220份四川小麥條銹病抗性鑒定與評價(jià)

張海鵬，葉雪玲，管方念，黃林玉，李 偉，鄧 梅，魏育明，蔣云峰，陳國躍*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所，成都 611130；2.西南作物基因資源發(fā)掘與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130；3.成都大學(xué)，成都 610106；4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130）

由小麥?；蜅l形柄銹菌（Pucciniastriiformisf.sp.tritici,Pst）引起的小麥（TriticumaestivumL.）條銹病是我國小麥生產(chǎn)上最重要的病害之一，其流行頻率高、發(fā)病范圍廣且危害程度大，嚴(yán)重威脅著我國糧食安全。自1950—2020年間，分別在1950、1964、1990、2002 和2017年共發(fā)生5 次全國性的小麥條銹病大流行。其間，還有多次中等及以下程度或個(gè)別麥區(qū)條銹病偏重流行。近期如2020年全國小麥條銹病中度流行，在包括陜、鄂、豫南麥區(qū)在內(nèi)的11 個(gè)省區(qū)偏重發(fā)生，據(jù)統(tǒng)計(jì)，當(dāng)年全國發(fā)病面積439.52 hm2，造成小麥減產(chǎn)2.49 億kg[1-3]?？v觀我國小麥條銹病歷次大流行的歷史，造成小麥條銹病大流行的主要原因是新的條銹菌毒性小種發(fā)展為優(yōu)勢小種、主栽品種抗病性喪失抗性、感病品種大面積種植。近年來，隨著強(qiáng)毒性條銹菌生理小種條中34號（CYR34）的出現(xiàn)及流行頻率的逐年增高，導(dǎo)致以川麥42、貴農(nóng)21和南農(nóng)92R作為骨干親本的抗源（Yr10、Yr24/Yr26/YrCH42）喪失抗性，標(biāo)志著小麥生產(chǎn)上又一次品種更替的開始[4-5]。迄今為止，已有86個(gè)抗條銹病基因（Yr1-Yr86）被正式命名，另外還有100 余個(gè)臨時(shí)命名基因和超過300 個(gè)控制小麥抗條銹病QTLs 被定位[6-10]，但僅有少數(shù)主效抗性基因或QTL 被實(shí)際應(yīng)用于小麥抗病育種[4,11]。在國際正式命名的Yr基因中，目前在小麥生產(chǎn)上僅Yr5、Yr15和Yr61等少數(shù)全生育期抗性基因?qū)ξ覈←湕l銹菌流行小種或致病類群表現(xiàn)良好抗性。品種抗病性喪失既是一個(gè)重大科學(xué)問題，也是一個(gè)亟待解決的生產(chǎn)實(shí)際問題[12]。因此，針對當(dāng)前小麥生產(chǎn)上流行的條銹菌生理小種或致病類群，明確小麥種質(zhì)資源抗性水平及抗性基因布局，為育種家提供有效抗源并對高效、合理、可持續(xù)性利用小麥條銹病抗性，在生產(chǎn)上為實(shí)現(xiàn)多基因布局提供參考。四川作為西南麥區(qū)小麥種植面積最大的麥區(qū)，是我國小麥條銹菌最重要的秋季、春季菌源區(qū)及春季流行區(qū)之一，也是我國小麥條銹菌最關(guān)鍵的易變區(qū)和新小種策源地之一。因此，控制四川麥區(qū)條銹病的發(fā)生和流行成為保障我國西南，乃至全國小麥安全生產(chǎn)的關(guān)鍵。

本研究擬利用當(dāng)前四川麥區(qū)小麥生產(chǎn)上條銹病流行強(qiáng)毒性優(yōu)勢小種CYR34 及由CYR32、CYR33、CYR34、Sull-4、Sull-5、Sull-7 和G22-14 組成的混合生理小種對220 份四川小麥（包括150 份1997—2016年間育成品種、70 份農(nóng)家種）分別進(jìn)行室內(nèi)苗期和田間成株期條銹病抗性表型鑒定；同時(shí)，結(jié)合已知條銹病抗性基因Yr5、Yr10、Yr15、Yr17、Yr18、Yr24/26、Yr41和Yr48緊密連鎖或功能標(biāo)記進(jìn)行分子檢測，明確四川小麥對當(dāng)前流行條銹病生理小種或致病類群的抗性水平和抗條銹病基因分布，為四川麥區(qū)合理利用條銹病抗源提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

220 份四川小麥種質(zhì)，包括150 份1997—2016年間四川育成品種、70份四川農(nóng)家種70份（附表）；8 份已知條銹病抗性基因載體材料，包括AvSYr5NIL、AvSYr10NIL、AvSYr15NIL、AvSYr17NIL、AvSYr18NIL、AvSYr26NIL、CN19（Yr41）和PI 610750（Yr48）等作為抗條銹病基因分子檢測的陽性對照，Avocet S 作為陰性對照；銘賢169 作為室內(nèi)苗期鑒定條銹菌誘發(fā)和感病對照；SY95-71 和Avocet S 分別作為田間成株期條銹病鑒定誘發(fā)行和感病對照品種。上述種質(zhì)均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所收集保存。苗期采用條銹菌單小種CYR34 接種鑒定，成株期則為CYR32、 CYR33、 CYR34、 Sull-4、 Sull-5、 Sull-7和G22-14等量組成的混合菌。上述條銹菌均由甘肅農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所賈秋珍研究員提供。

1.2 室內(nèi)苗期和成株期條銹病表型抗性鑒定

苗期條銹病鑒定在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所病害鑒定溫室進(jìn)行。將供試小麥種質(zhì)播種于育苗盒內(nèi)，每個(gè)育苗盒播種5～10粒，在光照16 h/d，黑暗8 h/d 條件下培養(yǎng)至二葉一心，室內(nèi)溫度為15～18 ℃。將活化好的條銹菌孢子充分混勻于異構(gòu)十二烷中，采用噴接法均勻噴灑在植株葉片表面，置于低溫（8～10 ℃）高濕（濕度85%～95%）的接種培養(yǎng)箱中，黑暗條件下培養(yǎng)24 h 后轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱（15～18 ℃光照16 h/d，10～12 ℃黑暗8 h/d）中生長。待感病對照品種銘賢169充分發(fā)病時(shí)按照0～9級反應(yīng)型（infection type，IT）劃分標(biāo)準(zhǔn)[13]進(jìn)行條銹病苗期表型鑒定。其中，0～3 級為高度抗病（high resistance,HR），4～6 級為中度抗病(moderate resistance,MR)，7 級為中度感?。╩oderat susceptible,MS），8～9級為高度感?。╤igh susceptible,HS）。

于2016年10月中下旬分別在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)溫江小麥條銹病鑒定圃（成都溫江區(qū)，17WJ）、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)崇州小麥條銹病鑒定圃（成都崇州市，17CZ）及綿陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥條銹病鑒定圃（四川綿陽，17MY）進(jìn)行成株期表型鑒定材料播種工作。每份種質(zhì)3 行區(qū)，田間播種采取單粒點(diǎn)播，行長2 m，行距0.3 m，每行種植20粒種子，株距0.1 m，間隔20行區(qū)設(shè)置1行Avocet S感病對照；行區(qū)四周播種2行感病材料SY95-71作條銹菌誘發(fā)行。次年1月中旬采用涂抹法在誘發(fā)材料SY95-71倒數(shù)第二葉中部接種混合菌種，待3月下旬至4月中上旬感病對照Avocet S充分發(fā)病后，調(diào)查成株期條銹病反應(yīng)型和嚴(yán)重度（disease severity,DS）。反應(yīng)型調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)參照R.F.Line等[13]，反應(yīng)型抗感分級標(biāo)準(zhǔn)參照苗期劃分。嚴(yán)重度是指病原菌孢子堆占整個(gè)葉片面積的百分?jǐn)?shù)，調(diào)查方法參照小麥條銹病測報(bào)技術(shù)規(guī)范[14]，按照0、1%、5%、10%、20%、40%、60%、80%和100%分級記錄。其中，高抗（0≤DS≤20%）、中抗（20%

1.3 已知條銹病抗性基因特異分子標(biāo)記檢測

采用改良的CTAB 法[15]提取基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質(zhì)量以及超微量分光光度計(jì)測定DNA 濃度和純度，用超純水將DNA 原液稀釋至100 ng/μL。利用已知條銹病抗性基因Yr5[16]、Yr10[17-18]、Yr15[19-20]、Yr17[21]、Yr18[22-23]、Yr24/26[24-25]、Yr41[26]和Yr48[27]的功能標(biāo)記或緊密連鎖分子標(biāo)記進(jìn)行檢測。DNA 分子標(biāo)記引物由北京擎科生物科技有限公司成都分公司合成。利用熒光定量PCR 儀（CFX96 Touch，美國Bio-Rad）進(jìn)行Yr18的KASP標(biāo)記基因分型，其余特異標(biāo)記通過瓊脂糖或6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 苗期條銹病抗性表型鑒定

室內(nèi)苗期鑒定結(jié)果顯示，220 份四川小麥種質(zhì)中，共56份種質(zhì)表現(xiàn)出抗性（IT≤6），包括27份農(nóng)家種和29 份育成品種。其中，29 份種質(zhì)對CYR34 苗期表現(xiàn)為高抗（IT≤3），包括16 份農(nóng)家種和13 份育成品種。

2.2 成株期條銹病抗性表型鑒定

利用混合菌種進(jìn)行人工誘發(fā)，在多個(gè)環(huán)境點(diǎn)對220 份種質(zhì)進(jìn)行成株期條銹病抗性表型鑒定。在17CZ 鑒定圃，136 份種質(zhì)（61.82%）表現(xiàn)出成株期抗性（IT≤6，DS≤60%），包括52 份農(nóng)家種和84 份育成品種；在17MY鑒定圃，共154份種質(zhì)（70.00%）表現(xiàn)出成株期抗性，包括60份農(nóng)家種和94份育成品種；在17WJ鑒定圃，共108份種質(zhì)（49.09%）表現(xiàn)出成株期抗性，包括48份農(nóng)家種和60份育成品種。綜合3個(gè)鑒定圃抗性鑒定結(jié)果，93份種質(zhì)表現(xiàn)出穩(wěn)定成株期抗性，包括40份農(nóng)家種和53份育成品種。3個(gè)環(huán)境中表現(xiàn)穩(wěn)定高抗（IT≤3，0≤DS≤20%）的種質(zhì)共51份，包括19份農(nóng)家種和32份育成品種。

2.3 抗條銹病表型綜合評價(jià)

綜合苗期和成株期條銹病表型鑒定結(jié)果，25份種質(zhì)在苗期和成株期均表現(xiàn)出穩(wěn)定抗性，包括13份農(nóng)家種和12 份育成品種。其中有9 份種質(zhì)表現(xiàn)出穩(wěn)定高抗水平，包括6 份農(nóng)家種（開江白麥子、安岳紅小麥、灌縣白花干麥兒子2、酉陽光頭、江油露山麥和白玉小麥）和3份育成品種（西昌19、綿麥45和昌麥28），這些種質(zhì)可進(jìn)一步用于小麥生產(chǎn)，并作為小麥抗病育種的親本資源。

2.4 抗條銹病基因檢測結(jié)果

以Avocet S和相應(yīng)基因載體分別作為陰性對照和陽性對照，分別使用8個(gè)Yr基因的連鎖標(biāo)記或功能標(biāo)記對220 份四川小麥進(jìn)行分子檢測。結(jié)果顯示，所有供試種質(zhì)中均未檢測到Y(jié)r5和Yr15，僅在少數(shù)種質(zhì)中檢測到Y(jié)r10和Yr48，Yr17、Yr18、Yr24/26和Yr41被檢測到的頻率較高（表1），其中Yr17和Yr24/26分別只在35和72份育成品種中檢測到。共計(jì)66份種質(zhì)中檢測到Y(jié)r18，但大部分為農(nóng)家種，僅包含3份育成品種（圖1）。37 份種質(zhì)檢測到Y(jié)r41，包括7份農(nóng)家種和30份育成品種。

圖1 利用Yr18的連鎖標(biāo)記csLV34檢測14份種質(zhì)Figure 1 Detection of Yr18 in fourteen wheat germplasms by using the linked marker csLV34

表1 Yr基因在四川小麥中的分布Table 1 The distribution of each Yr gene in Sichuan wheat

此外，32份種質(zhì)未檢測到本研究中的任何Yr基因，包括8 份苗期抗性種質(zhì)、14 份成株期抗性種質(zhì)（包括9 份表現(xiàn)為穩(wěn)定高抗：川農(nóng)17、綿陽35、西昌19、昌麥26、川麥48、昌麥28、川輻8 號、川育26 和科成麥5 號）及苗期和成株期均表現(xiàn)抗病的4 份種質(zhì)（川農(nóng)17、西昌19、昌麥28 和昌麥33）在內(nèi)的32份四川小麥均未檢測到供試Yr基因，推測這些種質(zhì)可能含有其他已知或未知的Yr基因。已知基因分子檢測還發(fā)現(xiàn)，10 份農(nóng)家種和31 份育成品種攜帶兩個(gè)及以上Yr基因（附表）。

3 討論

四川是我國條銹菌新小種的策源地之一，生產(chǎn)上大部分重要條銹菌生理小種的產(chǎn)生和流行均與該麥區(qū)有關(guān)[1,28-30]。因此，明確四川麥區(qū)育成品種的條銹病抗性及抗性基因的分布對于進(jìn)一步開展小麥條銹病抗性育種具有重要意義。本研究利用當(dāng)前小麥生產(chǎn)上條銹病流行強(qiáng)毒性優(yōu)勢小種CYR34及由CYR32、CYR33、CYR34、Sull-4、Sull-5、Sull-7和G22-14 組成的混合生理小種對220 份四川小麥（包括150 份1997—2016年間育成品種、70 份農(nóng)家種）分別進(jìn)行室內(nèi)苗期和田間成株期條銹病抗性表型鑒定。結(jié)果顯示，56 份種質(zhì)（25.45%）苗期對CYR34 表現(xiàn)出抗性，93 份成株期（42.27%）對包含CYR34在內(nèi)的混合生理小種具有穩(wěn)定抗性。其中，29份育成種質(zhì)表現(xiàn)苗期抗性、53份表現(xiàn)出成株期抗性；而在供試農(nóng)家種中，27份表現(xiàn)苗期抗性、40份表現(xiàn)出穩(wěn)定成株期抗性。上述抗性種質(zhì)為小麥條銹病抗性基因發(fā)掘及育種提供了可用的基因源。

基于Yr基因分子緊密連鎖/功能標(biāo)記對四川小麥進(jìn)行分子檢測發(fā)現(xiàn)，來自四川麥區(qū)的農(nóng)家種與育成品種中Yr基因的分布差異顯著。Yr18是一個(gè)成株期條銹病持久抗性基因，其育種應(yīng)用在全球已有超過百年歷史。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在四川小麥中絕大部分農(nóng)家種質(zhì)（90%）均攜帶了Yr18；但有意思的是，在1997—2016年間四川育成種質(zhì)中，僅發(fā)現(xiàn)3個(gè)品種（綿陽33、西輻14和川育21）攜帶Yr18。上述研究結(jié)果與前人研究基本一致[31-34]，表明該基因鮮有在四川小麥條銹病抗性育種利用。Yr17來自偏凸山羊草，其最早可追溯到20世紀(jì)80年代通過引進(jìn)墨西哥小麥品種而被廣泛應(yīng)用到四川小麥育種中[35]，該基因?qū)Ξ?dāng)前我國流行的優(yōu)勢小種CYR34已喪失抗性。特異標(biāo)記分子檢測發(fā)現(xiàn)，所有供試農(nóng)家種均未發(fā)現(xiàn)攜帶Yr17；約23.33%的四川育成品種（35份）檢測到攜帶該基因。結(jié)合抗性表型分析發(fā)現(xiàn)，僅攜帶Yr17的育成品種中，4份表現(xiàn)苗期抗性，推測這些育成品種可能其他已知或未知的抗性基因。由普通小麥-簇毛麥育成的92R 易位系攜帶苗期抗性基因Yr24/26，該基因被廣泛用于四川小麥育種。2009年強(qiáng)毒性條銹菌生理小種CYR34的出現(xiàn)導(dǎo)致以Yr24/26作為主要抗源的川育、川麥和貴農(nóng)系普遍喪失抗性[4-5]。本研究從150 份育成種質(zhì)中共檢測到72 份品種攜帶Yr24/26，占比高達(dá)48%，表明在1997—2016年間四川條銹病抗性育種應(yīng)用中，以攜帶Yr24/26的抗源占據(jù)主導(dǎo)地位。Yr41來自于四川小麥育成品種川農(nóng)19，并認(rèn)為該基因?qū)Ξ?dāng)前我國小麥生產(chǎn)上流行的主要生理小種CYR31、CYR32 和CYR33 等均具有抗性[36]，但CYR34 對其具有毒性。以川農(nóng)19為抗源，育成了包括川農(nóng)26、川農(nóng)27和渝麥13 等一系列抗條銹病新品種[37]。本研究基于Yr41特異分子跟蹤標(biāo)記檢測發(fā)現(xiàn)，該抗源被四川麥區(qū)多家育種單位廣泛應(yīng)用。利用該抗源特異分子標(biāo)記進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)在1997—2016年間育成品種中，共發(fā)現(xiàn)30 個(gè)小麥品種攜帶Yr41；同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)該基因存在部分四川農(nóng)家種中。結(jié)合抗性表型分析發(fā)現(xiàn)，僅攜帶Yr41的8份四川小麥中，2份種質(zhì)表現(xiàn)出苗期抗性、1份種質(zhì)表現(xiàn)出成株期抗性，這些抗性種質(zhì)很可能聚合了其他抗性位點(diǎn)。Yr48來自于墨西哥六倍體春小麥PI610750，目前在中國麥區(qū)仍然具有抗性[26,38]。在四川小麥中共發(fā)現(xiàn)20 份種質(zhì)攜帶Yr48，包括8 份農(nóng)家種和12 份育成品種；令人疑惑的是，結(jié)合表型發(fā)現(xiàn)其中13份種質(zhì)表現(xiàn)不同程度的感病，其原因有待進(jìn)一步研究。Yr10來自于小麥品種Moro，對當(dāng)前流行生理小種CYR34 已失去抗性[13,39]。分子檢測發(fā)現(xiàn)，該基因僅存在于2 份（川農(nóng)11和川農(nóng)18）育成品種中，表明在1997—2016年間已很少利用該基因作為抗源應(yīng)用到四川小麥抗病育種中。Yr5和Yr15分別來源于小麥野生近緣種斯卑爾脫小麥（TriticumspeltaL.）和野生二粒小麥（TriticumdicoccoidesL.），對當(dāng)前世界范圍內(nèi)絕大多數(shù)條銹菌生理小種均表現(xiàn)為高抗或近免疫[40-41]，也是少數(shù)對當(dāng)前中國麥區(qū)流行的條銹菌生理小種具有抗性的Yr基因。習(xí)玲等[42]對2016年以來育成的78 個(gè)四川小麥品種（系）進(jìn)行條銹病抗性基因檢測發(fā)現(xiàn)，包括綿麥538、西科麥557、蜀麥1829、蜀麥1868 及川麥1747 等5 個(gè)小麥品種攜帶了Yr15。本研究利用Yr15功能標(biāo)記對1997—2016年間四川育成種質(zhì)進(jìn)行檢測，并未發(fā)現(xiàn)這一時(shí)期育成品種攜帶該基因。上述研究結(jié)果表明，在四川麥區(qū)對Yr15的育種利用起始于近年，可能與條銹菌新小種CYR34的出現(xiàn)與流行有關(guān)。和前人研究結(jié)果一致，本研究也未發(fā)現(xiàn)來自于斯卑爾脫小麥全生育期條銹病抗性基因Yr5在四川育種中的利用[43]。

培育持久抗病種質(zhì)是除產(chǎn)量相關(guān)性狀外育種家的首要目標(biāo)。如何利用有限的抗源提高作物持久抗病能力是當(dāng)前抗病育種的重點(diǎn)。但回顧這些研究表明，Yr基因的金字塔化部署（將多個(gè)基因聚合在同一品種）時(shí)可能更持久[44-45]。實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)用Yr基因豐富程度越高，條銹菌選擇壓力越小，變異產(chǎn)生新的毒性生理小種概率越小。但在抗病基因聚合時(shí)，需要提前了解聚合基因的田間實(shí)際表現(xiàn)，否則可能面對諸如基因之間上位效應(yīng)、基因型與環(huán)境互作影響抗性表達(dá)和抗性基因相關(guān)的生理成本等問題[46]。