單細(xì)胞染色質(zhì)轉(zhuǎn)座酶可及性高通量測序技術(shù)及其應(yīng)用

趙若含 趙凈穎 柏毅承 張瑞芳 賈俊靜 豆騰飛

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201）

真核生物的核DNA 并不是裸露的，而是與組蛋白結(jié)合形成核小體，核小體再經(jīng)逐步的壓縮折疊最終形成染色體高級結(jié)構(gòu)［1］。DNA 的復(fù)制轉(zhuǎn)錄需要將DNA 緊密結(jié)構(gòu)打開，再與轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)控因子結(jié)合，打開的染色質(zhì)就叫開放染色質(zhì)。開放染色質(zhì)允許其他調(diào)控因子結(jié)合的特性稱為染色質(zhì)的可及性［2-3］。2013 年，Buenrostro 等［4］提出一種用于研究染色質(zhì)可及性的方法，該方法利用高度活躍的Tn5 轉(zhuǎn)座酶與開放染色質(zhì)結(jié)合，對目標(biāo)DNA 進(jìn)行片段化處理和末端修復(fù)，并添加測序接頭。隨后對DNA 進(jìn)行測序，這種方法被稱為染色質(zhì)轉(zhuǎn)座酶可及性測序（assay for transposase?accessible chromatin with high?throughput sequencing, ATAC?seq）［5］。但是，ATAC?seq 無法區(qū)分樣品中亞群的染色質(zhì)可及性或亞群之間染色質(zhì)可及性的差異。在此基礎(chǔ)上，2015 年Cusanovich 等［6］發(fā)表了關(guān)于單細(xì)胞的染色質(zhì)轉(zhuǎn)座酶可及性的高通量測序（scATAC?seq），該技術(shù)使用Tn5 轉(zhuǎn)座酶檢測單個細(xì)胞中的全部開放區(qū)域，將開放的DNA 序列切割下來，再捕獲DNA 序列進(jìn)行測序，在單細(xì)胞層面提供全面的染色質(zhì)調(diào)控圖譜。

scATAC?seq 能在基因組水平上協(xié)助了解細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程，揭示不同基因組調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，從表觀遺傳學(xué)的角度來解析基因信息［7］。其中包括開放染色質(zhì)基因附近的啟動子、增強子以及離啟動子較遠(yuǎn)的調(diào)控元件如沉默子和絕緣子相關(guān)的開放區(qū)域。這些開放的染色質(zhì)元件在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中扮演著至關(guān)重要的角色［8］。尤其真核生物中的細(xì)胞類型特異性基因表達(dá)受數(shù)百萬個順式作用元件和數(shù)千個反式作用因子（如轉(zhuǎn)錄因子）的調(diào)節(jié)［9］。scATAC?seq 技術(shù)可以解釋順式作用元件和反式作用因子之間的網(wǎng)絡(luò)，同時還可了解到基因活性和對遺傳變異的可及性。因此，通過研究單細(xì)胞染色質(zhì)可及性信息的技術(shù)，了解其原理和應(yīng)用，明確這些技術(shù)在識別轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、鑒定基因組調(diào)控元件以及研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制等方面的重要意義。本文綜述了scATAC?seq 技術(shù)的發(fā)展歷程、7 種技術(shù)的優(yōu)缺點、數(shù)據(jù)分析和應(yīng)用，以期為表觀遺傳學(xué)研究提供參考。

1 scATAC-seq 技術(shù)的發(fā)展歷程

scATAC?seq 技術(shù)是基于單細(xì)胞和ATAC?seq 技術(shù)發(fā)展起來的，可在單細(xì)胞水平上高通量、高分辨率地檢測異質(zhì)性細(xì)胞群的染色質(zhì)可及性。該技術(shù)通過在Tn5 轉(zhuǎn)座酶結(jié)合的接頭序列中添加可區(qū)分細(xì)胞來源的細(xì)胞身份標(biāo)記序列，實現(xiàn)對捕獲DNA 片段的細(xì)胞來源的標(biāo)記，從而實現(xiàn)高通量的單細(xì)胞染色質(zhì)可及性測序。scATAC?seq 技術(shù)為研究單個細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控機制提供了新的見解［10］。其中包括多種技術(shù)，如組合細(xì)胞索引（sci?ATAC）、微流控技術(shù)（Fluidigm C1）、超敏位點測序（scTHS）、物理方法（uATAC）、平板技術(shù)（Plate）、液滴-微流控技術(shù)（dsci?ATAC）和10X 技術(shù)［11］。7 種技術(shù)的具體信息見表1。10X Genomics 技術(shù)與其他技術(shù)相比表現(xiàn)出更為簡便和高效的優(yōu)勢，迅速被廣泛采用并成為scATAC?seq 領(lǐng)域的前沿技術(shù)。以下將對scATAC?seq技術(shù)的發(fā)展歷程、作用機理以及研究進(jìn)展進(jìn)行描述。

表1 七種scATAC-seq 技術(shù)介紹Table 1 Introduction to seven scATAC-seq technologies

1.1 sci?ATAC及其衍生技術(shù)

2015 年，Cusanovich 等［6］提出了單細(xì)胞組合索引分析染色質(zhì)可及性（single cell combinatorial indexing assay for transposase accessible chromatin, sci?ATAC?seq）方法，該方法利用組合索引將細(xì)胞核進(jìn)行分子條形碼標(biāo)記，無需特殊處理。該技術(shù)的流程包括裂解細(xì)胞并將細(xì)胞核分配到96 孔板中，添加經(jīng)過定制的、唯一索引的Tn5 轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行標(biāo)記，將細(xì)胞核稀釋并重新分配到第二個96 孔板中，引入第二個條形碼，最后進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）和測序（圖1?A）。該方法簡單易行，適用于大多數(shù)實驗室，但測序覆蓋范圍相對較低，數(shù)據(jù)質(zhì)量有待提高。

2018 年，Cusanovich 等［12］在前期方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，大幅增加了每個細(xì)胞獲得的數(shù)據(jù)量。他們利用這一方法繪制了果蠅胚胎發(fā)育過程中染色質(zhì)調(diào)控狀態(tài)的動態(tài)變化，并鑒定了超過3 萬個具有組織特異性的遠(yuǎn)端調(diào)控元件。此外，他們使用相同的方法從13 只成年小鼠的17 個樣本中收集了10 萬個細(xì)胞進(jìn)行scATAC?seq，獲得了40 萬個染色質(zhì)可及性元件的信息，并成功區(qū)分了85 個細(xì)胞亞群，準(zhǔn)確識別了多種組織的大部分細(xì)胞類型。這項研究為相關(guān)組織的研究提供了重要的參考和借鑒［18］。

1.2 Fluidigm C1

2015 年，Buenrostro 等［13］提出了一種利用物理方法進(jìn)行細(xì)胞分離和scATAC?seq 的技術(shù)。該技術(shù)基于納米級反應(yīng)槽，在可編程微流體系統(tǒng)（C1 single?cell auto prep system, Fluidigm C1）中捕獲和評估單個細(xì)胞的活力，然后在集成的微流控芯片（integrated fluidics circuit, IFC）上進(jìn)行細(xì)胞裂解和轉(zhuǎn)座，進(jìn)而獲得細(xì)胞核中的DNA 片段。接下來，通過PCR 擴(kuò)增、文庫收集和細(xì)胞識別條形碼引物的PCR 擴(kuò)增，將單個細(xì)胞文庫匯集，并在高通量測序儀器上進(jìn)行測序［19］（圖1?B）。盡管該方法依賴儀器，但其數(shù)據(jù)質(zhì)量相對于sci?ATAC 而言更好。然而，操作復(fù)雜，需要顯微鏡核實每個反應(yīng)槽的細(xì)胞數(shù)，且整體獲得的細(xì)胞數(shù)量相對較少。

1.3 scTHS?seq

2017 年，Lake 等［14］開發(fā)了一種名為單細(xì)胞轉(zhuǎn)座子超敏感位點測序（single?cell transposome hyper?sensitive?site sequencing, scTHS?seq）的方法。該方法結(jié)合了轉(zhuǎn)座子超敏位點測序（ransposome hypersensi?tive sites sequencing, THS?seq）［20］的分析技術(shù)和使用定制條形碼轉(zhuǎn)座體的組合細(xì)胞索引。scTHS?seq 利用改進(jìn)后的超級突變型Tn5 轉(zhuǎn)座酶（Tn5059），具有體外轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增的線性優(yōu)勢，并比ATAC?seq 具有更高的靈敏度和細(xì)胞特異性的遠(yuǎn)端增強子覆蓋度。該方法的步驟包括獲取細(xì)胞核并進(jìn)行計數(shù)，在384 孔板上合成帶有獨特條形碼的轉(zhuǎn)座體復(fù)合物，與細(xì)胞樣本反應(yīng)并進(jìn)行收集，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到96 孔板上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，最后進(jìn)行測序（圖1?C）。scTHS?seq 的優(yōu)勢在于克服了樣本限制，可處理新鮮或凍存的組織樣本，實現(xiàn)大規(guī)模單細(xì)胞檢測，并且不受組織細(xì)胞解離的影響。

1.4 μATAC?seq

2018 年，Mezger 等［15］開發(fā)了一種名為μATAC?seq 的技術(shù)，通過納米級液體沉積系統(tǒng)（ICELL8 單細(xì)胞系統(tǒng)）對整個細(xì)胞中的染色質(zhì)可及性進(jìn)行測序。該技術(shù)利用物理方法在小體積下實現(xiàn)了scATAC?seq。該方法通過對細(xì)胞進(jìn)行染色并將其加入具有可控溫度和濕度的5 184 個納米孔中，平均每個孔中包含一個細(xì)胞。隨后，利用熒光顯微鏡成像識別含有活細(xì)胞的孔。然后，在孔中加入帶有條形碼的轉(zhuǎn)座試劑，并與EDTA 一起進(jìn)行轉(zhuǎn)座反應(yīng)，隨后加入MgCl2，為后續(xù)的PCR 擴(kuò)增做準(zhǔn)備。最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增和構(gòu)建文庫并進(jìn)行測序（圖1?D）。該技術(shù)將熒光成像和定向試劑沉積應(yīng)用于大規(guī)模平行納米孔陣列中。與Fluidigm C1 技術(shù)相比，μATAC?seq 技術(shù)的測序量提高了近20 倍，并且降低了每個細(xì)胞分析的成本［13］。

1.5 Plate

2018 年，Chen 等［16］開發(fā)了一種基于96 孔或384 孔板的scATAC?seq 方法，通過在整個細(xì)胞群中預(yù)先進(jìn)行Tn5 標(biāo)記，提供了一種簡單快速的實驗流程。該方法的步驟包括制備5 000-50 000 個細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，對細(xì)胞進(jìn)行Tn5 標(biāo)記反應(yīng)。接著將單個細(xì)胞核分選到含有裂解緩沖液（十二烷基硫酸鈉和蛋白酶K）的板中，等待Tn5 片段釋放。隨后添加吐溫20 以滅活裂解緩沖液中的十二烷基硫酸鈉，然后使用PCR 進(jìn)行文庫構(gòu)建和擴(kuò)增。最后進(jìn)行匯集、純化和測序（圖1?E）。該方法無需純化和板轉(zhuǎn)移，具有快速和經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢。相較于Fluidigm C1和μATAC?seq，無需昂貴的設(shè)備。與sci?ATAC 和scTHS?seq 方法相比，該方法不需要定制修改的Tn5轉(zhuǎn)座酶，進(jìn)一步簡化了實驗過程。

1.6 dsci?ATAC

2019 年，Lareau 等［17］提出了一種名為基于液滴-微流控技術(shù)為基礎(chǔ)的單細(xì)胞染色質(zhì)可及性分析（droplet?based combinatorial indexing for massive?scale single?cell chromatin accessibility, dsci?ATAC）的方法，結(jié)合了液滴-微流控技術(shù)和ATAC?seq 來進(jìn)行單細(xì)胞染色質(zhì)開放性分析。該方法利用Tn5 轉(zhuǎn)座酶對細(xì)胞核進(jìn)行轉(zhuǎn)座，并將測序接頭整合到開放染色質(zhì)區(qū)域中。通過微流體轉(zhuǎn)置處理，將轉(zhuǎn)座的染色質(zhì)、PCR 試劑和條形碼封裝成單個液滴。細(xì)胞識別的DNA 條形碼添加到轉(zhuǎn)座的染色質(zhì)中進(jìn)行擴(kuò)增，最后進(jìn)行測序（圖1?F）。該技術(shù)成功解決了快速分離細(xì)胞的難題，顯著提高了單細(xì)胞分析的速度。通過創(chuàng)新的實驗和算法，dsci?ATAC 能夠獲得高達(dá)95%的細(xì)胞數(shù)據(jù)。

1.7 10X Genomics

2018 年，10X Genomics 推出了scATAC?seq 技術(shù)方法，成為目前最常用的單細(xì)胞染色質(zhì)可及性測序技術(shù)［9］。類似于10X Genomics 的scRNA?seq 技術(shù)。該實驗流程包括以下步驟：首先制備目標(biāo)組織樣本的細(xì)胞核懸液，然后使用帶有標(biāo)簽的Tn5 轉(zhuǎn)座酶切割開放染色質(zhì)。接下來，利用10X Genomics 的儀器將帶有10X 條形碼的凝膠微珠用于捕獲和標(biāo)記每個細(xì)胞核。在每個液滴中，轉(zhuǎn)座后的DNA 片段帶有10X 條形碼的標(biāo)記，而每個條形碼序列代表一個獨特的細(xì)胞。最后，完成文庫構(gòu)建，并使用Illumina高通量測序儀進(jìn)行測序，以獲取測序數(shù)據(jù)（圖2）。該方法能夠在短時間內(nèi)利用微量樣本獲得大量有效信息，具有高靈敏度和較好的試驗重復(fù)性。

圖2 scATAC-seq 的技術(shù)流程Fig. 2 Technical flow of scATAC-seq（10X）

2 scATAC-seq 的數(shù)據(jù)分析

scATAC?seq 數(shù)據(jù)分析通常包括以下步驟：首先進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，包括數(shù)據(jù)質(zhì)量控制、去除低質(zhì)量讀長（reads）和PCR 擴(kuò)增偏差等。常用的軟件工具包括Trimmomatic 和FastQC［21］。接下來，使用比對軟件如Bowtie2 和BWA 將scATAC?seq 的reads 比對到參考基因組上［22］。比對完成后，根據(jù)reads 的位置和大小信息生成信號矩陣（count matrix），用于后續(xù)的分析。常用的工具包括MACS2 和SAMtools［23］。然后，利用聚類和降維方法，如PCA、t?SNE 和UMAP，對單個細(xì)胞進(jìn)行聚類和降維，以識別不同類型的細(xì)胞和細(xì)胞狀態(tài)［24］。接著，通過計算每個細(xì)胞簇中某一基因區(qū)域的信號值（如peaks）出現(xiàn)的頻率，進(jìn)行基因共現(xiàn)分析，以確定不同細(xì)胞類型的共同表達(dá)基因。常用的軟件包括Cicero［25］和ChromVAR［26］。此外，還可以進(jìn)行基于已知基因集（如Gene Ontology、KEGG 和Reactome）的基因功能富集分析，以了解不同細(xì)胞類型和狀態(tài)的基因可能涉及的功能和通路。最后，使用Seurat、Loupe Cell Browser 和scater 等不同的軟件包對分析結(jié)果進(jìn)行可視化。每個實驗的具體分析方法和工具可能因研究目的和數(shù)據(jù)特點而有所不同，因此在實際應(yīng)用中可以根據(jù)需求進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整和擴(kuò)展［18］。

3 scATAC-seq 的應(yīng)用

3.1 染色體開放性圖譜繪制

細(xì)胞的異質(zhì)性是廣泛存在的生物學(xué)現(xiàn)象，不同類型的細(xì)胞有序地組合在一起形成特定功能的組織和器官［13］。scATAC?seq 技術(shù)通過比較不同細(xì)胞類型和細(xì)胞亞型在染色體可及性上的差異，從細(xì)胞層面揭示更多的表觀遺傳調(diào)控信息［27］。在人類基因組染色質(zhì)可及性圖譜中的繪制，對成人的30 個不同解剖部位鑒定出了30 個細(xì)胞大簇和111 個細(xì)胞亞簇，并表現(xiàn)出高度組織特異性，并與scRNA?seq 鑒定的細(xì)胞類型高度一致［7］。對于大腦研究而言，scATAC?seq 的優(yōu)勢在于其能夠在高度異質(zhì)的組織中揭示細(xì)胞的染色體可及性，幫助研究不同細(xì)胞類型和狀態(tài)下的基因調(diào)控［28］。在對人類前額葉皮層進(jìn)行的研究中，使用兩種單細(xì)胞測序方法，即單細(xì)胞核ATAC?seq（snATAC?seq）和單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序（snRNA?seq），都成功鑒定出了6 種細(xì)胞類型，并在整合的UMAP 圖譜中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞類型完全重疊，而且snATAC?seq 測序的細(xì)胞核數(shù)量約是snRNA?seq 的2倍［29］。這說明scATAC?seq 在細(xì)胞核類型鑒定上擁有更高的靈敏性和分辨率。另外，對妊娠中期人類前腦的研究也證實了scATAC?seq 數(shù)據(jù)具有足夠的靈敏性，可以在高分辨率下區(qū)分細(xì)胞亞型［30］。而在成年小鼠垂體細(xì)胞核的研究中，通過分析染色質(zhì)開放區(qū)域，成功鑒定出11 個細(xì)胞簇，包括垂體細(xì)胞、催乳素細(xì)胞、生長激素細(xì)胞等，并發(fā)現(xiàn)了染色質(zhì)可及性的增殖細(xì)胞標(biāo)記物［31］。對于胰腺研究，scATAC?seq 技術(shù)針對細(xì)胞核進(jìn)行研究，有望促進(jìn)整個組織的深入研究，包括胰腺的內(nèi)分泌腺和外分泌腺細(xì)胞類型［32］?？偟膩碚f，scATAC?seq 技術(shù)在繪制染色體開放性圖譜方面具有單細(xì)胞分辨率、全基因組覆蓋、多維數(shù)據(jù)集成和發(fā)現(xiàn)新調(diào)控元件等優(yōu)勢。它為我們深入了解細(xì)胞的基因調(diào)控和組織的功能提供了有力的工具，尤其在復(fù)雜組織如大腦和胰腺中的應(yīng)用有望取得重要突破。

3.2 疾病潛在標(biāo)志物的預(yù)測

染色質(zhì)可及性在基因調(diào)控和基因組穩(wěn)定性中具有重要作用。改變?nèi)旧|(zhì)可及性模式可能會影響基因組調(diào)控區(qū)域?qū)﹃P(guān)鍵蛋白的可接近性，因此染色質(zhì)可及性模式已成為人類疾病的重要組成部分［33］。scATAC?seq 可以清晰地發(fā)現(xiàn)細(xì)胞標(biāo)志物，并有潛力預(yù)測疾病分子標(biāo)記物。全基因組分析（GWAS）能夠在全基因組水平上檢測遺傳變異并研究基因型與表型的關(guān)聯(lián)，從而幫助識別與性狀相關(guān)的變異［34］。scATAC?seq 可以結(jié)合GWAS 的結(jié)果，并鑒定與多種復(fù)雜性狀和疾病相關(guān)的細(xì)胞類型特異性富集。例如，自身免疫性疾病在白細(xì)胞相對應(yīng)的細(xì)胞簇中顯示出顯著富集，神經(jīng)學(xué)特征如雙相情感障礙、受教育程度和精神分裂癥的富集發(fā)生在神經(jīng)元細(xì)胞類型中，而阿爾茨海默病在小膠質(zhì)細(xì)胞中強烈富集［18,30］。此外，通過與基因精細(xì)定位、全基因組測序和細(xì)胞類型特異性數(shù)據(jù)的結(jié)合，scATAC?seq 具有預(yù)測調(diào)控功能的變異位點，并檢測目標(biāo)基因可及性的調(diào)控區(qū)域。這種方法已在2 型糖尿病、強直性脊柱炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病研究中得到應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)了與疾病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)控元件和靶基因［32,35-36］。此外，snATAC?seq 在晚期阿爾茨海默病的研究中識別了候選的順式調(diào)節(jié)元件與候選靶基因的聯(lián)系，并揭示了固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1（SREBF1）在疾病中的調(diào)控異常［29］。綜上所述，單細(xì)胞表觀基因組學(xué)在解釋復(fù)雜疾病遺傳學(xué)方面具有重要意義，能夠識別細(xì)胞類型特異性的疾病生物學(xué)，并發(fā)現(xiàn)易受遺傳風(fēng)險因子影響的細(xì)胞類型，為疾病的理解和治療提供基礎(chǔ)。

3.3 腫瘤發(fā)生表觀機制研究

癌癥的發(fā)生受到基因和環(huán)境之間相互作用的推動。早期組織損傷可能促進(jìn)癌癥的發(fā)展，因此在腫瘤發(fā)展到難以控制的階段之前，制定合理的策略來預(yù)防、檢測和攔截腫瘤是可能的［37］。癌細(xì)胞通過重新調(diào)整人類基因組中的調(diào)控元件來激活基因，加速腫瘤生長，并產(chǎn)生對治療的耐受性［38］。比如在基底細(xì)胞癌中，通過腫瘤微環(huán)境的scATAC?seq 有助于表征免疫和基質(zhì)中的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)以及惡性細(xì)胞，并幫助識別與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中T 細(xì)胞耗竭相關(guān)的調(diào)節(jié)機制［9］。此外，在結(jié)直腸癌中，scATAC?seq 研究發(fā)現(xiàn)癌前腺瘤性息肉發(fā)展為結(jié)直腸癌時，其表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄軌跡非常一致。谷胱甘肽過氧化物酶2（GP?X2）的表達(dá)被發(fā)現(xiàn)可作為判斷息肉惡性程度的標(biāo)志，有助于對息肉進(jìn)行分期和評估風(fēng)險［39］。此外，對胰腺癌小鼠模型的scATAC?seq 研究表明，在鼠類肉瘤病毒癌（KRAS）基因突變的胰腺上皮細(xì)胞中，在組織損傷后48 h 內(nèi)出現(xiàn)了腺泡到腫瘤的染色質(zhì)開關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，這一過程的關(guān)鍵靶標(biāo)是白介素33（IL?33），其細(xì)胞因子活性可以替代組織損傷，加速早期腫瘤病變的形成［40］。這些發(fā)現(xiàn)為合理設(shè)計早期檢測和治療策略提供了新機會，以在早期階段攔截炎癥和關(guān)鍵細(xì)胞因子驅(qū)動的惡性腫瘤。而在肺腺癌中，具有更高侵襲性的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了與人類晚期肺癌相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RUNX 家族轉(zhuǎn)錄因子2（RUN?X2）。這一發(fā)現(xiàn)表明RUNX2 可能作為一個潛在的生物標(biāo)志物，用于預(yù)測患者的預(yù)后情況［41］?？傮w而言，scATAC?seq 技術(shù)在癌癥研究中展現(xiàn)出巨大的潛力，通過揭示調(diào)控元件、轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)狀態(tài)的變化，有助于深入了解癌癥的發(fā)生、發(fā)展和治療反應(yīng)。這為未來開發(fā)更有效的預(yù)防、檢測和治療策略提供了新的機會。

3.4 轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)鍵功能

染色質(zhì)可及性的改變在細(xì)胞分化和發(fā)育中扮演著關(guān)鍵的驅(qū)動角色。scATAC?seq 技術(shù)為我們提供了可視化細(xì)胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄程序準(zhǔn)備過程的能力，幫助我們深入了解細(xì)胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)變以及在不同分化狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄因子和增強子的變化和可能的決定因素［42］。以視網(wǎng)膜發(fā)育為例，研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子視覺系統(tǒng)同源盒2（Vsx2）對視網(wǎng)膜祖細(xì)胞和雙極細(xì)胞的發(fā)育起著至關(guān)重要的作用，其突變會導(dǎo)致小眼癥［43］。同時，在骨骼肌中，通過scATAC?seq 分析發(fā)現(xiàn)癌癥中的高甲基化1（Hic1）在骨骼肌間充質(zhì)祖細(xì)胞中充當(dāng)標(biāo)志物，其缺失會導(dǎo)致細(xì)胞增生［44］。此外，在真皮成纖維細(xì)胞中，研究顯示其穩(wěn)態(tài)和損傷時的反應(yīng)具有顯著的異質(zhì)性。研究發(fā)現(xiàn)，在傷口愈合過程中，維甲酸和RUNX 家族轉(zhuǎn)錄因子1（RUNX1）是活躍于再生大創(chuàng)面中心細(xì)胞上層真皮細(xì)胞中的重要轉(zhuǎn)錄因子［45］。在乳腺上皮細(xì)胞的研究中，腔祖細(xì)胞可以逐漸轉(zhuǎn)化為泌乳型祖細(xì)胞。在這個分化過程中，轉(zhuǎn)錄因子的活性會隨著時間的推移而增強或減弱，其中包括SMAD 家族成員2（SMAD2）和GATA 結(jié)合蛋白1（GATA1）［46］。Smad 家族蛋白主要參與調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子信號，而GATA 則在成熟腔細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。這些發(fā)現(xiàn)表明不同的轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞分化過程的不同階段具有關(guān)鍵的功能。在免疫反應(yīng)研究方面，通過對LPS 刺激奶牛全血前后進(jìn)行scATAC?seq 分析，研究人員除了確認(rèn)已知的多效性轉(zhuǎn)錄因子核因子κB（NF-κB）外，還發(fā)現(xiàn)了關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NFKB1、NFKBIZ、IRF5、IRF7、IRF9 和STAT1 等，它們參與調(diào)控免疫反應(yīng)和促炎反應(yīng)的過程［47］。此外，雞胚胎體軸發(fā)育的時空序列研究表明，內(nèi)源性順式調(diào)控元件的表觀基因組沉默會破壞轉(zhuǎn)錄因子15（TCF15）和間充質(zhì)同源框1（MEOX1）的表達(dá)，導(dǎo)致體軸伸展異常的出現(xiàn)［48］。最后，在牛和豬的骨骼肌研究中，scATAC?seq 技術(shù)鑒定了E2F7、JUND、ZBTB18、HLF、BACH2、FOSL2 和MAFA 等轉(zhuǎn)錄因子在肌肉發(fā)生過程中的潛在功能［49］。豬骨骼肌的研究強調(diào)了早期生長反應(yīng)因子1（EGR1）和ras 同系物家族成員B（RHOB）轉(zhuǎn)錄因子在胚胎骨骼肌發(fā)育中的關(guān)鍵性作用［50］。綜上所述，scATAC?seq 技術(shù)在不同類型細(xì)胞分化和發(fā)育研究中提供了寶貴的信息，幫助我們深入了解細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變的調(diào)控機制以及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和增強子的變化，為癌癥、發(fā)育生物學(xué)和免疫學(xué)等領(lǐng)域的研究提供了新的視角和有益線索。

4 展望

scATAC?seq 是一種重要的單細(xì)胞測序技術(shù)，可揭示不同類型細(xì)胞之間的異質(zhì)性問題，并對開放染色質(zhì)的可及性進(jìn)行表征，從而深入研究染色質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控元件之間的動態(tài)變化和相互作用關(guān)系。該技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)和基因組學(xué)研究中應(yīng)用廣泛。它能夠鑒定不同細(xì)胞類型、分析轉(zhuǎn)錄因子功能、識別和注釋增強子區(qū)域，并揭示細(xì)胞發(fā)育和分化過程中的動態(tài)變化。此外，scATAC?seq 還可應(yīng)用于疾病研究，發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的染色質(zhì)特征和轉(zhuǎn)錄因子變化，從而深入了解疾病的發(fā)生機制。該技術(shù)還有助于藥物篩選和治療優(yōu)化，通過評估藥物對細(xì)胞的影響，幫助優(yōu)化藥物治療策略。盡管scATAC?seq 是一項強大的技術(shù)，但仍存在改進(jìn)的空間。需要解決的問題包括提高數(shù)據(jù)質(zhì)量和降低噪音水平，改善細(xì)胞捕獲效率以提高數(shù)據(jù)可靠性和廣泛適用性。此外，開發(fā)更準(zhǔn)確、高效的數(shù)據(jù)分析方法是必要的，以解析復(fù)雜的染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)并實現(xiàn)準(zhǔn)確的細(xì)胞類型鑒定、轉(zhuǎn)錄因子分析和增強子注釋。另外，整合和比較多個數(shù)據(jù)集的工具和方法需要進(jìn)一步改進(jìn)，以提供更全面的認(rèn)識細(xì)胞類型和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的多樣性。最后，降低成本和提高效率也是需要關(guān)注的方面，以促進(jìn)scATAC?seq 在大規(guī)模研究中的廣泛應(yīng)用。綜上所述，隨著技術(shù)的不斷成熟，scATAC?seq 正成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中不可或缺的重要工具。