結(jié)核分枝桿菌GroEL2蛋白表達(dá)、純化及生物信息學(xué)分析

宋亞敏,魏 婧,郭方正,李柏青,3,許 濤,4#,汪洪濤,3*

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,蚌埠 233030;2蚌埠醫(yī)學(xué)院慢性疾病免疫學(xué)基礎(chǔ)與臨床安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3蚌埠醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室;4蚌埠醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教研室;*通訊作者,E-mail：hongtaowang@bbmc.edu.cn;#共同通訊作者,E-mail：taoxu@bbmc.edu.cn)

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)是引起結(jié)核病(tuberculosis,TB)的病原體,是單一傳染性病原體致死的主要原因之一。在2019冠狀病毒病(COVID-19)影響下,全球TB死亡病例持續(xù)增加[1]。盡管對(duì)新型TB診斷試劑和疫苗的開(kāi)發(fā)從未中斷,但它仍是全球公共衛(wèi)生的重大負(fù)擔(dān)。

GroEL2屬于熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)家族,是一類典型的伴侶蛋白(chaperone,Cpn)[2,3],其位于GroE操縱子外部的myc28基因上[4]。GroEL2蛋白能夠提高細(xì)菌的適應(yīng)能力[5],與Mtb的致病性緊密相關(guān)[6],并介導(dǎo)Mtb與巨噬細(xì)胞的黏附[7,8],協(xié)助細(xì)菌進(jìn)入宿主細(xì)胞,在應(yīng)激刺激下產(chǎn)生增加以保護(hù)細(xì)胞[9]。雖然GroEL2在Mtb感染過(guò)程中十分重要,但對(duì)其的研究還未完全明晰。為此,本研究對(duì)GroEL2蛋白進(jìn)行原核表達(dá)、純化和生物信息學(xué)分析,為GroEL2在感染中發(fā)揮的作用以及作為疫苗候選蛋白、診斷抗原開(kāi)發(fā)的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

pET-28a和MtbH37Ra基因組DNA由慢性疾病免疫學(xué)基礎(chǔ)與臨床安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存;大腸桿菌克隆菌株DH5α、表達(dá)菌株BL21(DE3)、瓊脂糖凝膠回收和質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;Ni-IDA親和層析柱購(gòu)自德國(guó)Novagen公司;SDS-PAGE凝膠試劑盒、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜、His-tag小鼠單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;NcoⅠ和XhoⅠ購(gòu)自日本TaKaRa公司;ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit和DNA Polymerase購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司;IPTG購(gòu)自德國(guó)Sigma-Aldrich公司;其余普通試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 GroEL2基因擴(kuò)增及重組質(zhì)粒pET-28a-GroEL2的構(gòu)建 通過(guò)https：//www.uniprot.org/uniprot/獲取MtbH37Ra的GroEL2基因(MRA_0445)序列,設(shè)計(jì)引物序列如下：上游引物GroEL2-F：5′-AAGAAGGAGATATACCATGGGCATGGCCAAGACA-ATTGCGTACG-3′(下劃線為NcoⅠ酶切位點(diǎn)),下游引物GroEL2-R：5′-TGGTGGTGGTGGTGCTCGAG- GAAATCCATGCCACCCATGTC-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn)),PCR擴(kuò)增GroEL2基因。以MtbH37Ra株基因組DNA為模板,用引物對(duì)GroEL2-F/GroEL2-R擴(kuò)增GroEL2基因,反應(yīng)體系如下：2×Max Buffer 12.5 μl,dNTPs 0.5 μl,DNA Polymerase 0.5 μl,上、下游引物各0.5 μl,模板1 μl,補(bǔ)ddH2O至25 μl。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸2 min,共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收目的基因。

用NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切pET28a載體,獲得線性pET-28a,然后將GroEL2基因與線性pET-28a同源重組克隆。反應(yīng)體系如下：線性pET-28a 5.5 μl、GroEL2擴(kuò)增產(chǎn)物1.5 μl、5×CE Ⅱ Buffer 2 μl、Exnase Ⅱ 1 μl,37 ℃,水浴反應(yīng)30 min。取重組產(chǎn)物5 μl轉(zhuǎn)化至DH5α中,陽(yáng)性克隆菌落用T7/T7 ter引物對(duì)進(jìn)行菌落PCR鑒定,將鑒定正確的重組pET-28a-GroEL2載體進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.2 GroEL2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定 將測(cè)序正確的重組pET-28a-GroEL2載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3),挑取陽(yáng)性菌落接種至LB(Kan+)液體培養(yǎng)基,37 ℃,振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日以1∶100比例擴(kuò)大培養(yǎng)至100 ml LB(Kan+)液體培養(yǎng)基,當(dāng)OD600 nm為0.6～0.8時(shí),加入IPTG(終濃度為0.2 mmol/L),37 ℃過(guò)夜震蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)。收集菌體離心后加6 ml裂解液(20 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L苯甲酰磺酰氟)超聲破碎,離心收集上清及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析,電泳樣本孔配置：泳道1為pET28a誘導(dǎo)(空載),泳道2為pET-28a-GroEL2未誘導(dǎo),泳道3為pET-28a-GroEL2誘導(dǎo)后,泳道4為pET-28a-GroEL2誘導(dǎo)破碎后上清,泳道5為pET-28a-GroEL2誘導(dǎo)破碎后沉淀,以此進(jìn)行表達(dá)鑒定。而后將超聲破碎后的上清溶液利用Ni-IDA鎳親和層析柱純化,經(jīng)Ni-IDA Washing-Buffer(20 mmol/L Tris-HCl,0.5 mol/L NaCl,10 mmol/L咪唑)沖洗后,用Ni-IDA Elution-Buffer(20 mmol/L Tris-HCl,0.5 mol/L NaCl,500 mmol/L咪唑)洗脫目的蛋白。將上述洗脫蛋白溶液放入透析袋中,加入PBS 4 ℃,透析過(guò)夜,得到GroEL2純化蛋白。12% SDS-PAGE電泳分析蛋白純度,并濕轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,經(jīng)TBST緩沖液洗滌3次后,以小鼠his-tag單克隆抗體為一抗(稀釋比例1∶1 000),4 ℃孵育過(guò)夜,HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗(稀釋比例1∶1 000)室溫孵育2 h,經(jīng)TBST洗滌3次,加入ECL蛋白發(fā)光液避光顯影進(jìn)行Western blot鑒定,拍照、分析結(jié)果。

1.2.3 GroEL2蛋白的生物信息學(xué)分析 從Uniprot獲取MRA_0445基因編碼的GroEL2蛋白的氨基酸序列(https：//www.uniprot.org/uniprotkb/A5TZG6/entry),將GroEL2蛋白序列與結(jié)核分枝桿菌群、麻風(fēng)分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌、人類熱休克蛋白序列進(jìn)行同源分析(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi);Expasy ProtParam分析GroEL2蛋白的分子質(zhì)量、穩(wěn)定系數(shù),親/疏水性等理化性質(zhì)(https：//web.expasy.org/protparam/);利用TMHMM server v.2.0分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)(https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/);SignalP 5.0分析信號(hào)肽(https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/);PSORT預(yù)測(cè)該蛋白亞細(xì)胞定位(https：//www.psort.org/);采用NetPhos 3.1 Server分析蛋白的磷酸化位點(diǎn)(https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/);NetNGly1.0和NetOGlyc4.0軟件分析糖基化位點(diǎn)(https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetNGlyc-1.0/;https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetOGlyc-4.0/);SOPMA和Phyre 2分析二級(jí)結(jié)構(gòu)并建立三維模型(https：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html;http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2);String分析蛋白相互作用及GO注釋分析其生物學(xué)作用(https：//string-db.org),使用GraphPad對(duì)GO注釋分析進(jìn)行可視化;ABCpred和SYFPEITHI分析蛋白的B、T細(xì)胞抗原表位(http：//crdd.osdd.net/raghava/abcpred;http：//www.syfpeithi.de/)。

2 結(jié)果

2.1 GroEL2基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒pET-28a-GroEL2的構(gòu)建與鑒定

擴(kuò)增結(jié)果顯示,GroEL2基因在約1 620 bp處有一條特異性片段,與預(yù)期一致(見(jiàn)圖1A)。菌落PCR鑒定結(jié)果顯示,在2 000 bp左右大小位置有特異性條帶,與預(yù)測(cè)相符(見(jiàn)圖1B)。測(cè)序結(jié)果顯示,插入基因片段與GroEL2基因序列100%一致(見(jiàn)圖1C)。

圖1 GroEL2基因擴(kuò)增及重組質(zhì)粒pET-28a-GroEL2的鑒定Figure 1 Amplification of GroEL2 gene and identification of recombinant plasmid pET-28a-GroEL2

2.2 GroEL2蛋白的表達(dá)

SDS-PAGE電泳分析GroEL2蛋白在感受態(tài)細(xì)胞中的誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果顯示GroEL2蛋白主要在上清中表達(dá)(見(jiàn)圖2)。

圖2 GroEL2重組蛋白SDS-PAGE電泳分析 Figure 2 SDS-PAGE electrophoresis of GroEL2 recombinant protein

2.3 GroEL2蛋白的純化和鑒定

收集超聲破碎后離心的上清進(jìn)行純化,結(jié)果顯示在60 kD處有一條清晰單一條帶(見(jiàn)圖3A),純度達(dá)90%以上;Western blot分析顯示,在相對(duì)分子質(zhì)量約60 kD大小位置處可見(jiàn)清晰單一條帶(見(jiàn)圖3B)。

圖3 純化GroEL2蛋白SDS-PAGE電泳及Western blot鑒定Figure 3 SDS-PAGE electrophoresis and Western blot identification of purified GroEL2 protein

2.4 GroEL2蛋白的生物信息學(xué)分析

2.4.1 同源性分析 BLAST序列對(duì)比中E值越小表明可信度越高,Per.Ident則為序列對(duì)比的一致性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的蛋白與Mtb復(fù)合群(包括人型Mtb、牛型Mtb、減毒牛型Mtb等)的同源性為100%,與機(jī)會(huì)致病分枝桿菌同源性稍有降低,與人類蛋白僅有46.97%的同源性(見(jiàn)表1)。

表1 GroEL2蛋白Blast分析

2.4.2 理化性質(zhì)及親/疏水性 Expasy ProtParam軟件分析,GroEL2蛋白的分子式C2489H4130N684O804S7,相對(duì)分子質(zhì)量為56 726.69,理論等電點(diǎn)(pI)為4.85,共有540個(gè)氨基酸,由19種氨基酸組成(見(jiàn)圖4)。不穩(wěn)定指數(shù)為28.87(<40),推測(cè)其為穩(wěn)定性蛋白。親疏水性分析中正值表示疏水性,負(fù)值表示親水性,總平均親水性則為序列中所有氨基酸親水值的總和與氨基酸數(shù)量的比值,負(fù)值越大表示親水性越強(qiáng),正值越大表示疏水性越強(qiáng)。該蛋白總平均親水性為-0.091,親水氨基酸明顯多于疏水(見(jiàn)圖5)。

圖4 GroEL2蛋白氨基酸組成及占比Figure 4 Amino acid composition and percentage of GroEL2 protein

圖5 GroEL2蛋白親/疏水性分析Figure 5 Analysis of the hydrophilic/hydrophobicity of the GroEL2 protein

2.4.3 跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位 利用TMHMM server v.2.0對(duì)GroEL2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)的分析,顯示GroEL2蛋白無(wú)跨膜區(qū)(見(jiàn)圖6)。SignalP 5.0預(yù)測(cè)該蛋白信號(hào)肽結(jié)構(gòu),根據(jù)信號(hào)肽酶Ⅰ(Lep)參與切割的分泌信號(hào)肽通路、Lep參與切割的雙精氨酸轉(zhuǎn)移通路、信號(hào)肽酶Ⅱ(Lsp)參與切割的分泌信號(hào)肽通路分析,顯示GroEL2蛋白無(wú)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖7)。而PSORT分析出該蛋白亞細(xì)胞定位,其定位于細(xì)胞質(zhì)概率最高,為60.9%,定位于細(xì)胞核和線粒體的概率則為26.1%和13.0%。

2.4.4 翻譯后修飾位點(diǎn) 通過(guò)NetPhos 3.1 Server對(duì)GroEL2蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析,該蛋白可能存在35個(gè)磷酸位點(diǎn),其中磷酸化絲氨酸為15個(gè),磷酸化蘇氨酸為15個(gè),磷酸化酪氨酸為5個(gè)(見(jiàn)圖8)。利用NetNGly軟件分析糖基化位點(diǎn),結(jié)果顯示其第328和528位氨基酸存在2個(gè)O-糖基化潛在位點(diǎn),得分分別為0.56和0.83(>0.5)。

圖8 GroEL2蛋白磷酸化位點(diǎn)分析Figure 8 Analysis of GroEL2 protein phosphorylation sites

2.4.5 蛋白結(jié)構(gòu) 采用SOPMA軟件對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,其中α螺旋(Hh)結(jié)構(gòu)288個(gè)(53.33%),占比最高,無(wú)規(guī)卷曲(Cc)結(jié)構(gòu)142個(gè)(26.30%),延伸鏈(Ee)結(jié)構(gòu)66個(gè)(12.22%),β-轉(zhuǎn)角(Tt)結(jié)構(gòu)44個(gè)(8.15%)(見(jiàn)圖9)。用SWISS-MODEL進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)建模(見(jiàn)圖10),其與模板4v4o.1.A的結(jié)構(gòu)相似性為65.86%,GMQE得分反映了模型預(yù)期準(zhǔn)確性,得分區(qū)間為0～1,分?jǐn)?shù)越高可靠性越高,此建模GMQE指數(shù)為0.83,表明建?？尚哦容^高。

圖10 GroEL2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)建模Figure 10 Modelling of GroEL2 protein tertiary structure

2.4.6 蛋白相互作用及GO注釋分析 String分析顯示,GroEL2蛋白與GroEL1、GroES、DnaK、DnaJ1、DnaJ2、HtpG、GrpE、RpoB、HycE、EsxA蛋白存在相互作用(見(jiàn)圖11)。GO注釋分析該蛋白為ATP依賴性蛋白折疊伴侶,可與未折疊蛋白結(jié)合,參與蛋白質(zhì)的折疊與再折疊(見(jiàn)圖12)。

2.4.7 抗原表位 ABCpred通過(guò)將目的蛋白分割成固定長(zhǎng)度(默認(rèn)為16個(gè))的氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的B細(xì)胞抗原表位對(duì)比,得分區(qū)間為0～1,越接近1代表相似度越高,對(duì)GroEL2蛋白序列進(jìn)行預(yù)測(cè),研究?jī)H選取分值高于0.8的結(jié)果,展示出19個(gè)可能形成B細(xì)胞抗原表位的區(qū)域(見(jiàn)表2)。采用SYFPEITHI軟件分析T細(xì)胞抗原表位,設(shè)定MHC類型為HLA-A*02：01,選取不低于25分的結(jié)果,展示11個(gè)可能為T細(xì)胞抗原表位的氨基酸序列區(qū)域(見(jiàn)表3)。

圖11 GroEL2相互作用蛋白Figure 11 GroEL2-interacting proteins

圖12 GroEL2蛋白GO注釋分析Figure 12 GO annotation analysis of GroEL2 protein

3 討論

WHO報(bào)告顯示全球TB潛伏感染人群近20億,因TB死亡的患者是艾滋病毒(human immunodeficiency virus,HIV)相關(guān)死亡人數(shù)的兩倍以上,COVID-19大流行更對(duì)結(jié)核病診斷和治療產(chǎn)生破壞性影響[1]。新型TB疫苗尚處于研究階段,耐多藥/廣泛耐藥TB以及結(jié)核病與HIV或非傳染性疾病并存,引起治療持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、治療效果差的現(xiàn)狀使TB治療面臨許多挑戰(zhàn)[10,11]。迫切需要在早期快速診斷、改善治療效果和預(yù)防方面進(jìn)行創(chuàng)新。

GroEL2并不形成Cpn典型的十四聚體雙環(huán)結(jié)構(gòu),它在體內(nèi)和體外都表現(xiàn)為二聚體,這種二聚體形式不僅提供了普遍分子伴侶活性所需的游離頂端結(jié)構(gòu)域,可能還參與Mtb與巨噬細(xì)胞的結(jié)合[12,13],在宿主低代謝時(shí)期(如饑餓、營(yíng)養(yǎng)不良)Mtb小RNA F6在伴侶蛋白GroEL2和GroES的幫助下,介導(dǎo)病菌在宿主肉芽腫內(nèi)持久性的生存[14]。另一方面GroEL2蛋白也被證明是有效的T細(xì)胞刺激因子,而且其表面暴露的疏水區(qū)也可以與肽類抗原相結(jié)合,有助于免疫原性肽的呈遞,這也可能使它能夠扮演雙重角色,既作為有效的免疫刺激分子,也可以做免疫原性肽的載體[12,15]。

表2 ABCpred分析GroEL2蛋白B細(xì)胞抗原表位

表3 SYFPEITHI分析GroEL2蛋白T細(xì)胞抗原表位

本實(shí)驗(yàn)將擴(kuò)增的GroEL2基因克隆至pET-28a載體,成功構(gòu)建重組pET-28a-GroEL2載體,在大腸桿菌中以可溶性表達(dá),純化后獲得高純度GroEL2蛋白。生物信息學(xué)分析顯示,GroEL2蛋白為親水性、穩(wěn)定性蛋白,這與原核表達(dá)中以可溶性形式存在GroEL2蛋白一致。研究表明,蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白質(zhì)和細(xì)胞功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,可影響蛋白酶活性、蛋白構(gòu)象、蛋白相互作用等細(xì)胞生命活動(dòng)過(guò)程[16,17]。GroEL2蛋白存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn),說(shuō)明其可能參與調(diào)控細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示α-螺旋在二級(jí)結(jié)構(gòu)中占53.33%,α-螺旋為保守序列,在蛋白模組中起重要作用,表明該蛋白可能具有功能性。不規(guī)則卷曲也為蛋白質(zhì)的重要功能區(qū)域,這種結(jié)構(gòu)相對(duì)松散,能夠進(jìn)行扭曲、變形,可有效與配體結(jié)合,易于抗原表位的形成,該蛋白無(wú)規(guī)則卷曲含量相對(duì)較高,也表明蛋白較容易與抗體嵌合,從而發(fā)揮抗原作用[18],不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的含量相對(duì)較高,進(jìn)一步佐證蛋白可能為重要的功能蛋白。另外B細(xì)胞抗原表位多為一類連續(xù)排列或間斷存在的多肽或多糖在空間上形成特定構(gòu)象的構(gòu)象表位,含有B細(xì)胞抗原表位的蛋白可以合成多肽,關(guān)于構(gòu)想表位線性疫苗的想法提示,結(jié)構(gòu)不連續(xù)但空間相鄰的氨基酸所組成的這種線性多肽,同樣能夠模擬構(gòu)想表位,替代抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生B細(xì)胞抗體,可用以推動(dòng)研制疫苗以及免疫診斷的開(kāi)發(fā)[19,20]。在宿主抗結(jié)核免疫應(yīng)答中,T細(xì)胞發(fā)揮更為重要的功能作用,而T細(xì)胞表位含量越高,就越有可能引發(fā)免疫反應(yīng),故富含T細(xì)胞表位的蛋白有可能成為疫苗制備的候選蛋白,T細(xì)胞表位多為線性表位,需抗原提呈細(xì)胞呈遞抗原,該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析展示其以α-螺旋為主,也為T細(xì)胞抗原表位的形成提供了可能[21]。本研究預(yù)測(cè)GroEL2蛋白富含潛在的B細(xì)胞抗原表位和T細(xì)胞抗原表位,這為該蛋白作為候選疫苗抗原提供條件。

本研究成功對(duì)GroEL2蛋白進(jìn)行了表達(dá)純化及生物信息學(xué)分析,為進(jìn)一步研究該蛋白在結(jié)核分枝桿菌病理生理機(jī)制提供基礎(chǔ)。然而,與以往研究的不足類似,我們并未對(duì)可能作為結(jié)核病候選疫苗或藥物靶點(diǎn)之一的GroEL2進(jìn)行與免疫細(xì)胞的互作實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。后續(xù)將通過(guò)研究GroEL2蛋白對(duì)T細(xì)胞功能的影響進(jìn)一步分析其發(fā)揮的效用,在純化出該蛋白后,用組分刺激活動(dòng)性或潛伏期結(jié)核病患的血液,檢測(cè)血中被刺激的IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子的分泌情況以初步觀察GroEL2在體外的抗結(jié)核免疫效應(yīng),也可以考慮將該蛋白以此規(guī)律免疫小鼠后驗(yàn)證其在體內(nèi)的免疫原性以更好地評(píng)估其作為預(yù)防或治療性藥物靶標(biāo)的可能性,以此協(xié)助TB防治的發(fā)展。另外本研究雖然也對(duì)GroEL2蛋白多種生物學(xué)功能進(jìn)行了分析,但是其相關(guān)的功能與機(jī)制、通路之間的關(guān)聯(lián)性還有待深入挖掘。

綜上所述,本研究成功構(gòu)建重組pET-28a-GroEL2載體,并可在體外進(jìn)行大量表達(dá)和純化。生物信息學(xué)分析展示GroEL2蛋白存在豐富的潛在B、T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位,為進(jìn)一步明確GroEL2蛋白在Mtb感染中發(fā)揮的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),對(duì)疫苗新靶點(diǎn)的篩選以及結(jié)核病新的診斷方法建立具有重要意義。