豨薟精醇結(jié)構(gòu)修飾及其抗凝血因子Xa活性研究

王建斌,趙文佳,陳 麗,薛 彤,董家輝

1揚州大學醫(yī)學院(轉(zhuǎn)化醫(yī)學院);2江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點實驗室,揚州 225009

豨薟草為菊科豨薟屬一年生草本植物?！吨腥A人民共和國藥典》2020年版收載菊科植物豨薟(SiegesbeckiaorientalisL.)、腺梗豨薟(SiegesbeckiapubescensMakino)和毛梗豨薟(SiegesbeckiaglabrescentMakino)3種植物的干燥地上部位作為中藥“豨薟草”入藥,具有祛風濕、利關節(jié)、解毒的功效,用于風濕痹痛,筋骨無力,腰膝酸軟,四肢麻痹,半身不遂,風疹濕瘡[1]?，F(xiàn)代藥理實驗表明豨薟草提取物具有抗炎、抗過敏、抗血栓、抗組胺釋放等活性,化學成分和藥理活性研究表明豨薟草中豐富的二萜類化合物是豨薟草發(fā)揮多種功效的物質(zhì)基礎[2-7],尤其是在抗炎鎮(zhèn)痛和活血化瘀方面。

豨薟精醇(darutigenol)是從植物豨薟草提取出來的二萜類化合物,現(xiàn)代藥理實驗表明:豨薟精醇能顯著抑制大鼠血小板最大聚集率和粘附率,延長優(yōu)球蛋白溶解時間及小鼠出血、凝血時間,對血瘀模型大鼠全血粘度、血漿粘度均有明顯的降低作用,改善異常的血液流變學,并可抑制血瘀模型大鼠TXB2合成,具有明顯的抗栓、溶栓、抗凝及改善血液流變學作用[8,9]。凝血因子Xa(FXa)位于內(nèi)源性和外源性凝血途徑的交匯處,處于凝血途徑的重要位置,是近年來抗凝血藥物研究的熱點之一。因此,本論文對課題組前期從豨薟草中分離得到的活性化合物豨薟精醇進行了結(jié)構(gòu)修飾研究,并探討其對凝血因子Xa的作用,從而發(fā)現(xiàn)活性更好的先導化合物分子。該研究將為新型小分子抗血栓藥物的發(fā)現(xiàn)及藥用植物豨薟草的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

核磁共振光譜儀(400 MHz,布魯克);質(zhì)譜儀(XEVO-G2QTOF#YCA166,沃特世);旋光儀(PL341/343型,珀金埃爾默);電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9053BS-III,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);超低溫冰箱(FORMA 700型,賽默飛世爾公司);全波長酶標儀(M200型,Tecan公司)。

Human FXa(Kordia公司,批號20161215);Xa因子發(fā)色底物S-2765(Boatman Biotech公司,批號CH043-6);牛血清白蛋白(BSA,國藥集團,批號20160821);三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris,Sigma公司,批號SLBC3621V);甲醇、乙腈、醋酸乙酯、氯仿、石油醚、丙酮、正丁醇(分析純,北京化工廠);柱色譜用硅膠(200～300目,安徽良臣硅源材料有限公司);薄層板(硅膠H,青島海洋化工廠)。合成實驗涉及到的原料和試劑主要有百靈威、耦合、國藥、安耐吉等試劑公司提供。豨薟精醇實驗室自制(腺梗豨薟中分離提取獲得,結(jié)構(gòu)經(jīng)質(zhì)譜和核磁確證為豨薟精醇,HPLC檢測質(zhì)量分數(shù) >95%)。

1.2 合成路線

采用了兩種方法在豨薟精醇的A環(huán)引入一個雜環(huán)[10-13],方法一:通過縮酮反應對15,16-鄰二醇進行保護,然后通過氯鉻酸吡啶(PCC)氧化,將3-OH氧化成酮,再與甲酸乙酯、三氟乙酸乙酯通過克萊森酯縮合反應生成1,3-二羰基衍生物,然后與羥胺(鹽酸羥胺)或者肼(水合肼或鹽酸苯肼)反應生成吡唑或噁唑環(huán)(見圖1)。方法二:在羰基α位引入-Br,再與硫脲反應形成噻唑環(huán)(見圖2)。

圖1 豨薟精醇衍生物的合成路線(方法一)Fig.1 Synthesis route of the derivatives of darutigenol (Method 1)注:反應條件:(a)丙酮、磷鉬酸,室溫,4 h;(b)二氯甲烷、氯鉻酸吡啶,0 ℃→室溫,6 h;(c)甲酸乙酯、甲醇鈉、四氫呋喃,室溫,過夜;(d)水合肼或鹽酸苯肼、乙醇,78 ℃,3 h;(e)鹽酸羥胺、吡啶,回流,4 h。Note:Reagents and conditions:(a) Acetone,phosphomolybdic acid,room temperate (rt),4 h;(b) CH2Cl2,PCC,0 ℃→rt,6 h;(c) HCOOC2H5,CH3ONa,THF,rt,overnight;(d) N2H4·H2O or phenylhydrazine hydrochloride,CH3CH2OH,78 ℃,3 h;(e) NH2OH·HCl,pyridine,reflux,4 h.

圖2 豨薟精醇衍生物的合成路線(方法二)Fig.2 Synthesis route of the derivatives of darutigenol (Method 2)注:反應條件:(a)三溴化吡啶、四氫呋喃,0 ℃,2 h;(b)硫脲、乙醇,加熱回流,5 h。Note:Reagents and conditions:(a) C5H5N·HBr·Br2,tetrahydrofuran (THF),0 ℃,2 h;(b) Thiourea,CH3CH2OH,reflux,5 h.

1.3 合成方法

1.3.1 化合物1的制備

稱取豨薟精醇2 g(6.21 mmol)置于250 mL干燥茄形瓶中,加入20 mL干燥丙酮和626 mg(0.34 mmol)磷鉬酸,室溫攪拌反應4 h。減壓蒸除反應液中丙酮,殘留物加乙酸乙酯30 mL溶解。分別用飽和NaHCO3溶液和水各洗三次,每次30 mL,再用無水Na2SO4干燥,抽濾除去Na2SO4,減壓蒸除溶劑,得化合物1(2.15 g,收率95.6%)。

1.3.2 化合物2的制備

稱取化合物12 g(5.56 mmol)置于250 mL干燥茄形瓶中,加入30 mL二氯甲烷攪拌溶解,反應瓶中加入10 g 60～100目硅膠,然后將反應裝置轉(zhuǎn)移至冰水浴中。取1.83g(8.34 mmol)氯鉻酸吡啶(PCC)溶于15 mL二氯甲烷,緩慢滴加至反應液中。然后室溫攪拌6 h。反應液過200～300目硅膠減壓柱,二氯甲烷洗脫,薄層鑒別合并洗脫液,濃縮,得產(chǎn)物粗品。將產(chǎn)物粗品進行柱層析,以石油醚∶乙酸乙酯(10∶1,V∶V)洗脫,得到化合物2(1.75 g,收率87.4%)。

1.3.3 化合物3的制備

稱取化合物2500 mg(1.39 mmol)和甲醇鈉600 mg(11.11 mmol)置50 mL茄形瓶中,加入20 mL干燥的四氫呋喃,攪拌0.5 h,緩慢滴加干燥的0.3 g(4.16 mmol)甲酸乙酯,室溫反應過夜;減壓蒸除反應液中溶劑,殘留物加乙酸乙酯30 mL溶解。分別用飽和食鹽水和水洗三次,每次30 mL,再用無水Na2SO4干燥,抽濾除去Na2SO4,減壓蒸除溶劑,得產(chǎn)物粗品,經(jīng)硅膠柱層析,以石油醚∶乙酸乙酯(10∶1,V∶V)洗脫,得到化合物3(439 mg,收率81.4%)。

1.3.4 化合物4的制備

稱取化合物3100 mg(0.26 mmol)和鹽酸羥胺56 mg(0.78 mmol),置25 mL的茄形瓶中,加入5 mL吡啶,回流4 h,減壓蒸除吡啶,殘留物加乙酸乙酯20 mL溶解。用飽和食鹽水洗三次,每次30 mL,再用無水Na2SO4干燥,抽濾除去Na2SO4,減壓蒸除溶劑,得產(chǎn)物粗品。經(jīng)硅膠柱層析,以石油醚∶乙酸乙酯(10∶1,V∶V)洗脫,得產(chǎn)物化合物4(54 mg,收率54.1%)。

1.3.5 化合物5的制備

稱取化合物3100 mg(0.26 mmol)和水合肼27 mg(0.52 mmol),置25 mL的茄形瓶中,加入5 mL乙醇溶解,回流反應3 h,減壓蒸除反應液,殘留物加乙酸乙酯20 mL溶解。用飽和食鹽水洗三次,每次30 mL,再用無水Na2SO4干燥,抽濾除去Na2SO4,減壓蒸除溶劑,得產(chǎn)物粗品。經(jīng)硅膠柱層析,以石油醚∶乙酸乙酯(10∶1,V∶V)洗脫,得化合物5(74 mg,收率74.1%)。

1.3.6 化合物6的制備

稱取化合物3100 mg(0.26 mmol)和鹽酸苯肼55 mg(0.52 mmol),置25 mL的茄形瓶中,加入5 mL乙醇溶解,回流反應3 h,減壓蒸除反應液,殘留物加乙酸乙酯20 mL溶解。用飽和食鹽水洗三次,每次20 mL,再用無水Na2SO4干燥,抽濾除去Na2SO4,減壓蒸除溶劑,得產(chǎn)物粗品。經(jīng)硅膠柱層析,以石油醚∶乙酸乙酯(15∶1, V∶V)洗脫,得化合物6(63 mg,收率52.7%)。

1.3.7 化合物7的制備

按照制備化合物3的制備方法,加入三氟甲基甲酸乙酯代替甲酸乙酯進行反應,得到化合物6(513 mg,收率80.9%)。

1.3.8 化合物8的制備

取50 mg(0.11 mmol)化合物7,按照化合物4的合成方法,得到化合物8(32 mg,收率62.0%)。

1.3.9 化合物9的制備

取50 mg(0.11 mmol)化合物7,按照化合物5的合成方法,得到化合物9(28 mg,收率51.5%)。

1.3.10 化合物10的制備

稱取化合物21.00 g(2.78 mmol),置100 mL干燥茄形瓶中,加入干燥四氫呋喃(THF)溶解,冰浴下加入1.12 g(3.33 mmol)的三溴化吡啶鎓,攪拌反應2 h,至TLC檢測無原料點存在,減壓蒸除反應液,殘留物加乙酸乙酯30 mL溶解。分別用飽和NaHCO3溶液和水各洗三次,每次30 mL,再用無水Na2SO4干燥,抽濾除去Na2SO4,減壓蒸除溶劑,得產(chǎn)物粗品,經(jīng)硅膠柱層析,以石油醚∶乙酸乙酯(5∶1,V∶V)洗脫,得化合物10(956 mg,收率78.5%)。

1.3.11 化合物11的制備

稱取化合物1050 mg(0.11 mmol),置100 mL干燥茄形瓶中,加入乙醇4 mL和硫脲12 mg(0.16 mmol),室溫攪拌溶解。加熱回流5 h。放冷反應液,加入飽和NaHCO3溶液堿化反應液,減壓濃縮反應液,除去反應體系中的乙醇,加入20 mL水分散,乙酸乙酯萃取三次,每次20 mL,合并乙酸乙酯層,減壓濃縮,得到產(chǎn)物粗品。經(jīng)硅膠柱層析,以石油醚∶乙酸乙酯(5∶1,V∶V)洗脫,得到化合物11(32 mg,收率67.4%)。

1.4 活性評價方法

采用顯色法對化合物的凝血因子FXa抑制活性進行評價。采用牛血清白蛋白緩沖液(0.05 mol/L Tris-0.1 M NaCl-0.1%BSA緩沖液,pH=7.4)。根據(jù)初篩結(jié)果將待測化合物濃度設置為1、10、100、1 000、10 000 nmol/L。在96孔板中,每孔加入10 μL上述已配好的不同濃度的藥液(空白組中加0.1% DMS0 10 μL),和25 μL的0.003 IU/ mL的FXa,以40 μL的BSA緩沖液(pH 7.4)混合均勻。37 ℃下孵育15 min。之后加入40 μL顯色底物S-2765,振蕩10 s后,于室溫下孵育1 h。酶標儀下測定各孔在405 nm的吸光度。通過SPSS19.0軟件分析數(shù)據(jù),得到IC50值。

1.5 分子對接

采用CADD預測化合物與凝血因子FXa的作用方式,來探討化合物的構(gòu)效關系。凝血因子FXa受體晶體結(jié)構(gòu)來源于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein Date Bank,ID:4Y76)[14]。使用Maestro.10.6軟件的Protein Preparation Wizard 模塊對蛋白進行鍵級及其他化學鍵的生成、電荷矯正、加氫、去水、能量最小化處理,然后根據(jù)PDB原配體定義口袋的大小及中心。利用ChemDraw 2014的Chem 3D 繪制小分子的三維立體結(jié)構(gòu),能量最小化處理,另存為MOL格式文件,導入Maestro.10.6軟件,使用LigPrep模塊處理,OPLS3立場對分子構(gòu)象進行優(yōu)化。以Glide默認的標準方法對接,以原始配體為中心,生成長度為1.5 nm的workspace ligand,選擇精度精度為XP(Extra precision)。分別對豨薟精醇、化合物9和11進行了分子對接。

2 結(jié)果

2.1 化合物理化和波譜數(shù)據(jù)

豨薟精醇及化合物1～11的結(jié)構(gòu)見圖3。

圖3 豨薟精醇及化合物1～11的結(jié)構(gòu)Fig.3 Structures of darutigenol and compounds 1-11

2.2 活性評價結(jié)果

通過SPSS19.0軟件計算分析得出化合物的IC50值,得到7個活性較好的化合物(IC50< 10 μmol/L),與豨薟精醇相比,多數(shù)衍生物對凝血因子FXa的抑制活性有一定的增強,其中化合物9和11最為顯著,IC50值分別為0.71±0.07和0.22±0.03 μmol/L,陽性對照為依度沙班(edoxaban),IC50值為0.003 4±0.000 4 μmol/L(見表1)。

表1 化合物對FXa的抑制作用Table 1 Anti-factor Xa activity results of compounds

2.3 分子對接結(jié)果

結(jié)果見圖4～6,豨薟精醇的16-OH與GLY 219形成氫鍵相互作用(見圖4);化合物9異惡唑環(huán)上質(zhì)子化的N原子與TRP 215和PHE 174形成π-陽離子相互作用(見圖5);化合物11噻唑環(huán)上的氨基與THR 98形成氫鍵相互作用,噻唑環(huán)上的質(zhì)子化的亞胺離子與TRP 215、PHE 174、TRY 99形成π-陽離子互相作用(見圖6)。

圖4 豨薟精醇與4Y76分子對接結(jié)果Fig.4 Docking model of darutigenol with 4Y76

圖5 化合物9與4Y76分子對接結(jié)果Fig.5 Docking model of compound 9 with 4Y76

圖6 化合物11與4Y76分子對接結(jié)果圖Fig.6 Docking model of compound 11 with 4Y76

3 討論與結(jié)論

從以依度沙班為代表的FXa抑制劑的臨床效果來看,其具有抗凝效果好、治療窗口寬且不易引起高凝反應癥狀,具有較高的安全性,已為當今抗凝血藥物研究的熱點[15,16]。天然產(chǎn)物在抗凝血方面有其獨特的優(yōu)勢,從臨床療效確切的傳統(tǒng)中藥發(fā)現(xiàn)活性成分并進行結(jié)構(gòu)修飾研究可能是發(fā)現(xiàn)新型抗凝血藥物的重要途徑[17]。豨薟精醇系從中藥豨薟草中分離得到的活性化合物,前期研究表明其具有顯著的抗凝血活性,因此,本研究對豨薟精醇進行了結(jié)構(gòu)修飾研究,并進行了FXa抑制活性篩選,旨在發(fā)現(xiàn)具有開發(fā)價值的新型FXa抑制劑。

根據(jù)豨薟精醇的結(jié)構(gòu)特點,在原有結(jié)構(gòu)上引入雜環(huán),旨在提高該類化合物的親水性和活性,因此,設計合成了在豨薟精醇的A環(huán)上引入五元雜環(huán)的幾個衍生物。通過對豨薟精醇及其衍生物進行體外FXa抑制試驗,得到7個活性較好的化合物(IC50<10 μmol/L),與豨薟精醇相比,多數(shù)衍生物對凝血因子FXa的抑制活性有一定的增強,其中化合物9和11最為顯著,IC50值分別為0.71±0.07和0.22±0.03 μmol/L。初步的構(gòu)效關系研究表明在原有結(jié)構(gòu)中的15,16-鄰二醇上引入亞甲叉基及在A環(huán)引入雜環(huán)可以提高化合物的活性,并且雜環(huán)取代基上的電子效應在提高活性方面具有重要的作用。通過計算機輔助藥物設計中的配體-蛋白互作模式分析來看,化合物9中的異噁唑環(huán)上的羥基及化合物11噻吩環(huán)上的氨基作為氫鍵供體與FXa形成氫鍵互作,進而增強化合物與受體的親和力,這可能是其活性較強的原因。此外,化合物11結(jié)構(gòu)中的硫雜環(huán)對化合物活性的提高可能有一定的貢獻[18],需要后續(xù)進行探討,以上將為豨薟精醇衍生物結(jié)構(gòu)的進一步優(yōu)化提供新思路。