聚六亞甲基雙胍對(duì)蛋白核小球藻的毒性效應(yīng)研究

周 穎, 魏文志

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 江蘇揚(yáng)州 225009)

聚六亞甲基雙胍(polyhexamethylene biguanide, PHMB)為陽(yáng)離子聚合物,具有殺菌效果好、不揮發(fā)、水溶性好,對(duì)溫度、光照不敏感,便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)[1], 因此廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、日用化工、水產(chǎn)養(yǎng)殖等行業(yè)[2-3]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中,適量使用PHMB對(duì)主要水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種無(wú)毒副作用,常用作殺菌消毒劑來(lái)防治水產(chǎn)動(dòng)物疾病的暴發(fā)[4]。但歐洲化學(xué)品管理局風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估委員會(huì)已將PHMB認(rèn)定為可疑致癌物[5]。同時(shí)有研究[6-7]表明,以PHMB飼喂小鼠會(huì)導(dǎo)致其體重下降或絕食,出現(xiàn)肝細(xì)胞溶解和腎小管損傷,引起動(dòng)物血液生化指標(biāo)的改變和海綿狀血管瘤發(fā)病率的升高,甚至有引起肝癌的風(fēng)險(xiǎn)。

隨著PHMB在各行業(yè)中的大量使用,不可避免地被釋放到水環(huán)境中,隨著水環(huán)境中PHMB濃度的不斷升高,導(dǎo)致其在水生動(dòng)植物體內(nèi)殘留,影響水生動(dòng)物正常生長(zhǎng)甚至引起死亡,最終破壞水體生態(tài)環(huán)境平衡。據(jù)俞軍等[8]報(bào)道, PHMG可引起異育銀鯽呼吸困難,身體失去平衡,腹部朝上,最后沉入水底死亡。中國(guó)對(duì)蝦受精卵經(jīng)不同濃度PHMB浸泡后孵化率下降20%～32%, 變態(tài)率高達(dá)99%[9]。有研究[10]表明高濃度PHMB對(duì)球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)和亞心形扁藻(Marinemicroalga)的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用,肉眼可見(jiàn)藻液顏色逐漸變淡,按照水生生物毒性分級(jí), PHMB對(duì)2種藻類屬于中等毒性。然而, PHMB對(duì)許多其他浮游植物的毒性及作用機(jī)制尚不明確,亟需進(jìn)一步研究。

蛋白核小球藻(Chlorellapyrenidosa)是水生生態(tài)系統(tǒng)中最常見(jiàn)的單細(xì)胞藻類之一,由于其對(duì)污染物的高度敏感性,是研究生態(tài)毒理學(xué)的經(jīng)典模式生物[11]。本試驗(yàn)以蛋白核小球藻為研究對(duì)象,探討蛋白核小球藻在不同時(shí)間和濃度PHMB脅迫下的生長(zhǎng)狀態(tài)、葉綠素含量和抗氧化酶活性變化,并探究蛋白核小球藻中光合作用相關(guān)基因光合系統(tǒng)基因A (psbA)、核酮糖-l,5-二磷酸羧化·加氧酶 (rbcS)和1,5-二磷酸核酮糖羧化·加氧酶(rbcL)在PHMB脅迫后的表達(dá),為PHMB對(duì)水生植物的毒性作用機(jī)制研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

蛋白核小球藻購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)(FACHB-9); 聚六亞甲基雙胍(PHMB)購(gòu)自上海高聚生物科技公司(純度≥99%), 貨號(hào)為P832584-1g。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所); 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA提取試劑盒(南京諾唯贊生物科技公司); Goldview核酸染料(北京賽百盛生物科技公司); 瓊脂糖(北京全式金生物科技公司); DL2000TM DNA Marker、SYBR Premix ExTaq(日本TaKaRa公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

蛋白核小球藻用BG11培養(yǎng)基[12]在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),鏡檢小球藻細(xì)胞形態(tài)正常后,取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的蛋白核小球藻,置于1 000 mL的錐形瓶中進(jìn)行PHMB脅迫試驗(yàn)。在半數(shù)抑制濃度的基礎(chǔ)上, PHMB終濃度設(shè)置0 (CK)、1 (低)、2 (中)、4 (高) mg·L-14個(gè)濃度處理, 每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)條件: 溫度(28±1) ℃, 光照度3 000 lx, 光照周期13 h (晝)/11 h (夜)。每天定時(shí)手動(dòng)搖晃3次,并及時(shí)更換各組位置,以確保每個(gè)錐形瓶受到同等的光照度。于PHMB脅迫后0、3、6、9 d取小球藻樣品進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 藻細(xì)胞密度測(cè)定

用干燥吸管從錐形瓶中吸取100 μL藻液,滴于血球計(jì)數(shù)板中,緩慢放下蓋玻片,顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.2.3 葉綠素含量測(cè)定

分光光度法測(cè)定小球藻的葉綠素含量[13]。用量筒量取40 mL藻液, 0 ℃下8 000 r·min-1離心10 min, 棄去上清,收集藻細(xì)胞。超聲破碎儀破碎藻細(xì)胞,加入80%丙酮, 混勻后4 ℃避光浸提24 h。用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)663、645、440 nm處檢測(cè)吸光度,并計(jì)算葉綠素含量。葉綠素a含量/mg·L-1=12.7D663 nm-2.69D645 nm; 葉綠素b含量/mg·L-1=22.9D645 nm-4.68D663 nm。

1.2.4 細(xì)胞膜通透性測(cè)定

分別于PHMB脅迫0、3、6、9 d時(shí)用JENCO3173R電導(dǎo)率儀測(cè)定溶液中離子的電導(dǎo)率,以此評(píng)估藻細(xì)胞膜通透性[14]。

1.2.5 酶活性及MDA含量測(cè)定

按照南京建成試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行SOD、GSH-Px活性和MDA含量的測(cè)定。

1.2.6 細(xì)胞形態(tài)觀察

1) 蛋白核小球藻細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)觀察: 取藻液20 mL, 5 000 r·min-1離心10 min, 2.5%戊二醛固定, 4 ℃固定過(guò)夜,離心,丙酮(30%、50%、70%、80%、90%、100%、100%)逐級(jí)脫水,醋酸異戊酯置換過(guò)夜,真空冷凍干燥24 h, 將凍干的小球藻粉涂抹在導(dǎo)電膠上噴金處理[15]。在場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(GeminiSEM 300)下進(jìn)行樣品的觀察和拍照。

2) 蛋白核小球藻細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察: 取藻液20 mL, 5 000 r·min-1離心10 min, 2.5%戊二醛固定過(guò)夜, 0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)(PBS)漂洗3次; 1%鋨酸溶液固定樣品1.5 h; 樣品用乙醇梯度脫水,丙酮處理20 min; 70 ℃包埋過(guò)夜; 超薄切片后檸檬酸鉛和醋酸鈾雙染色[16]; 透射電鏡(Hitach-600)下進(jìn)行樣品的觀察和拍照。

1.2.7 基因表達(dá)分析

取50 mL藻液, 5 000 r·min-1離心10 min, 棄去上清液,收集藻細(xì)胞,使用Trizol一步法進(jìn)行樣品總RNA提取。瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度,去基因組反轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA, 以六堿基隨機(jī)引物合成第1條cDNA; 隨后加入DNA polymerase l、dNTPs、RNaseH等合成第2條cDNA。最后用熒光定量PCR檢測(cè)樣品中的基因表達(dá)水平,內(nèi)參基因?yàn)?8SrRNA[17]。引物合成由上海生工生物工程公司合成,序列如表2所示。采用2-ΔΔCt法定量和分析數(shù)據(jù)。

表1 定量引物序列Tab.1 Primer sequences for qPCR

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 PHMB對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

由圖1可見(jiàn),不同濃度PHMB脅迫對(duì)小球藻生長(zhǎng)有明顯的影響。脅迫9 d內(nèi), PHMB低、中濃度組小球藻密度較對(duì)照組有不同程度的減少,但總體呈現(xiàn)出緩慢上升的趨勢(shì)(P<0.05); PHMB高濃度組小球藻密度與對(duì)照組相比呈明顯的下降趨勢(shì), 脅迫9 d時(shí),密度降低96.7% (P<0.05)。隨著PHMB濃度和脅迫時(shí)間的增加,蛋白核小球藻生長(zhǎng)呈下降趨勢(shì),即抑制作用增強(qiáng),說(shuō)明PHMB對(duì)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)抑制呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。

圖1 PHMB對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響*Fig.1 Effects of polyhexamethyl biguanide (PHMB) on C.pyrenoidosa growth* 同一時(shí)間不同小寫字母處理間差異顯著(P<0.05)。* Different letters in the same time represent the significant difference of data (P<0.05).

2.2 PHMB對(duì)蛋白核小球藻葉綠素含量的影響

不同濃度PHMB脅迫后,對(duì)小球藻葉綠素a含量有明顯的影響(圖2.A)。脅迫3 d時(shí),低、中、高濃度組均顯著低于對(duì)照組,且不同濃度PHMB組間也存在顯著差異, PHMB濃度越高,葉綠素a含量越低。與對(duì)照組相比,脅迫3 d時(shí),低、中、高濃度組葉綠素a含量分別下降11.70%、29.07%和58.64% (P<0.05); 脅迫6 d時(shí),分別下降20.19%、39.35% 和83.88% (P<0.05); 脅迫9 d時(shí),分別下降5.32%、45.64%和88.62% (P<0.05)。不同濃度PHMB脅迫后,葉綠素b含量的變化趨勢(shì)與葉綠素a基本一致 (圖2.B)。與對(duì)照組相比,脅迫3 d時(shí),低、中、高濃度組葉綠素b含量分別下降11.70%、29.08%和58.65% (P<0.05); 脅迫6 d時(shí),分別下降20.19%、39.35%和83.88% (P<0.05); 脅迫9 d時(shí),分別下降5.32%、45.64%和88.62% (P<0.05)。本試驗(yàn)還觀察到高濃度組蛋白核小球藻顏色從初始的翠綠色逐步變成淡綠色,直至變成淡白色。

圖2 PHMB對(duì)小球藻葉綠素含量的影響*Fig.2 Effects of polyhexamethyl biguanide on chlorophyll content in C.pyrenoidosa* 同一時(shí)間不同小寫字母處理間差異顯著(P<0.05)。* Different letters in the same time represent the significant difference of data (P<0.05).

2.3 PHMB對(duì)小球藻細(xì)胞膜通透性的影響

與對(duì)照相比,暴露3 d時(shí),低、中、高濃度組的電導(dǎo)率分別上升4.98%、9.63%、12.11% (P<0.05); 暴露6 d時(shí),分別上升2.78%、7.19%、11.83% (P<0.05); 暴露9 d時(shí),分別上升7.61%、10.98%、16.27% (P<0.05)。這說(shuō)明PHMB濃度的增加,小球藻細(xì)胞膜通透性逐漸變高(圖3)。

圖3 PHMB對(duì)小球藻細(xì)胞膜通透性的影響*Fig.3 Effect of polyhexamethylene biguanid on permeability of chlorella cell membrane* 同一時(shí)間不同小寫字母處理間差異顯著(P<0.05)。* Different letters in the same time represent the significant difference of data (P<0.05).

2.4 PHMB脅迫下小球藻細(xì)胞形態(tài)的觀察

由蛋白核小球藻藻細(xì)胞掃描電鏡照片可見(jiàn),空白對(duì)照組藻細(xì)胞呈橢圓形,表面完整(圖4.A)。不同濃度PHMB脅迫9 d后藻細(xì)胞表面呈現(xiàn)出不同程度的損傷,尤其是高濃度組藻細(xì)胞表面細(xì)胞壁開(kāi)裂,大量?jī)?nèi)含物外滲,造成細(xì)胞粘連(圖4.B-D)。

圖4 蛋白核小球藻的掃描電子顯微鏡(SEM)觀察 (×8 000)*Fig.4 Scanning electron microscope observation of C.pyrenoidosa (×8 000)* A. 對(duì)照組, B. 1 mg·L-1, C. 2 mg·L-1, D. 4 mg·L-1; CW. 細(xì)胞壁, E. 滲出物質(zhì)。* A. control group, B. 1 mg·L-1, C. 2 mg·L-1, D. 4 mg·L-1; CW. cell wall, E. exudate substance.

由蛋白核小球藻的透射電子顯微鏡照片可見(jiàn),對(duì)照組蛋白核小球藻細(xì)胞呈廣橢圓形,細(xì)胞壁厚且完整,細(xì)胞核中的核仁與核膜清晰可見(jiàn); 細(xì)胞中可見(jiàn)完整的杯狀葉色素體,液泡和溶酶體完整(圖5.A)。不同濃度PHMB脅迫9 d后蛋白核小球藻細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的畸形 (圖5.B-D)。低濃度組蛋白核小球藻細(xì)胞壁增厚,而細(xì)胞結(jié)構(gòu)保持較為完整(圖5.B); 中濃度組藻體細(xì)胞壁松散,細(xì)胞核變形,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不完整,可觀察到細(xì)胞基質(zhì)的缺失,葉綠體和類囊體的完整性遭到破壞,線粒體變形,線粒體嵴減少,液泡體積和淀粉粒增大(圖5.C); 高濃度組蛋白核小球藻細(xì)胞呈不規(guī)則形狀,細(xì)胞壁褶皺,色素體和溶酶體萎縮,蛋白核結(jié)構(gòu)被破壞,大量?jī)?nèi)含物滲出,液泡消失(圖5.D)。這說(shuō)明蛋白核小球藻在高濃度PHMB的持續(xù)脅迫下,細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)均發(fā)生明顯改變。

圖5 蛋白核小球藻透射電子顯微鏡(TEM)觀察(×23 000)*Fig.5 Transmission electron microscophs observation of C.pyrenoidosa (×23 000)* A. 對(duì)照組, B. 1 mg·L-1, C. 2 mg·L-1, D. 4 mg·L-1; CW. 細(xì)胞壁, CM. 細(xì)胞膜, C. 色素體, P. 蛋白核, N. 細(xì)胞核, V. 液泡, E. 滲出物質(zhì), S. 溶酶體。* A. control group, B.1 mg·L-1, C.2 mg·L-1, D. 4 mg·L-1; CW. cell wall, CM. cell membrane, C. chromatophores, P. protein nucleus, N. nucleus, V. vacuole, E.exudate material, S. the lysosome.

2.5 PHMB對(duì)小球藻氧化應(yīng)激的影響

不同濃度PHMB脅迫對(duì)小球藻SOD活性的影響如圖6.A所示。脅迫3 d時(shí),與對(duì)照組相比,高濃度組SOD活性下降22.7% (P<0.05)。脅迫6、9 d時(shí),與對(duì)照組相比,各處理組SOD活性下降更加明顯,尤其是PHMB脅迫9 d時(shí),與對(duì)照組相比,中、高濃度組SOD活性分別下降58.6%和79.0% (P<0.05)。這說(shuō)明持續(xù)高濃度PHMB脅迫會(huì)降低蛋白核小球藻的SOD活性。

圖6 PHMB對(duì)小球藻抗氧化酶活性的影響*Fig.6 Effect of polyhexamethylene biguanide on antioxidant activity in C.pyrenoidosa* 同一時(shí)間不同小寫字母處理間差異顯著(P<0.05)。* Different letters in the same time represent the significant difference of data (P<0.05).

不同濃度PHMB對(duì)小球藻GSH-Px活性的影響如圖6.B所示。其變化趨勢(shì)與SOD類似,隨著PHMB脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增高,各處理組GSH-Px活性較對(duì)照組均呈下降趨勢(shì),且存在顯著差異。這說(shuō)明高濃度PHMB持續(xù)脅迫會(huì)降低蛋白核小球藻的GSH-Px活性。

不同濃度PHMB對(duì)小球藻MDA含量的影響如圖6.C所示。與對(duì)照組相比,隨著PHMB脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢(shì),高濃度組下降更加顯著。

2.6 PHMB對(duì)小球藻光合作用相關(guān)基因表達(dá)的影響

不同濃度PHMB脅迫下小球藻中光合作用相關(guān)基因的表達(dá)變化見(jiàn)圖7。脅迫3 d時(shí),各濃度組psbA基因表達(dá)上調(diào),其中高濃度組改變最為顯著,其psbA基因的表達(dá)量較對(duì)照組提高8.0倍(P<0.05)。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), PHMB對(duì)psbA的誘導(dǎo)作用減弱,脅迫9 d時(shí),與對(duì)照組相比,中、高濃度組psbA基因的表達(dá)量分別下降至對(duì)照的46.7%和78.3% (P<0.05) (圖7.A)。rbcL基因的表達(dá)變化與psbA表達(dá)變化趨勢(shì)相似,在PHMB脅迫3 d時(shí)顯示出較強(qiáng)烈的誘導(dǎo)效應(yīng),高濃度組較對(duì)照組上升4.0倍(P<0.05), 脅迫6 d時(shí)低濃度組較對(duì)照組上升4.0倍(P<0.05), 而脅迫9 d時(shí), PHMB的誘導(dǎo)效應(yīng)顯著降低(圖7.B)。rbcS基因的表達(dá)在PHMB的脅迫下,其變化不同于psbA和rbcL, 脅迫3 d時(shí),中濃度組表達(dá)量較對(duì)照組上升4.5倍(P<0.05); 脅迫6、9 d時(shí),除高濃度組外,其他組誘導(dǎo)效應(yīng)均有減弱趨勢(shì)(圖7.C)。

圖7 PHMB對(duì)小球藻光合作用相關(guān)基因表達(dá)的影響*Fig.7 Effect of polyhexamethylene biguanide on the relative expression of photosynthesis-related genes in C.pyrenoidosa* 同一時(shí)間不同小寫字母處理間差異顯著(P<0.05)。* Different letters in the same time represent the significant difference of data (P<0.05).

3 討論

PHMB在諸多行業(yè)中大量使用,導(dǎo)致其在水環(huán)境中廣泛分布,給水體生態(tài)造成一定的威脅。本試驗(yàn)以蛋白核小球藻為研究對(duì)象,用0、1、2、4 mg·L-1濃度的PHMB脅迫3、6、9 d后,對(duì)小球藻生長(zhǎng)性能、葉綠素含量和抗氧化酶活性均產(chǎn)生明顯的影響,蛋白核小球藻中光合作用相關(guān)基因表達(dá)量也發(fā)生明顯變化,這進(jìn)一步加深PHMB對(duì)浮游植物毒性的認(rèn)識(shí)。中、高濃度PHMB顯著抑制蛋白核小球藻的生長(zhǎng)并降低葉綠素含量,細(xì)胞膜、細(xì)胞器等細(xì)胞結(jié)構(gòu)均有明顯的皺縮和破損現(xiàn)象,抗氧化酶活性和光合作用相關(guān)基因表達(dá)量也有不同程度的改變。

在PHMB的脅迫下,蛋白核小球藻的生長(zhǎng)性能和表面結(jié)構(gòu)均產(chǎn)生明顯的變化。小球藻生長(zhǎng)試驗(yàn)顯示,不同濃度的PHMB對(duì)小球藻的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用,且隨著PHMB濃度的增加,抑制作用增強(qiáng),即具有濃度依賴效應(yīng)。在掃描電鏡下可觀察到藻細(xì)胞團(tuán)變小,細(xì)胞壁開(kāi)裂,肉眼可見(jiàn)藻液顏色變淡。這可能是因?yàn)镻HMB表面帶有正電荷,而藻類的細(xì)胞顆粒帶有負(fù)電荷,通過(guò)靜電吸引作用可使藻細(xì)胞形成絮團(tuán),并與細(xì)胞磷脂化合物結(jié)合,導(dǎo)致膜脂結(jié)構(gòu)破壞和膜脂組成改變,從而抑制小球藻生長(zhǎng),導(dǎo)致其死亡[17]。

在PHMB的脅迫下,蛋白核小球藻葉綠素含量變化與其生長(zhǎng)指標(biāo)表現(xiàn)出相似的規(guī)律,即隨著PHMB濃度的增加,葉綠素含量下降。Ikeda等[18]研究發(fā)現(xiàn)PHMB能改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和流動(dòng)性,進(jìn)而對(duì)細(xì)胞器造成破壞。本試驗(yàn)透射電鏡觀察顯示, PHMB同樣可破壞小球藻的細(xì)胞結(jié)構(gòu),破壞小球藻的內(nèi)部蛋白核、葉綠體和類囊體結(jié)構(gòu)等,導(dǎo)致葉綠素合成減少。同時(shí),因小球藻細(xì)胞光合作用的能力被抑制,葉綠素含量降低和功能調(diào)節(jié)紊亂,導(dǎo)致藻體無(wú)法維持自身生長(zhǎng)需求,使其生長(zhǎng)受到抑制。這表明葉綠素含量與小球藻生長(zhǎng)密度關(guān)系密切,且在受到環(huán)境脅迫后兩者之間會(huì)互相影響。

小球藻細(xì)胞在長(zhǎng)期抵御環(huán)境脅迫過(guò)程中,進(jìn)化出抗活性氧(ROS)損傷的保護(hù)系統(tǒng),包括SOD、GSH-Px和過(guò)氧化氫酶 (CAT) 等抗氧化酶。在PHMB的脅迫下, SOD和GSH-Px在不同時(shí)間段呈現(xiàn)出隨PHMB濃度的升高而下降的趨勢(shì)。Cao等[19]研究發(fā)現(xiàn)小球藻在聚維酮碘的脅迫下SOD活性降低,這是因?yàn)樾∏蛟迨艿捷^強(qiáng)的環(huán)境脅迫,本試驗(yàn)結(jié)果與此類似。GSH-Px以谷胱甘肽(GSH)為底物, 催化過(guò)氧化氫降解為水[20], 本試驗(yàn)中其活性較對(duì)照組明顯下降,其原因可能是藻體受到PHMB脅迫時(shí),抑制GSH-Px活性[21]。MDA是自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化的最終分解產(chǎn)物, MDA含量直接反映ROS在藻類的積累和脂質(zhì)過(guò)氧化程度,是評(píng)價(jià)膜系統(tǒng)受損程度和藻類抗逆性的重要參數(shù)[22]。MDA含量隨著PHMB濃度的升高而先升高后降低,表明小球藻遇到有毒物質(zhì),其含量因機(jī)體發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化而不斷增加,而后MDA含量下降,這可能是因?yàn)闄C(jī)體細(xì)胞膜的破裂,導(dǎo)致MDA釋放至胞外水體中。

在PHMB的脅迫下,蛋白核小球藻光合作用基因的表達(dá)量在不同時(shí)間段呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。D1蛋白是光系統(tǒng)Ⅱ (PSⅡ)反應(yīng)中心的重要蛋白,由pbsA基因編碼,是高等植物和藻類葉綠體基因組中重要光調(diào)控基因[23]。pbsA在PHMB脅迫后呈先上調(diào)后下降的趨勢(shì),處理前期短時(shí)間內(nèi)的上調(diào)可能與藻細(xì)胞受到一定程度的應(yīng)激有關(guān),從而提高PSⅡ活性; 但隨著PHMB濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng),藻細(xì)胞自身遭到破壞,其表達(dá)量也隨之降低。核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)是參與植物光合作用的一種關(guān)鍵酶,它既能轉(zhuǎn)化CO2, 又能在光呼吸中催化O2的氧化反應(yīng),因此Rubisco對(duì)植物的凈光合率具有重要影響[24-25]。其中Ⅰ型Rubisco酶由大亞基(RbcL)和小亞基(RbcS)組成, RbcL具有催化作用,而RbcS發(fā)揮調(diào)節(jié)大亞基RbcL活性的作用[26-27]。在PHMB脅迫下rbcL和rbcS的表達(dá)與psbA類似,即短時(shí)間(3～6 d)脅迫顯著提高RbcL和RbcS基因的表達(dá)量,表明藻體對(duì)PHMB毒害的代償調(diào)節(jié)狀態(tài),而脅迫9 d時(shí)RbcL和RbcS基因的表達(dá)量均明顯下降,進(jìn)一步說(shuō)明長(zhǎng)期的PHMB脅迫使蛋白核小球藻光合作用調(diào)節(jié)失代償。莊航等[17]研究發(fā)現(xiàn)小球藻rbcL、rbcS在乙草胺脅迫下表達(dá)量持續(xù)降低,光合功能持續(xù)下降,最終導(dǎo)致不可逆失活直至死亡,說(shuō)明PHMB對(duì)小球藻光合作用相關(guān)基因的表達(dá)起著重要的作用。

4 結(jié)論

PHMB對(duì)蛋白核小球藻有較強(qiáng)的毒性。PHMB抑制蛋白核小球藻的生長(zhǎng),使細(xì)胞壁破裂,細(xì)胞器遭到破壞,影響蛋白核小球藻葉綠素含量; 并在細(xì)胞內(nèi)生成大量的活性氧自由基,致使小球藻抗氧化相關(guān)酶失衡; 光合作用相關(guān)基因pbsA、rbcL和rbcS的表達(dá)量在PHMB脅迫下呈先上升后下降趨勢(shì),顯示出小球藻對(duì)PHMB脅迫下的反饋調(diào)節(jié)作用。這為PHMB對(duì)小球藻的毒性效應(yīng)研究提供了參考,并為PHMB的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了依據(jù)。