溫度和酸性環(huán)境對(duì)A型塞內(nèi)卡病毒穩(wěn)定性的影響

胡振儒, 趙司淼, 周回迎, 覃 堯, 冉旭華, 聞曉波

(海南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院, 海口 570228)

A型塞內(nèi)卡病毒(Senecavirus A, SVA)作為豬水皰傳染病病原體之一, 2014年以來陸續(xù)在北美、南美及亞洲報(bào)道了相關(guān)疫情[1]。2015年我國(guó)廣東省報(bào)道首例因SVA感染的病例[2], 隨后在福建、山東、廣西等14個(gè)省份相繼出現(xiàn)SVA感染的報(bào)道,表明該病在我國(guó)逐漸呈現(xiàn)出區(qū)域流行趨勢(shì),需重點(diǎn)加強(qiáng)對(duì)SVA的免疫防治工作[3]。鑒于SVA感染引起的新發(fā)傳染病在我國(guó)境內(nèi)快速傳播,研發(fā)SVA疫苗保證高效接種才是防控傳染病的關(guān)鍵[4]。然而無論是滅活疫苗、減毒活疫苗還是病毒顆粒樣疫苗,疫苗效力與疫苗制劑中完整顆粒含量有關(guān)。完整的病毒顆粒受溫度變化或pH值降低的影響,病毒顆粒不可逆的裂解為五聚體,既減弱疫苗的免疫原性,也降低疫苗的質(zhì)量。因此,病毒顆粒穩(wěn)定性是研發(fā)高效疫苗的一個(gè)關(guān)鍵性因素,有助于提高免疫效力,延長(zhǎng)免疫持續(xù)時(shí)間[5-6]。在小RNA病毒科中,如口蹄疫病毒[7]、脊髓灰質(zhì)炎病毒[8]、腸道病毒[9]等多數(shù)小RNA病毒均具有熱與酸的不穩(wěn)定性。研究[10]表明同為小RNA病毒科的甲型肝炎病毒具有熱與酸穩(wěn)定性,甚至在高達(dá)80 ℃環(huán)境中或pH值<2.0的酸性溶液下仍能保持完整的病毒顆粒。所以僅從病毒分類上無法判斷SVA在溫度和酸性環(huán)境中是否具有穩(wěn)定性。

目前,已知SVA是小RNA病毒科塞內(nèi)卡病毒屬的唯一成員[11], 屬于無包膜、單股正鏈RNA病毒, SVA基因組約7 300 bp, 僅包含1個(gè)開放閱讀框(ORF), 編碼1個(gè)多聚蛋白,經(jīng)蛋白酶水解后加工形成結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白。其中VP1、VP2、VP3、VP4 4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成20面體結(jié)構(gòu),具有兩重軸、三重軸和五重軸[12]。相關(guān)研究表明病毒顆粒的穩(wěn)定性主要受衣殼蛋白的影響,衣殼蛋白上的靜電相互作用及氫鍵與弱疏水相互作用等非共價(jià)相互作用網(wǎng)絡(luò)在自身組裝、結(jié)構(gòu)完整性與穩(wěn)定性方面起著關(guān)鍵性作用[13]。然而,衣殼蛋白僅有部分界面殘基參與到組裝過程中,蛋白質(zhì)相互作用界面上的殘基所形成的非共價(jià)相互作用結(jié)合能不均勻分布,導(dǎo)致這一部分熱點(diǎn)殘基貢獻(xiàn)出大部分結(jié)合能的現(xiàn)象。在高溫或酸性環(huán)境影響下,使衣殼蛋白中的熱點(diǎn)殘基提供的靜電相互作用力、氫鍵與鹽橋等穩(wěn)定因素受到影響,病毒顆粒進(jìn)而發(fā)生構(gòu)象變化、裂解喪失病毒感染性,從而影響免疫原性[14]。相關(guān)研究[15]表明, FMDV衣殼亞基間氨基酸側(cè)鏈對(duì)顆粒穩(wěn)定性和病毒的功能影響較大。所以熱點(diǎn)殘基在病毒顆粒穩(wěn)定性方面的顯著貢獻(xiàn),對(duì)了解SVA的熱穩(wěn)定性與酸穩(wěn)定性,以及后續(xù)熱穩(wěn)定機(jī)制研究具有重要意義。

本研究使用生物信息學(xué)軟件對(duì)SVA衣殼蛋白的理化性質(zhì)、衣殼蛋白間的熱點(diǎn)殘基與作用關(guān)系進(jìn)行深入分析,推測(cè)病毒衣殼蛋白在熱或酸性環(huán)境下具有不穩(wěn)定性; 通過在特定溫度與酸性環(huán)境下孵育SVA病毒液,使用TCID50檢測(cè)SVA病毒滴度,使用RT-qPCR對(duì)SVA RNA拷貝數(shù)進(jìn)行定量,探究溫度和酸性環(huán)境對(duì)SVA穩(wěn)定性的影響,為后續(xù)SVA疫苗的研發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 SVA衣殼蛋白穩(wěn)定性生物信息學(xué)分析

1.1.1 SVA衣殼結(jié)構(gòu)五聚體亞基理化特性分析

使用ProtParam或ProtScale服務(wù)器計(jì)算SVA衣殼蛋白(PDB:3CJI)的理化性質(zhì),包括親水性指數(shù)(GRAVY)、脂肪族指數(shù)、穩(wěn)定性指數(shù)等參數(shù)計(jì)算; 使用ChimeraX 1.4分析SVA衣殼蛋白的三維結(jié)構(gòu);使用I-Mutant 3.0進(jìn)行殘基突變分析。具體方法參照文獻(xiàn)[16]。

1.1.2 熱點(diǎn)殘基與蛋白質(zhì)相互作用殘基分析

通過3個(gè)熱點(diǎn)殘基預(yù)測(cè)在線服務(wù)器PredHS、PPCHECK與KFC-2分析SVA衣殼蛋白熱點(diǎn)殘基。判定熱點(diǎn)殘基原則為SVA衣殼蛋白數(shù)據(jù)提交至上述3個(gè)熱點(diǎn)殘基分析網(wǎng)站,當(dāng)被2個(gè)網(wǎng)站同時(shí)識(shí)別才判定為熱點(diǎn)殘基。而后將SVA衣殼蛋白數(shù)據(jù)提交至蛋白質(zhì)相互作用、表面和組裝(jsPISA)網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器上,識(shí)別SVA衣殼蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)。具體方法參照文獻(xiàn)[17]。

1.2 SVA熱穩(wěn)定和酸穩(wěn)定試驗(yàn)材料

1.2.1 細(xì)胞與病毒

SVA與IBRS-2細(xì)胞由海南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2.2 主要試劑與儀器

胎牛血清(FBS)為美國(guó)Invigentech公司產(chǎn)品; TRIzol Reagent、2×SYBR Green qPCR Mix試劑為北京蘭杰柯科技公司產(chǎn)品; Random hexamer、RNase-free ddH2O、5×HiScript II Buffer、dNTP Mix、HiScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑為南京諾唯贊生物科技公司產(chǎn)品。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào)qTOWER 3)為德國(guó)Analytik公司產(chǎn)品。

1.3 SVA熱穩(wěn)定和酸穩(wěn)定試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

IBRS-2細(xì)胞使用DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素)置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),后續(xù)用于病毒培養(yǎng)與組織細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID50)測(cè)定。

1.3.2 熱穩(wěn)定和酸穩(wěn)定試驗(yàn)

將SVA病毒液設(shè)為溫度處理組與酸性環(huán)境處理組,其中未處理SVA病毒液作為對(duì)照組。溫度處理組孵育過程: 分別在4 ℃孵育4、8、15 d, 25 ℃孵育2、4、8 d, 37 ℃孵育8、16、48 h。酸性環(huán)境處理組孵育過程: SVA病毒液分別在pH 4.0、5.8的檸檬酸鹽緩沖溶液和pH 6.6、7.2的磷酸鹽緩沖溶液中以1∶9的比例孵育1 h, 后續(xù)用于TCID50測(cè)定病毒滴度變化。

1.3.3 病毒滴度測(cè)定

溫度處理組、酸性環(huán)境處理組和對(duì)照組用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行10倍稀釋, 取10-1～10-10共10個(gè)稀釋度分別接種于長(zhǎng)滿單層IBRS-2細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板上, 每個(gè)稀釋度以每孔0.1 mL接種8孔,其中以DMEM培養(yǎng)基(含2% FBS、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素)作為陰性對(duì)照、未稀釋病毒液作為陽(yáng)性對(duì)照。經(jīng)37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育1 h后, 棄病毒液后用0.01 mol·L-1PBS緩沖溶液(pH 7.2)漂洗2次, 每孔加入0.1 mL DMEM培養(yǎng)基(含2% FBS、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素)。每天觀察并記錄細(xì)胞病變情況,按照Reed-Muench方法計(jì)算TCID50[18], 同一樣品進(jìn)行3次獨(dú)立的病毒滴度檢測(cè)。

1.3.4 引物設(shè)計(jì)與合成

參考SVA/HB/2018毒株的VP1基因序列(登錄號(hào)為MN922286),設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物,上游引物序列為5′-TGGACTGGACATCGTATA-3′, 下游引物序列為5′-TTGCGTAGTAATTGAAGGT-3′。

1.3.5 總RNA提取及cDNA獲取

將SVA分別經(jīng)溫度和酸性緩沖液孵育后,取100 μL病毒液接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上, 經(jīng)37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 d, 提取SVA感染細(xì)胞后總RNA。利用反轉(zhuǎn)錄酶等試劑將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 具體操作參照文獻(xiàn)[19]。

1.3.6 RT-qPCR檢測(cè)及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以SVA cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系中, 2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL, 上、下游引物各0.6 μL, cDNA模板0.4 μL, 加ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件: 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 10 s, 52 ℃ 30 s, 共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品做2個(gè)重復(fù), 同1個(gè)樣品進(jìn)行3次獨(dú)立的熒光定量PCR檢測(cè)。

以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的pcDNA3.1-VP1重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,經(jīng)10倍稀釋后,以拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值為結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。病毒基因組拷貝數(shù)計(jì)算公式如下: 拷貝數(shù)/copies·μL-1=6.02×1014×質(zhì)粒濃度(ng·μL-1)/[(質(zhì)粒分子量+插入片段分子量)×660]。檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度為380.40 ng·μL-1, 質(zhì)粒分子量加上插入片段分子量為6 250 bp, 則拷貝數(shù)初始值為5.55×1010copies·μL-1。

1.4 數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及作圖,采用單因素方差分析(One-way ANOVA)處理不同時(shí)間點(diǎn)的SVA RNA拷貝數(shù),P<0.05表示差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 SVA衣殼蛋白生物信息學(xué)分析

2.1.1 SVA結(jié)構(gòu)分析

分析SVA衣殼蛋白結(jié)構(gòu)(圖1)時(shí),發(fā)現(xiàn)部分組氨酸在五聚體界面處,如VP3中127 H、106 H與108 H以及VP2中197 H, 增加五聚體界面處的不穩(wěn)定性[7]。使用I-Mutant 3.0服務(wù)器在默認(rèn)參數(shù)下將VP3中127 H突變?yōu)镽、106 H 突變?yōu)镽, 則自由能變化值(DDG)>0.5, 說明蛋白質(zhì)間穩(wěn)定性得到極大提升。此外,將VP1中158 H突變?yōu)镵時(shí), DDG>0, 則增加衣殼蛋白間穩(wěn)定性。

2.1.2 理化性質(zhì)分析

對(duì)SVA衣殼蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果(表1)顯示, SVA衣殼蛋白中VP1與VP4為堿性(PI>7), VP2與VP3為酸性(PI<7), 其中VP1不穩(wěn)定指數(shù)>40, 說明VP1并不穩(wěn)定。此外, VP1—VP4中親水性總平均值<0、芳香族占比<13.5、形成少量鹽橋,表明VP1—VP4均為穩(wěn)定性較差的親水性蛋白質(zhì),且除VP2外,脂肪族指數(shù)均低于80, 意味著衣殼蛋白的耐熱性較低。

2.1.3 SVA衣殼蛋白熱點(diǎn)殘基和相互作用預(yù)測(cè)

分析衣殼蛋白間的熱點(diǎn)殘基有助于了解病毒衣殼蛋白的穩(wěn)定性。本研究對(duì)SVA衣殼蛋白的熱點(diǎn)殘基進(jìn)行了識(shí)別,結(jié)果 (表2)顯示,在VP1—VP4上分別檢測(cè)到16、11、16和5個(gè)熱點(diǎn)殘基。通過PISA蛋白相互作用分析, SVA衣殼蛋白的多數(shù)熱點(diǎn)殘基在界面處與相鄰殘基形成氫鍵,少數(shù)熱點(diǎn)殘基形成鹽橋,且至少以1種相互作用力參與到衣殼界面上,但缺少二硫鍵與范德華力等相互作用力[17,20]。

通過SVA衣殼蛋白間理化性質(zhì)、熱點(diǎn)殘基及相互作用力的分析,推測(cè)SVA在高溫或酸性環(huán)境中具有熱不穩(wěn)定性或酸不穩(wěn)定性。

2.2 熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

為驗(yàn)證SVA具有熱不穩(wěn)定性的推測(cè),將SVA病毒液分別在4、25、37 ℃條件下處理不同時(shí)間,檢測(cè)病毒滴度的變化。對(duì)照組SVA病毒滴度為108.8TCID50·mL-1, 4 ℃處理4、8、15 d, 病毒滴度分別下降100.66、101.14、102.35TCID50·mL-1(圖2.A)。25 ℃處理2、4、8 d, 病毒滴度分別下降102.34、102.64、103.56TCID50·mL-1(圖2.B)。37 ℃處理8、16、48 h, 病毒滴度分別下降100.85、101.57、104.65TCID50·mL-1(圖2.C)。當(dāng)SVA病毒液在不同溫度下孵育時(shí)間延長(zhǎng)時(shí), SVA病毒滴度均有不同程度的下降,說明SVA對(duì)外界環(huán)境中的溫度較敏感(P<0.05)。

圖2 SVA在4 (A)、25 (B)、37 ℃ (C)孵育后的病毒滴度變化☆Fig.2 The viral titer changes of SVA after incubation at 4 (A), 25 (B), and 37 ℃ (C)☆ A. 經(jīng)4 ℃孵育后SVA病毒滴度下降; B. 經(jīng)25 ℃孵育后SVA病毒滴度下降; C. 經(jīng)37 ℃孵育后SVA病毒滴度下降。與CK相比, * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, **** P<0.000 1。☆ A. The virus titer of SVA decreased after incubation with 4 ℃; B. The virus titer of SVA decreased after incubation with 25 ℃; C. The virus titer of SVA decreased after incubation with 37 ℃. Compared with CK, * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, **** P<0.000 1.

為進(jìn)一步確認(rèn)溫度對(duì)SVA RNA拷貝數(shù)的影響,采用RT-qPCR檢測(cè)經(jīng)不同溫度孵育后的SVA病毒液在IBRS-2細(xì)胞中的RNA拷貝數(shù)情況。繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=-0.996 8X+38.235, 決定系數(shù)R2=0.996 8, 說明具有良好線性關(guān)系[Y值為 cycle threshold (Ct值),X值為拷貝數(shù)對(duì)數(shù)]。對(duì)照組SVA拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值為30.11; 4 ℃處理4、8、15 d, 拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值分別為30.07、28.61、8.12 (圖3.A); 25 ℃處理2、4、8 d后, 拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值為25.43、22.52、14.36 (圖3.B); 37 ℃處理8、16和48 h后, 拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值為28.64、26.19、22.53 (圖3.C)。SVA病毒液在不同溫度下孵育時(shí)間延長(zhǎng)時(shí), SVA RNA拷貝數(shù)顯著下降,導(dǎo)致病毒復(fù)制降低。病毒滴度與RNA拷貝數(shù)結(jié)果說明SVA具有熱不穩(wěn)定性(P<0.05)。

圖3 SVA在4 (A)、25 (B)、37 ℃ (C)孵育后的拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值☆Fig.3 Log copies value of SVA after incubation at 4 (A), 25 (B), and 37 ℃ (C) ☆ A. 經(jīng)4 ℃孵育后的SVA拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值變化; B. 經(jīng)25 ℃孵育后的SVA拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值變化; C. 經(jīng)37 ℃孵育后的SVA拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值變化。與CK相比, ns P>0.05, * P<0.05, *** P<0.001, **** P<0.000 1。☆ A. The log value of the number of SVA copies decreased after incubation with 4 ℃; B. The log value of the number of SVA copies decreased after incubation with 25 ℃; C. The log value of the number of SVA copies decreased after incubation with 37 ℃. Compared with CK, ns P>0.05, * P<0.05, *** P<0.001, **** P<0.000 1.

2.3 酸穩(wěn)定性試驗(yàn)

為驗(yàn)證SVA具有酸不穩(wěn)定性的推測(cè),將SVA病毒液分別在不同pH值的檸檬酸鹽緩沖液和磷酸鹽緩沖液中孵育1 h, 檢測(cè)病毒滴度的變化。由圖4.A可見,對(duì)照組病毒滴度為108.42TCID50·mL-1; 在pH 4.0、5.8的檸檬酸鹽緩沖液中孵育1 h, 病毒滴度分別為104.90、105.79TCID50·mL-1; 在pH 6.6、7.2的磷酸鹽緩沖液中孵育1 h, 病毒滴度分別為106.68、107.60TCID50·mL-1。SVA病毒液孵育隨pH值的上升, SVA病毒滴度接近對(duì)照組病毒滴度,說明SVA對(duì)酸性環(huán)境較敏感(P<0.05)。

圖4 SVA在不同pH值孵育后的病毒滴度(A)與拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值(B)☆Fig.4 The viral titer (A) and log value of copies number (B) of SVA after incubation in selected pH☆ A. 不同pH值緩沖液孵育后的SVA病毒滴度下降; B. 不同pH值緩沖液孵育后的SVA拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值下降。與CK相比, **** P<0.000 1?！?A. The virus titer of SVA decreased after incubation with a buffer solution of selected pH values. B. The log value of the number of SVA copies decreased after incubation with buffer solutions with selected pH values. Compared with CK, **** P<0.000 1.

為進(jìn)一步確認(rèn)酸性環(huán)境對(duì)SVA RNA拷貝數(shù)的影響,將SVA病毒液在不同酸性緩沖液中孵育1 h, 通過RT-qPCR檢測(cè)SVA的RNA拷貝數(shù)。由圖4.B可見,對(duì)照組拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值為22.31; SVA在pH 4.0、5.8的檸檬酸鹽以及在pH 6.6、7.2的磷酸鹽緩沖液中孵育1 h, SVA RNA拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值分別為11.58、13.81及16.31、17.06, SVA病毒液在酸性環(huán)境孵育后,病毒顆粒穩(wěn)定性受到影響。病毒滴度和RNA拷貝數(shù)結(jié)果說明SVA具有酸不穩(wěn)定性(P<0.05)。

3 討論

自2007年美國(guó)報(bào)道首例SVA感染以來,我國(guó)的塞內(nèi)卡病疫情形勢(shì)日益嚴(yán)峻。據(jù)報(bào)道,我國(guó)半數(shù)省份發(fā)現(xiàn)SVA感染的情況[3], 隨著SVA的流行導(dǎo)致毒株間的基因組變異與重組現(xiàn)象,加劇新毒株的形成與流行,進(jìn)一步阻礙高效疫苗的研發(fā),同時(shí)SVA持續(xù)的遺傳進(jìn)化會(huì)增加毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)[21]。因此,需要持續(xù)跟蹤監(jiān)測(cè)SVA的流行情況,制訂合理防疫政策并開發(fā)安全高效的疫苗。分析SVA的酸和熱穩(wěn)定性,為病毒培養(yǎng)、疫苗研發(fā)、運(yùn)輸和儲(chǔ)存等提供一定的數(shù)據(jù)支持。本研究結(jié)果表明SVA具有酸和熱不穩(wěn)定性,與小RNA病毒科中的甲型肝炎病毒不同,但與同科的口蹄疫病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒及泰勒式鼠腦脊髓炎病毒(TMEV)表現(xiàn)出相似特性。接種疫苗是預(yù)防傳染病的有效措施,病毒的穩(wěn)定性對(duì)高效疫苗研發(fā)與應(yīng)用至關(guān)重要。酸性和溫?zé)岘h(huán)境嚴(yán)重影響口蹄疫病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒等小RNA病毒的穩(wěn)定性,進(jìn)而影響疫苗質(zhì)量和機(jī)體免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)[22]。因此在滅活疫苗、減毒活疫苗等傳統(tǒng)疫苗研發(fā)中,提高病毒的熱和酸穩(wěn)定性是提高疫苗質(zhì)量和維持高免疫原性的前提[6]。鑒于衣殼結(jié)構(gòu)是熱和酸穩(wěn)定性的重要影響因素,本研究在對(duì)SVA衣殼蛋白結(jié)構(gòu)分析時(shí),發(fā)現(xiàn)大量組氨酸位于SVA五聚體界面處,組氨酸殘基質(zhì)子化誘導(dǎo)的靜電斥力和相鄰五聚體之間的弱相互作用力可降低衣殼蛋白的穩(wěn)定性[7]。理化性質(zhì)分析表明VP1具有不穩(wěn)定性且耐熱性較差,而VP2—VP4較為穩(wěn)定但耐熱性依次遞減。此外, SVA衣殼蛋白間的熱點(diǎn)殘基較少,殘基間僅形成氫鍵和鹽橋。與泰勒式鼠腦脊髓炎病毒(TMEV)相比,不僅SVA衣殼蛋白間的熱點(diǎn)殘基數(shù)少于泰勒式鼠腦脊髓炎病毒,而且相互作用力也弱于后者[17]。據(jù)此推斷,在溫?zé)峄蛩嵝原h(huán)境下, SVA衣殼蛋白間的相互作用力受到影響,導(dǎo)致病毒顆粒穩(wěn)定性下降。

溫?zé)峄蛩嵝原h(huán)境變化可使衣殼蛋白變性,影響病毒衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)完整性。張燕紅等[23]在熱穩(wěn)定性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),將SVA在37、50 ℃等溫度下孵育較短時(shí)間后,病毒效價(jià)明顯下降。本研究在4、25 ℃等溫度下孵育較長(zhǎng)時(shí)間,發(fā)現(xiàn)病毒效價(jià)以及在細(xì)胞中病毒RNA拷貝數(shù)均呈下降趨勢(shì),表明SVA由于衣殼蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而影響病毒與受體結(jié)合,不能有效進(jìn)入細(xì)胞。Strauss等[24]在對(duì)SVA病毒顆粒在磷酸鹽緩沖液進(jìn)行酸穩(wěn)定性測(cè)試時(shí),發(fā)現(xiàn)pH<5.0的緩沖溶液中,病毒顆粒全部裂解成12S亞基,影響病毒的侵入和繁殖,本研究檢測(cè)的酸處理后病毒滴度減少的結(jié)果與此一致。然而,張燕紅等[23]在酸穩(wěn)定性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)SVA具有耐酸性。也有研究[9]發(fā)現(xiàn)鈉鹽在小RNA病毒中產(chǎn)生很強(qiáng)的衣殼穩(wěn)定作用,導(dǎo)致SVA酸穩(wěn)定試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)差異。Cao等[25]使用冷凍電鏡觀察到酸孵育后的SVA中VP1 GH環(huán)和 VP3 GH環(huán)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,導(dǎo)致衣殼蛋白間的相互作用減弱,衣殼蛋白間的穩(wěn)定性降低。Liu等[26]使用新型滅活劑β-丙內(nèi)酯(BPL)制備SVA滅活疫苗,發(fā)現(xiàn)0.3%～0.5% BPL形成的酸性環(huán)境會(huì)導(dǎo)致病毒顆粒含量下降,影響疫苗的免疫保護(hù)效力。綜上,在SVA疫苗生產(chǎn)過程中可采用改造抗原或添加保護(hù)劑等方法提高病毒顆粒的穩(wěn)定性。

小RNA病毒的快速進(jìn)化使不同毒株在理化性質(zhì)和熱點(diǎn)殘基上可能存在差異,后續(xù)研究將進(jìn)一步分析。同時(shí),本研究使用重組質(zhì)粒繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行絕對(duì)定量,質(zhì)粒模板與SVA cDNA模板的擴(kuò)增效率可能存在一定差異[27], 但并不影響總體趨勢(shì)的判斷?？傊? SVA衣殼蛋白形成病毒顆粒的相互作用力較弱,經(jīng)高溫或酸性緩沖液孵育后,無論是病毒滴度變化,還是RNA拷貝數(shù)的變化,均表現(xiàn)出熱和酸不穩(wěn)定趨勢(shì)。因此,本研究結(jié)果表明SVA具有熱與酸不穩(wěn)定性,在特定條件下會(huì)影響病毒顆粒的穩(wěn)定性。SVA感染引發(fā)的特發(fā)性水皰病在國(guó)內(nèi)快速流行,研究SVA的熱和酸穩(wěn)定性,不僅有助于了解病毒的流行潛力,還有助于新型高效疫苗和熱穩(wěn)定保護(hù)劑的研發(fā)。

4 結(jié)論

本研究使用多個(gè)生物信息學(xué)軟件對(duì)SVA衣殼蛋白的理化性質(zhì)和熱點(diǎn)殘基進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)衣殼蛋白并不穩(wěn)定,熱點(diǎn)殘基較少,蛋白質(zhì)間僅通過弱相互作用力結(jié)合而形成病毒顆粒。SVA病毒液在不同溫度和不同pH緩沖液中孵育后,病毒滴度和RNA拷貝數(shù)均有所下降,證實(shí)SVA具有熱和酸不穩(wěn)定性。