cAMP/PKA-pCREB 信號(hào)通路在早期康復(fù)訓(xùn)練改善腦卒中患者神經(jīng)功能中的作用

孫小星 顧玉玲 陳文雅 周徐 周曉茂 孫龔衛(wèi)

缺血性腦卒中是臨床常見的腦卒中類型，以腦組織缺血缺氧損害為基本病理生理特征，雖然通過介入、抗凝、溶栓等治療能夠恢復(fù)缺血腦組織的血流、減輕缺血缺氧損害，但因?yàn)椴糠帜X組織已經(jīng)發(fā)生不可逆損害、所以會(huì)遺留不同程度的神經(jīng)功能缺損，諸如認(rèn)知功能障礙、運(yùn)動(dòng)功能障礙、語言功能障礙等［1-2］。隨著近些年缺血性腦卒中綜合治療手段的不斷發(fā)展，早期康復(fù)訓(xùn)練對(duì)缺血性腦卒中患者神經(jīng)功能的改善作用受到越來越多關(guān)注［3-4］。相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)康復(fù)訓(xùn)練改善腦缺血大鼠神經(jīng)功能的作用與激活環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine mono-phosphat，cAMP）/蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）-磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（phosphorylated cAMP-response element binding protein，pCREB）信號(hào)通路 有關(guān)［5］。為深入認(rèn)識(shí)早期康復(fù)訓(xùn)練改善缺血性腦卒中患者神經(jīng)功能的分子生物學(xué)機(jī)制，本研究對(duì)cAMP/PKA-pCREB 信號(hào)通路在早期康復(fù)訓(xùn)練改善腦卒中患者神經(jīng)功能中的作用展開分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019 年1 月到2022 年5 月期間江蘇南通第三人民醫(yī)院收治的缺血性腦卒中患者作為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合缺血性腦卒中的診斷［6］；②發(fā)病后48 h 內(nèi)入院；③接受常規(guī)保守治療，抗凝、調(diào)脂、改善循環(huán)等；④住院期間進(jìn)行康復(fù)訓(xùn)練。排除標(biāo)準(zhǔn)：①生命體征不穩(wěn)定、合并意識(shí)障礙或其他無法配合康復(fù)訓(xùn)練的原因；②有腦卒中、腦外傷、腦腫瘤、脊髓損傷等病史；③合并惡性腫瘤、自身免疫性疾病。共納入84 例患者，根據(jù)住院期間康復(fù)訓(xùn)練的開始時(shí)間不同分為觀察組（n=36）和對(duì)照組（n=48）。觀察組中男性22 例、女性14 例，年齡（53.38±6.32）歲，起病時(shí)間（29.32±5.23）h；對(duì)照組中男性28 例、女性20 例，年齡（51.94±5.88）歲，起病時(shí)間（28.85±4.85）h。兩組間一般資料的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 干預(yù)方法

觀察組患者進(jìn)行早期康復(fù)訓(xùn)練，康復(fù)訓(xùn)練的開始時(shí)間為抗凝、調(diào)脂、改善循環(huán)等缺血性腦卒中常規(guī)治療24 h 內(nèi)且監(jiān)測(cè)生命體征穩(wěn)定、無生命危險(xiǎn)。對(duì)照組進(jìn)行常規(guī)康復(fù)訓(xùn)練，康復(fù)訓(xùn)練的開始時(shí)間為缺血性腦卒中常規(guī)治療3～5 d 且病情穩(wěn)定時(shí)。訓(xùn)練內(nèi)容如下：①關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)：在床上進(jìn)行關(guān)節(jié)被動(dòng)運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)順序由大關(guān)節(jié)到小關(guān)節(jié)、由健側(cè)到患側(cè)，運(yùn)動(dòng)幅度由小到大，每天2 次、每次15 min；②翻身訓(xùn)練和按摩：每2 h 進(jìn)行1 次翻身，翻身后擺放肢體在功能位；對(duì)患者上下肢進(jìn)行有節(jié)奏的按摩；③系統(tǒng)功能訓(xùn)練：待患者神經(jīng)功能逐步恢復(fù)后，先在床邊進(jìn)行肢體和軀干的運(yùn)動(dòng)功能訓(xùn)練，然后進(jìn)行上下樓及步行訓(xùn)練、協(xié)調(diào)和平衡訓(xùn)練、日常生活動(dòng)作訓(xùn)練等。本研究經(jīng)江蘇南通第三人民醫(yī)院臨床倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，取得患者知情同意。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 干預(yù)前后的神經(jīng)功能評(píng)分

干預(yù)前后均參照指南［6］對(duì)兩組的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，所用工具包括簡(jiǎn)易智能精神狀態(tài)檢查量表（Mini mental state examination，MMSE）、蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表（Montreal cognitive assessment，MoCA）、Fugl-Meyer 運(yùn)動(dòng)功能量表（Fugl -Meyer assessment，F(xiàn)MA）、Berg 平衡量表（Berg balance scale，BBS）。

1.3.2 干預(yù)前后的血清標(biāo)志物

干預(yù)前后均在生化采血管內(nèi)采集空腹外周靜脈血3～5 mL，靜置凝血后按照半徑10 cm、速度3 000 r/m 離心10 min，分離血清并采用酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒（上海西唐生物科技公司）進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)包括cAMP、PKA、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化力（TAOC）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3）。

1.3.3 干預(yù)前后的外周血pCREB 表達(dá)水平

干預(yù)前后均在血常規(guī)采血管內(nèi)采集空腹外周靜脈血3～5 mL，采用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液、提取細(xì)胞蛋白，采用Western blot 法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中pCREB的表達(dá)水平，pCREB 一抗為美國(guó)Abcam 公司、稀釋比例為1∶800，以β-actin 為內(nèi)參、計(jì)算pCREB 的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布、計(jì)量資料以（）描述，并進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組干預(yù)前后神經(jīng)功能評(píng)分的比較

干預(yù)后，兩組MMSE、MoCA、FMA、BBS 評(píng)分均高于組內(nèi)干預(yù)前（P＜0.05），且觀察組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組干預(yù)前后認(rèn)知功能及運(yùn)動(dòng)功能相關(guān)評(píng)分的比較（）Table 1 Comparison of cognitive function and motor function related scores between the two groups before and after intervention（）

表1 兩組干預(yù)前后認(rèn)知功能及運(yùn)動(dòng)功能相關(guān)評(píng)分的比較（）Table 1 Comparison of cognitive function and motor function related scores between the two groups before and after intervention（）

注：組內(nèi)干預(yù)后與干預(yù)前比較，aP＜0.05。

2.2 兩組治療前后血清cAMP、PKA 及外周血pCREB 的比較

干預(yù)后，兩組血清cAMP、PKA 含量及外周血pCREB 表達(dá)水平均高于組內(nèi)干預(yù)前，且觀察組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2、圖1。

圖1 兩組治療前后外周血pCREB 的蛋白條帶Figure 1 Protein bands of pCREB in peripheral blood of patients before and after treatment in both groups

表2 兩組治療前后血清cAMP、PKA 及外周血pCREB 的比較（）Table 2 Comparison of serum cAMP，PKA and peripheral blood pCREB before and after treatment between the two groups（）

表2 兩組治療前后血清cAMP、PKA 及外周血pCREB 的比較（）Table 2 Comparison of serum cAMP，PKA and peripheral blood pCREB before and after treatment between the two groups（）

注：組內(nèi)干預(yù)后與干預(yù)前比較，aP＜0.05。

2.3 兩組治療前后血清炎癥因子的比較

干預(yù)后，兩組血清TNF-α、IL-1β、IL-6 含量均低于組內(nèi)干預(yù)前，且觀察組低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組治療前后血清TNF-α、IL-1β、IL-6 的比較（）Table 3 Comparison of serum TNF-α，IL-1β and IL-6 before and after treatment between the two groups（）

表3 兩組治療前后血清TNF-α、IL-1β、IL-6 的比較（）Table 3 Comparison of serum TNF-α，IL-1β and IL-6 before and after treatment between the two groups（）

注：組內(nèi)干預(yù)后與干預(yù)前比較，aP＜0.05。

2.4 兩組治療前后血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較

干預(yù)后，兩組血清MDA 含量均低于干預(yù)前且觀察組低于對(duì)照組，SOD、TAOC 含量均高于干預(yù)前且觀察組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 兩組治療前后血清MDA、SOD、TAOC 的比較（）Table 4 Comparison of serum MDA，SOD and TAOC before and after treatment between the two groups（）

表4 兩組治療前后血清MDA、SOD、TAOC 的比較（）Table 4 Comparison of serum MDA，SOD and TAOC before and after treatment between the two groups（）

注：組內(nèi)干預(yù)后與干預(yù)前比較，aP＜0.05。

2.5 兩組治療前后血清凋亡指標(biāo)的比較

干預(yù)后，兩組血清Bax、Caspase-3 含量均低于干預(yù)前且觀察組低于對(duì)照組，Bcl-2 含量均高于干預(yù)前且觀察組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表5 兩組治療前后血清Bax、Bcl-2、Caspase-3 的比較（）Table 5 Comparison of serum Bax，Bcl-2 and Caspase-3 before and after treatment between the two groups（）

表5 兩組治療前后血清Bax、Bcl-2、Caspase-3 的比較（）Table 5 Comparison of serum Bax，Bcl-2 and Caspase-3 before and after treatment between the two groups（）

注：組內(nèi)干預(yù)后與干預(yù)前比較，aP＜0.05。

3 討論

缺血性腦卒中會(huì)引起神經(jīng)功能損害，除了通過溶栓、介入、抗凝、改善循環(huán)等治療手段改善缺血腦組織血流灌注以改善神經(jīng)功能外，發(fā)病后及時(shí)進(jìn)行康復(fù)訓(xùn)練也對(duì)改善神經(jīng)功能具有重要意義［7-8］。

相關(guān)的臨床研究認(rèn)為康復(fù)訓(xùn)練的開始時(shí)間是影響缺血性腦卒中患者康復(fù)效果的重要因素，早期康復(fù)訓(xùn)練是神經(jīng)功能改善的保護(hù)因素［9］。根據(jù)國(guó)內(nèi)外學(xué)者的臨床研究，早期康復(fù)訓(xùn)練的開始時(shí)機(jī)是缺血性腦卒中患者入院治療24 h 內(nèi)且病情穩(wěn)定、無生命危險(xiǎn)，早期進(jìn)行康復(fù)訓(xùn)練的神經(jīng)功能優(yōu)于常規(guī)康復(fù)訓(xùn)練［10］。本研究收集了接受早期康復(fù)訓(xùn)練和常規(guī)康復(fù)訓(xùn)練的缺血性腦卒中患者，進(jìn)行不同康復(fù)訓(xùn)練干預(yù)后從認(rèn)知功能和運(yùn)動(dòng)功能兩方面評(píng)價(jià)神經(jīng)功能，與接受常規(guī)康復(fù)訓(xùn)練的患者比較，早期康復(fù)訓(xùn)練后的各項(xiàng)神經(jīng)功能評(píng)分均明顯增加，提示早期康復(fù)訓(xùn)練改善缺血性腦卒中患者的神經(jīng)功能，與既往其他研究的結(jié)果一致。

缺血性腦卒中發(fā)病過程中神經(jīng)功能的損害涉及復(fù)雜的分子生物學(xué)機(jī)制，缺血缺氧是導(dǎo)致神經(jīng)功能損害的直接因素，與之相關(guān)的信號(hào)通路眾多，所涉及的分子生物學(xué)因素包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等［11］。一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示：康復(fù)訓(xùn)練促進(jìn)腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的作用與激活cAMP/PKA-pCREB 信號(hào)通路有關(guān)。cAMP 是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，激活PKA后使下游CREB 磷酸化為pCREB；pCREB 具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性，通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方式在多種疾病模型中起到保護(hù)作用。在缺血性腦卒中、腦外傷、帕金森病等疾病中，cAMP、PKA、pCREB 均明顯降低，激活cAMP/PKA-pCREB 通路起到神經(jīng)保護(hù)作用［12］。本研究對(duì)該信號(hào)通路的檢測(cè)結(jié)果顯示：與接受常規(guī)康復(fù)訓(xùn)練的患者比較，早期康復(fù)訓(xùn)練后的血清cAMP、PKA 含量及外周血pCREB 表達(dá)水平均明顯增加，提示缺血性腦卒中患者進(jìn)行早期康復(fù)訓(xùn)練能夠顯著激活cAMP/PKA-pCREB通路。

cAMP/PKA-pCREB 信號(hào)通路的生物學(xué)作用多樣，該通路在不同疾病模型中發(fā)揮保護(hù)作用與抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡有關(guān)［13］。在缺血性腦卒中的治療過程中，抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡有利于神經(jīng)元的存活和再生，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)［14］。本研究對(duì)cAMP/PKA-pCREB 信號(hào)通路下游的炎癥標(biāo)志物、氧化應(yīng)激標(biāo)志物、細(xì)胞凋亡標(biāo)志物展開分析，與接受常規(guī)康復(fù)訓(xùn)練的患者比較，早期康復(fù)訓(xùn)練后的血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA、促凋亡分子Bax、Caspase-3 的含量均降低，抗氧化物質(zhì)SOD、TAOC 及抗凋亡分子Bcl-2 的含量均增加，提示缺血性腦卒中患者進(jìn)行早期康復(fù)訓(xùn)練能夠抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡，這一作用與早期康復(fù)訓(xùn)練激活cAMP/PKA-pCREB 通路一致，同時(shí)以上作用可能是早期康復(fù)訓(xùn)練改善缺血性腦卒中患者神經(jīng)功能的相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制。

綜上所述，早期康復(fù)訓(xùn)練能夠改善腦卒中患者的神經(jīng)功能，這一改善作用與激活cAMP/PKApCREB 信號(hào)通路并抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡有關(guān)。