血清miR-152、miR-153和miR-203 在宮頸上皮內(nèi)病變中的表達及臨床意義

胡引男 祝茹 吳秀秀 國萍

子宮頸癌（cervical cancer，CC）是全球女性最常見的癌癥之一，高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是其主要發(fā)病原因［1］。根據(jù)組織學(xué)表型，子宮頸癌可分為浸潤性鱗狀細胞癌、腺癌和其他少見類型［2］。鱗狀細胞癌主要起源于宮頸上皮內(nèi)病變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN），CIN 是指宮頸上皮細胞的異常增生和變性，分為低度鱗狀上皮內(nèi)病變（Low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）和高度鱗狀上皮內(nèi)病變（High-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）［3-4］。宮頸上皮內(nèi)病變是子宮頸癌的前期病變，如果不及時治療，可能會發(fā)展成CC。因此，有必要發(fā)現(xiàn)新的生物標記物，以便及早發(fā)現(xiàn)高級別CIN。

微小RNA（microRNA，miRNA）是由約22 個核苷酸組成的小的內(nèi)源性單鏈RNA，異常表達的miRNA 在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要的角色［5］。miR-152、miR-153和miR-203在多種腫瘤中具有重要的調(diào)控功能［6-7］。本研究將通過分析宮頸上皮內(nèi)病變患者miR-152、miR-153和miR-203表達情況，以期為臨床宮頸上皮內(nèi)病變的診治提供新思路，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2019 年12 月至2020 年12 月安慶市立醫(yī)院收治的宮頸上皮內(nèi)病變患者80 例。根據(jù)宮頸上皮內(nèi)病變級別［8］分為LSIL 組（n=48）和HSIL 組（n=32）。納入標準：患者符合CIN 的診斷標準［9］；患者年齡在18～75 歲之間；患者在本院接受宮頸活檢或?qū)m頸錐形切除以獲得宮頸組織樣本，并采集其宮頸病變組織。排除標準：臨床資料不全者；合并嚴重心、肝、腎相關(guān)疾病者；精神疾病或腦血管疾病患者；合并腫瘤患者。另選取同期因子宮肌瘤入院、宮頸篩查正常病例50 例作為對照組。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書并自愿參與研究。

1.2 資料收集及實驗室檢測

1.2.1 基本資料

收集患者性別、年齡、BMI、吸煙史等基本資料。

1.2.2 血清

CEA、CA199 和CA125 水平的測定采用ELISA（試劑盒購自上海信裕生物科技有限公司）測定血清CEA、CA199 和CA125 水平，使用酶標 儀在450 nm 處讀取樣品。

1.3 血清miR-152、miR-153和miR-203 水平檢測

所有入組患者在入組72 h 內(nèi)抽取靜脈血5 mL，3 000 r/min（離心半徑為10 cm）離心20 min 分離血清，使用TRIzol RNA 試劑盒（購自賽默飛世爾科技有限公司）提取總RNA，紫外分光光度計（上海美譜達公司）檢測總RNA 濃度及純度。取2 μg 總RNA 使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司）進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR擴增。PCR 反應(yīng)體系為10 μL體系，包括SYBR Premix Ex Taq 5 μL、正向引物0.3 μL、反向引物0.3 μL、cDNA 1 μL、雙蒸水3.4 μL。用2^（-ΔΔCt）法計算各組基因的相對表達量。miR-152、miR-153和miR-203分子熒光PCR 引物序列見表1。

表1 miR-152、miR-153和miR-203 擴增引物序列Table 1 Amplified primer sequences for miR-152、miR-153 and miR-203

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析處理。符合正態(tài)分布的計量資料采用（）表示，采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗；將單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義的納入多因素分析，多因素分析采用Logistic 回歸模型，診斷價值分析采用受試者工作特征曲線（ROC）進行評價，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料比較

兩組年齡、BMI、吸煙史、CEA、CA199、CA125 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩組臨床資料比較［（），n（%）］Table 2 Comparison of clinical data between two groups［（），n（%）］

表2 兩組臨床資料比較［（），n（%）］Table 2 Comparison of clinical data between two groups［（），n（%）］

2.2 兩組血清miR-152、miR-153和miR-203 水平比較

CIN 組血清miR-152、miR-153和miR-203水平顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組血清miR-152、miR-153和miR-203水平比較（）Table 3 Comparison of serum levels of miR-152，miR-153 and miR-203 between the two groups（）

表3 兩組血清miR-152、miR-153和miR-203水平比較（）Table 3 Comparison of serum levels of miR-152，miR-153 and miR-203 between the two groups（）

2.3 多因素Logistic 回歸分析CIN 的影響因素

將單因素分析中具有統(tǒng)計學(xué)意義的變量作為自變量，以是否CIN 作為因變量（是=1，否=0）進行多因素Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示miR-152（OR=0.271）、miR-153（OR=0.201）和miR-203（OR=0.164）是CIN 的影響因素（P＜0.05）。見表4。

表4 多因素Logistic 回歸分析CIN 的影響因素Table 4 Multivariate Logistic regression analysis of the influencing factors of cervical intraepithelial lesions

2.4 miR-152、miR-153和miR-203 對CIN 的診斷價值

miR-152、miR-153和miR-203診斷CIN 的ROC曲線下面積分別為0.825、0.755 和0.792，miR-152、miR-153和miR-203的特異性/敏感性分別為80.55%/78.65%、72.12%/71.90%和76.93%/78.13%。見表5、圖1。

圖1 ROC 曲線Figure 1 ROC curve

表5 miR-152、miR-153和miR-203 對CIN 的診斷價值分析Table 5 Analysis of the diagnostic value of miR-152，miR-153 and miR-203 in cervical intraepithelial lesions

2.5 不同CIN 級別患者血清miR-152、miR-153和miR-203 水平比較

LSIL 組患者血清miR-152、miR-153和miR-203水平顯著高于HSIL 組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表6。

表6 不同CIN 級別患者血清miR-152、miR-153和miR-203 水平比較（）Table 6 Changes of serum miR-152，miR-153 and miR-203 levels in patients with different CIN grades（）

表6 不同CIN 級別患者血清miR-152、miR-153和miR-203 水平比較（）Table 6 Changes of serum miR-152，miR-153 and miR-203 levels in patients with different CIN grades（）

3 討論

子宮頸癌是全球女性第三大常見癌癥，子宮頸癌的發(fā)展是一個多步驟的過程，通常經(jīng)歷正常宮頸上皮細胞（正常細胞）、子宮頸上皮細胞的早期變化、宮頸上皮內(nèi)病變，最后發(fā)展為子宮頸癌。宮頸癌前病變通常是可以治愈的，在早期發(fā)現(xiàn)宮頸病變有助于改善臨床結(jié)果，從而降低子宮頸癌患者的死亡率。通過尋找宮頸上皮內(nèi)病變的診斷標志物，可以提高對該病變的早期檢測和診斷的準確性和敏感性。

本研究發(fā)現(xiàn)，子宮頸癌患者miR-152、miR-153和miR-203的表達低于對照組，蘇紅娥等［10］研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-153表達水平在子宮頸癌患者中明顯下調(diào)，血清miR-153低表達與宮頸癌患者的臨床分期、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管浸潤有關(guān)。Wang等［11］研究發(fā)現(xiàn)，miR-152和miR-203在子宮頸癌患者中表達下調(diào)。以上研究結(jié)果均與本研究一致。進一步多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，miR-152（OR=0.271）、miR-153（OR=0.201）和miR-203（OR=0.164）是宮頸上皮內(nèi)病變的影響因素。提示miR-152、miR-153和miR-203的下調(diào)可能與宮頸上皮內(nèi)病變的發(fā)展和進展相關(guān)，這些miRNA 的降低可能導(dǎo)致細胞增殖、分化和凋亡等異常的生物學(xué)過程，進而促進宮頸上皮細胞向惡性轉(zhuǎn)化。這些結(jié)果進一步支持了miR-152、miR-153 和miR-203 在CIN 發(fā)展中的潛在作用，并強調(diào)了它們作為潛在生物標志物的重要性。

在本研究中，miR-152、miR-153和miR-203診斷CIN 的ROC 曲線下面積分別為0.825、0.755和0.792，miR-152、miR-153和miR-203的特異性/敏感性分別為80.55%/78.65%、72.12%/71.90%和76.93%/78.13%，這表明miR-152、miR-153和miR-203都具有較高的診斷學(xué)的價值。王媛媛等［12］研究發(fā)現(xiàn)，沉默lncRNA XIST、加入miR-153模擬物能明顯降低宮頸癌細胞的侵襲、遷移及增殖，抑制增殖蛋白CDK4、Cyclin D1 及侵襲蛋白MMP-9、MMP-2的表達，降低EMT 相關(guān)基因SNAI1及相關(guān)蛋白N-cadherin、Vimentin、IL-6、SNAI1 的表達，促進E-cadherin 升高，說明沉默lncRNA XIST 靶向上調(diào)miR-153，可以抑制子宮頸癌細胞的遷移、侵襲以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）。付建等［13］研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組患者miR-152的表達水平低于癌前病變組，癌前病變組患者miR-152的表達水平低于宮頸炎組，miR-152在子宮頸癌診斷中具有較高的準確率，是宮頸癌和宮頸疾病早期診斷和篩查的主要標志物和重要手段。陳青青等［14］研究發(fā)現(xiàn)，miR-152在宮頸癌細胞株SiHa 中低表達，上調(diào)其表達可下調(diào)DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）表達，抑制癌細胞的增殖，降低癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。李亞芹等［15］研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-203可降低SiHa 細胞的增殖率和遷移率，升高細胞凋亡率；相反，低表達miR-203可升高SiHa 細胞的增殖率和遷移率，降低細胞凋亡率，說明miR-203在子宮頸癌中可能具有調(diào)節(jié)細胞增殖、遷移和凋亡的重要功能，miR-203在子宮頸癌的診斷和治療中可能具有潛在的應(yīng)用價值。本文進一步研究發(fā)現(xiàn)，LSIL 組患者血清miR-152、miR-153和miR-203水平顯著高于HSIL 組，說明miR-152、miR-153和miR-203可以作為LSIL 患者和HSIL 患者之間的區(qū)分指標。

綜上所述，血清miR-152、miR-153和miR-203在宮頸上皮內(nèi)病變患者中呈異常表達，三者或可作為診斷宮頸上皮內(nèi)病變的指標。