無菌蒸餾水。以上試驗組均置于37 ℃培養(yǎng)18～24 h。

1.3.8.2? 供試菌株最低抑菌濃度（MIC）測定。

分別吸取最佳工藝方案提取且過濾除菌的100 μL不同濃度的茶多糖溶液（50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391、0.195）與供試菌液等體積混合；陽性對照組為200 μL供試菌液；陰性對照組為200 μL營養(yǎng)肉湯。以上試驗組均置于37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察并記錄結果，以肉眼觀察未見細菌生長的最低濃度為MIC。

1.4? 數(shù)據(jù)處理

每組試驗隨機重復3次，結果以平均值±標準偏差表示，用Excel 2016軟件作圖。

2? 結果與分析

2.1? 單因素試驗結果

2.1.1? 提取時間對鴨屎香單樅茶多糖提取率的影響。

由圖1可知，提取時間在30～120 min，隨著提取時間的延長，鴨屎香茶多糖得率也逐漸增大，在提取時間為120 min時，得率為5.41%，達到最高，隨著提取時間繼續(xù)延長，得率有下降趨勢，發(fā)現(xiàn)提取時間和得率并不是呈正相關關系。分析可能是由于提取時間延長，增加其他溶解性雜質(zhì)，茶多糖在兩相中的濃度差減小，使得多糖溶解度隨之減小并不再析出，另外，持續(xù)加熱使多糖水解及發(fā)生氧化反應，共同導致多糖提取率下降［26］，因此提取時間為120 min為最佳。

2.1.2? 提取溫度對鴨屎香單樅茶多糖提取率的影響。

從圖2可以看出，提取溫度對鴨屎香茶多糖的提取得率有明顯的影響，提取溫度在50～70 ℃，多糖得率隨著溫度的升高而增大，原因是經(jīng)過超微粉碎的茶粉細胞壁有一定程度的破壞，隨著提取溫度升高細胞壁的破壞程度進一步加劇，而細胞壁的破壞有利于多糖的溶出。提取溫度為70 ℃時，多糖得率達到最大值，為5.44%，提取溫度超過70 ℃，多糖提取得率呈下降趨勢，分析原因可能是溫度過高，提取液中多糖分子受到破壞分解，使多糖得率下降［27］。因此，初步確定提取溫度在70 ℃比較適合。

2.1.3? 提取次數(shù)對鴨屎香單樅茶多糖提取率的影響。

從圖3可見，當提取次數(shù)為2次時，茶多糖提取得率增加了1.03百分點，隨著提取次數(shù)增加，多糖得率沒有明顯變化，原因是多糖的提取量已到達最高值，繼續(xù)增加提取次數(shù)并不會顯著提高得率。從節(jié)約成本和時間方面考慮，選擇提取2次為后續(xù)正交試驗工藝優(yōu)化的中心值。

2.1.4? 料液比對鴨屎香單樅茶多糖提取率的影響。

多糖提取與料液比有密切關系，充足的溶劑量可保證樣品充分浸沒和溶質(zhì)的溶出。從圖4可見，隨著料液比的增加，多糖得率呈先上升后下降的趨勢，并在1∶30時達到最大值（5.42%）。分析原因：在熱量一定情況下，當料液比較低時，固相與液相之間濃度差較小，導致多糖不易浸出；隨溶劑量增多，細胞內(nèi)外的多糖濃度梯度就越大，多糖擴散到溶劑里的含量就隨之增加；但隨著溶劑量繼續(xù)增大，吸附作用增強而導致多糖得率略有下降［28］。因此，多糖提取料液比為1∶30最佳。

2.2? 正交試驗結果

根據(jù)單因素試驗結果，以鴨屎香單樅茶多糖的提取得率為標準，選取提取溫度、提取時間、提取次數(shù)和液料比4個因素進行正交試驗，結果見表2。由表2可知，影響茶多糖得率的因素主次順序為：A（提取時間）>C（提取次數(shù)）>D（料液比）>B（提取溫度）。結合表3可知，提取時間對茶多糖的提取得率影響最為顯著，提取溫度、提取次數(shù)和料液比對茶多糖的影響較小，茶多糖提取的最佳工藝條件為A3B2C2D3，即提取時間為150 min、提取溫度為70 ℃、提取次數(shù)為2次和料液比1∶30。在該工藝條件下進行驗證試驗，重復3次試驗，得到茶多糖提取得率平均值為（6.72±0.21）%。

2.3? 多糖活性

2.3.1? 抗氧化活性。

由圖5a可知，在濃度為100～600 μg/mL，茶多糖和VC對ABTS+自由基均具有很好的清除作用，其中茶多糖的清除能力隨著濃度的升高而增強，清除率由8.04%升高至 82.85%，呈正相關線性關系。相同濃度時，VC溶液清除ABTS+自由基的能力明顯優(yōu)于鴨屎香單樅茶多糖，但隨濃度增加，茶多糖清除ABTS+自由基的能力增加趨勢遠高于VC溶液。從增長趨勢來看，當茶多糖濃度增加到某一值時，其清除ABTS+自由基的能力可能會超過VC溶液，受試驗濃度梯度選取限制這一結論并未得到驗證。茶多糖對ABTS+自由基的IC50為252.03 μg/mL，表明對ABTS+自由基有較好的清除活性。

茶多糖對DPPH的清除率如圖5b所示，鴨屎香單樅茶多糖對DPPH有一定的清除作用，在2～12 mg/mL，隨著濃度的升高，茶多糖對DPPH自由基的清除活性增強，清除率從17.98%上升至82.27%，表現(xiàn)出明顯的濃度依賴關系。低濃度時，茶多糖對DPPH自由基的清除能力明顯弱于VC溶液，但隨著茶多糖濃度升高，對DPPH自由基的清除能力增長率更大。IC50為6.52 mg/mL時，對DPPH自由基有較好的清除活性。

2.3.2? 抑菌活性。

采用濾紙片法將不同濃度的茶多糖對4種供試菌株進行抑制試驗，判定供試菌株對茶多糖的敏感性。以訊數(shù)-抑菌圈（抗生素效價）測量儀（CzoneG67）對抑菌圈直徑進行測量，以抑菌圈直徑的大小作為評價指標。如圖6a所示，50 μL 100 mg/mL茶多糖溶液對4種供試菌種均表現(xiàn)出抑制效果，抑菌圈直徑大小均在11.25～15.36 mm，抑菌圈直徑由大到小表現(xiàn)為金黃色葡萄球菌>白色念珠菌>銅綠假單胞菌>大腸桿菌，得出茶多糖對金黃色葡萄球菌的抑制效果最為明顯，抑菌圈直徑為15.36 mm。茶多糖對4種供試菌株抑制效果均低于抗生素。由于茶多糖對4種供試菌株抑菌圈大小的考察是在同一固定濃度下進行的，而茶多糖對于不同菌株最適的抑菌濃度也有所差異，考慮到試驗的嚴謹性，因此該試驗進一步對供試菌株最低抑菌濃度進行測定。如圖6b所示，對4種菌株的最低抑制濃度分別為3.125～25.000 mg/mL，其中茶多糖對金黃色葡萄球菌的抑菌效果強于另外3種菌株，與抑菌活性結果一致，最低抑菌濃度為3.125 mg/mL。

3? 結論與討論

該研究通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化得到鴨屎香單樅茶多糖提取工藝，得出提取溫度對多糖得率有顯著影響，最佳提取工藝條件：提取時間150 min、提取溫度70 ℃、提取次數(shù)為2次和料液比1∶30，在該提取條件下，鴨屎香單樅茶多糖的平均得率達到6.72%。在一定濃度范圍內(nèi)，鴨屎香茶多糖對ABTS+自由基和DPPH自由基的清除能力與濃度呈正相關，其IC50值分別為252.03 μg/mL和6.52 mg/mL，說明鴨屎香單樅茶多糖具有較好的體外抗氧化活性。抑菌活性試驗得出，鴨屎香單樅茶多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌均有抑制作用，且對金黃色葡萄球菌的抑制效果最佳，對各菌株的最低抑菌濃度測定也驗證了這一結論。該研究為鴨屎香單樅茶多糖的綜合利用及資源開發(fā)提供相關理論參考和科學依據(jù)，使鴨屎香單樅茶多糖在功能性食品中的應用具有較高的可行性，為地方茶類資源的精深加工及高值利用奠定基礎。

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