結(jié)核病分子檢測靶標(biāo)研究進(jìn)展

朱銀銀 張洪英★

分枝桿菌種類繁多，部分菌種感染人體后會(huì)造成健康威脅。根據(jù)臨床致病，可將分枝桿菌分為如下幾類［1］：一、導(dǎo)致結(jié)核?。╰uberculosis，TB）的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（Mycobacterium tuberculosiscomplex，MTBC）；二、導(dǎo)致麻風(fēng)?。╨eprae）的麻風(fēng)桿菌（Mycobacterium.leprae，M.leprae）；三、導(dǎo)致非結(jié)核分枝桿菌?。╪ontuberculous mycobacterial disease，NTMD）的非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculousmycobacteria，NTM）。因?yàn)椴煌锓N在流行病學(xué)、宿主譜和藥物敏感性等方面存在差異，所以可靠地識(shí)別分枝桿菌感染對(duì)指導(dǎo)公共衛(wèi)生決策至關(guān)重要。

TB 是世界流行性疾病，主要由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染造成，牛型結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium.Bovis，M.bovis）和卡介苗（Bacillus Calmette Guerin，BCG）感染也較多見，偶見MTBC 中其他分枝桿菌的感染［2］。

結(jié)核病的常規(guī)診斷方法為涂片法和培養(yǎng)法。涂片法使用廣泛，但靈敏度和特異度較低。培養(yǎng)法培養(yǎng)周期長、易受實(shí)驗(yàn)環(huán)境限制且對(duì)技術(shù)人員要求高。分子鑒定作為傳統(tǒng)鑒定方法的替代或補(bǔ)充，具有更靈敏、快速、簡便的特點(diǎn)。核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)（nucleic acid amplification tests，NAATs）是利用各種病原體的特異性基因片段以靶向檢測與鑒定菌種的辦法。

本文綜述了已報(bào)道的分子檢測靶標(biāo)在以下幾個(gè)方面的應(yīng)用：一、檢測MTBC；二、對(duì)MTBC 進(jìn)行鑒定；三、確定MTBC 耐藥性。

1 MTBC 檢測靶標(biāo)

在結(jié)核病診斷過程中，區(qū)分MTBC 和NTM 至關(guān)重要。常用插入序列IS6110、16SrRNA和hsp65基因區(qū)分MTBC 與NTM。

1.1 IS6110

插入序列（insertion sequence，IS）是可移動(dòng)的遺傳元件［3］，由兩端反向重復(fù)序列和中間的轉(zhuǎn)座酶編碼序列組成，在不同的細(xì)菌和支原體中具有顯著多樣性，最早應(yīng)用于分枝桿菌的診斷與鑒定。

IS6110僅存在于MTBC 中，已成為區(qū)分MTBC 和其他分枝桿菌的重要工具［4］。基于臨床分離株之間的IS6110拷貝數(shù)和染色體位置變異產(chǎn)生的多態(tài)性，為每一株MTBC 提供了獨(dú)特DNA 圖譜。IS6110限制性片段多態(tài)性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）已被廣泛用作結(jié)核病流行病學(xué)研究金標(biāo)準(zhǔn)［4］。但該方法對(duì)IS6110低于5 拷貝的菌株分型能力不夠，并且手動(dòng)RFLP 方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力且技術(shù)要求高，這需要研究人員進(jìn)一步開發(fā)新的檢測試劑盒。相比于培養(yǎng)法和涂片法，IS6110實(shí)時(shí)PCR 在肺結(jié)核診斷中表現(xiàn)出高靈敏度和特異度［5］。液滴數(shù)字PCR（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）可以檢測到血漿中存在的濃度很低的IS6110［6］，即使是無癥狀的結(jié)核接觸者，也可以檢出血漿中的結(jié)核DNA［7］。盡管ddPCR 被認(rèn)為是定量MTB 的可靠且可重復(fù)的方法，但是樣品質(zhì)量和DNA 提取過程是主要的誤差來源［8］。日本Eiken 公司基于IS6110生產(chǎn)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）檢測試劑盒被世界衛(wèi)生組織推薦應(yīng)用于臨床結(jié)核病檢測，但該技術(shù)的靈敏度和特異度低于Xpert MTB/RIF 技術(shù)［9］。LAMP 檢測結(jié)果取決于樣本質(zhì)量，這表示需要建立有效的標(biāo)準(zhǔn)化檢測系統(tǒng)，以避免低質(zhì)量的樣本收集和核酸制備導(dǎo)致的結(jié)果偏差。IS6110在結(jié)核病NAATs 診斷中廣泛應(yīng)用，但值得注意的是，該IS在極少部分的菌株里存在缺失，這可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果出現(xiàn)［10］，此時(shí)需要結(jié)合其他診斷方法綜合判斷。

1.2 16SrRNA

16SrRNA存于除病毒外的所有微生物中，被認(rèn)為是鑒定所有細(xì)菌的金標(biāo)準(zhǔn)［11］。16SrRNA由保守區(qū)和高變區(qū)交錯(cuò)排列組成，保守區(qū)是所有細(xì)菌共有，高變區(qū)在不同細(xì)菌中具有特異性，因此可以根據(jù)菌種特異性設(shè)計(jì)引物。利用16SrRNA基因的特異性引物，實(shí)時(shí)PCR 可以幫助區(qū)分MTBC 和NTM，能夠達(dá)到較低檢測限并區(qū)分活菌與死菌［12］。然而，僅對(duì)16SrRNA進(jìn)行分析不足以準(zhǔn)確區(qū)分MTBC 和NTM 菌種，因?yàn)镸TBC 成員之間具有高度同源性，且一些NTM 之間具有相同的16SrRNA序列［13］。

1.3 HSP65 基因

熱休克蛋白（Heat Shock Protein，HSP）保守存在于分枝桿菌中，也在分枝桿菌屬不同菌種之間存在較大差異。使用HSP65PCR-RFLP 方法可以區(qū)分MTBC 和NTM，可為臨床提供信息［14］。Kadasu等［15］通過HSP65基因測序發(fā)現(xiàn)了新型稀有的NTM。Wang等［16］使用HSP65基因測序成功區(qū)分NTM 與非分枝桿菌，同時(shí)確定了40 種NTM 菌株與MTB。然而，也有研究表明HSP65基因?qū)TM 的鑒別能力低于編碼冷休克蛋白的danJ基因［17］。

2 MTBC 鑒別靶標(biāo)

MTBC 成員之間的毒力、致病性和藥物敏感性的差異導(dǎo)致疾病治療多樣性，顯示出提供具有物種區(qū)分能力的標(biāo)記物的重要性。mtp40基因、cyp141基因和mtss90基因片段有助于區(qū)分MTBC 成員。

2.1 mtp40 基因

mtp40基因（Mycobacterium tuberculosis protein 40，mtp40）是MTB 中特異性抗原的編碼基因。有研究表明，mtp40和IS6110基因的多重LAMP 可在40 min 內(nèi)檢測出125fg MTB DNA，并且可以有效地將MTB 與MTBC 中的其他成員區(qū)分［18］。另外，有研究者發(fā)現(xiàn)mtp40與坎納分枝桿菌有交叉［19］，這表明不能單一依靠mtp40基因進(jìn)行結(jié)核病診斷。

2.2 cyp141 基因

細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450，cyp）是MTB中的一種代謝蛋白。Darban等［20］將cyp141基因作為新的靶點(diǎn)檢測從痰標(biāo)本中分離出的MTB。Farzam等［21］的研究表明cyp141基因的PCR 檢測（培養(yǎng)分離菌株為97.1%，臨床痰標(biāo)本為85.7%）比IS6110基因PCR 檢測（培養(yǎng)分離株為95.1%，臨床痰標(biāo)本為42.9%）更為敏感，并且這兩個(gè)靶基因的特異度相等（100%）。然而，在檢出特異性方面，出現(xiàn)了相反的結(jié)果，Darban等［20］的研究表示該基因部分存在于M.bovis 和BCG 中；而Farzam等［21］使用的引物不會(huì)與M.bovis 發(fā)生結(jié)合。以上研究表明，關(guān)于cyp141基因?qū)TB 的檢測特異性，需要研究者根據(jù)差異性核酸片段設(shè)計(jì)特異性引物以區(qū)別檢測MTB 感染者或M.bovis 感染者和BCG 接種者。

2.3 mtss90 基因片段

有研究者使用在線數(shù)據(jù)庫中微生物的完整基因組數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)軟件，鑒定了MTB 特異性序列90（Mycobacterium tuberculosisspecific sequence 90，mtss90）［19］。它在329 株分枝桿菌與IS6110、16SrRNA的診斷符合率為100%［19］。與mtp40相比，其不但能夠區(qū)分MTB 與卡介苗感染者，還能區(qū)分MTB 與非洲分枝桿菌、坎納分枝桿菌，除與微小分枝桿菌有交叉反應(yīng)外，特異性良好［19］。有研究以RPA 技術(shù)為基礎(chǔ)對(duì)mtss90進(jìn)行擴(kuò)增檢測，該方法與臨床診斷有96.43%的符合率［22］。關(guān)于mtss90的研究較少，仍需作進(jìn)一步評(píng)價(jià)。

3 MTBC 耐藥檢測標(biāo)靶

MTBC 耐藥性的檢測對(duì)結(jié)核病防控具有積極意義。MTBC 耐藥檢測標(biāo)靶具有雙重意義，既可以檢測MTBC，又可以檢測出耐藥性。

3.1 rpoB 基因

rpoB基因（RNA polymerase B subunit，rpoB）突變導(dǎo)致近95%利福平（rifampicin，RIF）耐藥菌株產(chǎn)生［23］。其在分枝桿菌屬中具有多態(tài)性，可用于分枝桿菌檢測與鑒定，與16SrRNA相比，可以更進(jìn)一步區(qū)分NTM 間的菌種［24］。此外，rpoB基因還可以作為結(jié)核病患者RIF 耐藥檢測靶點(diǎn)。Xpert-MTB/RIF以rpoB基因?yàn)榘谢驅(qū)崿F(xiàn)對(duì)MTBC DNA 及利福平耐藥性的檢測。關(guān)于Xpert-MTB/RIF 技術(shù)的meta分析顯示靈敏度為79%，特異度為90%［25］。Xpert-MTB/RIF Ultra 相較于Xper MTB/RIF 技術(shù)，額外整合兩個(gè)多拷貝的分子靶標(biāo)（IS6110和IS1081）來檢測結(jié)核菌［26］，提高了少菌型結(jié)核樣本的靈敏度［27］。有研究發(fā)現(xiàn)部分RIF 耐藥菌株沒有發(fā)生在RIF 耐藥突變區(qū)，并且即使有些菌株rpoB基因發(fā)生突變，但仍對(duì)RIF 敏感［28］，這提示僅使用Xpert MTB/RIF技術(shù)無法檢測出所有RIF 耐藥菌株。

3.2 katG 基因

katG基因（catalase-peroxidase）有助于激活異煙肼（isoniazid，INH）藥物和產(chǎn)生抑制脂質(zhì)與核酸生物合成酶的活性物質(zhì)。50%～90%的INH 耐藥結(jié)核菌株都是由katG基因的315 號(hào)密碼子單一突變引起［29］。德國Hain 公司根據(jù)katG基因和rpoB基因生產(chǎn)的檢測耐多藥結(jié)核試劑盒（GenoType MTBDR plus），與表型藥物敏感性實(shí)驗(yàn)相比，對(duì)RIF 耐藥檢測的敏感性和特異性為98.7%和88.9%，對(duì)INH 耐藥檢測的敏感性和特異性為82.1%和94.4%［30］。單一檢測INH 耐藥基因的方法有溶解曲線分析法［31］和PCR-RFLP［32］等。然而，少部分INH 耐藥性的產(chǎn)生與其他基因突變有關(guān)［29］，單一檢測方法無法全部檢測出INH 耐藥。

3.3 gyrA和gyrB 基因

DNA 解旋酶基因A（gyrase subunit A，gyrA）突變是導(dǎo)致氟喹諾酮類藥物（fluoroquinolones，F(xiàn)Qs）耐藥發(fā)生的主要原因，部分是由gyrB突變引起［33］。此外，F(xiàn)Qs 耐藥的突變有可能發(fā)生在gyrA和gyrB的FQ 抗性決定區(qū)之外［34］。有研究表明，gyrBPCR-RFLP 方法用于診斷結(jié)核病并鑒定MTBC 中的MTBC 和M.bovis，但無法分辨MTB和非洲分枝桿菌［35］。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，絕對(duì)完美的分子診斷靶標(biāo)未出現(xiàn)。在實(shí)際臨床應(yīng)用中，可以根據(jù)檢測要求和儀器設(shè)備選擇合適的靶標(biāo)和檢測方法。但多個(gè)靶標(biāo)的聯(lián)合應(yīng)用會(huì)提高靈敏度和特異度，并對(duì)菌株的耐藥性做出檢測。技術(shù)的進(jìn)步并非旨在取代傳統(tǒng)檢測，而是在疾病診斷中發(fā)揮重要的補(bǔ)充作用，特異性分子靶標(biāo)和不斷完善的實(shí)驗(yàn)技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建快速、靈敏、準(zhǔn)確且適宜經(jīng)濟(jì)水平低而疾病負(fù)擔(dān)高地區(qū)的NATTs 技術(shù)對(duì)于結(jié)核病流行的控制具有重要意義。