白靈菇的化學(xué)成分及其抗宮頸癌細(xì)胞活性研究

賈月梅,馬國需,孫照翠,許旭東,石磊嶺,賈培松

1新疆維吾爾自治區(qū)市場監(jiān)督審核評價中心,烏魯木齊 830011;2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所,北京 100193;3新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所,烏魯木齊 830002;4新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,烏魯木齊 830091

白靈菇,中文學(xué)名白靈側(cè)耳(Pleurotustuoliensis),又名天山白靈芝、阿魏菇、阿魏蘑等,隸屬于擔(dān)子菌門蘑菇綱蘑菇目側(cè)耳科Pleurotaceae側(cè)耳屬Pleurotus,為高等真菌。野生寄生或腐生在中藥阿魏肥大的根莖部。白靈菇色如白絹,味道鮮美,在食用菌族中被稱為“食用菌皇后”[1]。有報道稱,白靈菇的營養(yǎng)成分十分全面,含多種氨基酸、脂肪、維生素和小分子[2]。目前,白靈菇大面積種植于新疆地區(qū),具較大的經(jīng)濟(jì)價值。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,白靈菇提取物具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、抗輻射等多種藥理作用[3-6]。相關(guān)的化學(xué)研究表明,白靈菇多糖是白靈菇的主要活性成分,并且研究較為廣泛[2,7-10]。為了進(jìn)一步研究白靈菇物質(zhì)基礎(chǔ),本文對其小分子化學(xué)成分進(jìn)行分離和鑒定,并檢測成分抗宮頸癌細(xì)胞活性,為進(jìn)一步開發(fā)白靈菇的價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Bruker Avance III 600型核磁共振波譜儀(德國Bruker公司);賽默飛世(Thermo Fisher)LTQ-ObitrapX液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Thermo Fisher公司);Lumtch-K-501半制備液相色譜儀(北京創(chuàng)新通恒有限公司);ZF-5型手提紫外分析儀(上海勤科分析儀器有限公司);柱色譜硅膠和薄層色譜用硅膠G、H、GF254(青島海洋化工有限公司);HW-40C凝膠(Toyopearl公司);反相硅膠Lichroprep Rp-18(40～63 μm)(日本Daiso有限公司);常規(guī)試劑均為分析純;娃哈哈水;人宮頸癌細(xì)胞Hela(中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所)。

白靈菇購自烏魯木齊縣板房溝鎮(zhèn)阿魏菇種植基地,經(jīng)新疆中藥民族藥研究所王果平研究員鑒定為側(cè)耳科側(cè)耳屬白靈側(cè)耳Pleurotustuoliensis(C.J.Mou) M.R.Zhao &Jin X.Zhang的子實(shí)體。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取與分離

取新鮮白靈菇子實(shí)體清洗干凈切片,陰干粉碎,過40目篩,包裝保存。稱取白靈菇粉1 000 g,加入3 L體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液,混勻后50 ℃超聲提取40 min,75 ℃水浴25 min,過濾收集上清液,提取3次,合并濾液,減壓濃縮無醇味后,用水分散。依次用二氯甲烷、乙酸乙酯等體積萃取3次,將二氯甲烷、乙酸乙酯萃取液減壓濃縮至干。最終得到二氯甲烷部位85 g,乙酸乙酯58 g。取乙酸乙酯部位(58 g)經(jīng)硅膠(100～200目)柱色譜,以石油醚-乙酸乙酯流動相系統(tǒng)(1∶0、10∶1、1∶1、1∶10、0∶1,V/V)梯度洗脫得5個流分Fr.1～Fr.5。Fr.1(3.2 g)經(jīng)HW-40C凝膠柱色譜分離,得到6個組分Fr.1-1～Fr.1-6。Fr.1-3(1.1 g)經(jīng)半制備液相色譜(YMC-Pack ODS-A,250 mm×10 mm,5 μm)分離,70%甲醇分離純化得化合物1(2.3 mg,tR=17min)、2(3.0 mg,tR=30 min)、3(1.8 mg,tR=34 min)。Fr.2(4.1 g)用反相硅膠Lichroprep Rp-18(40～63 μm)柱色譜分離,甲醇-水(20%→100%甲醇)梯度洗脫得到5個組分Fr.2-1～Fr.2-5。Fr.2-5(0.33 g)經(jīng)半制備液相色譜(YMC-Pack ODS-A,250 mm×10 mm,5 μm)分離,70%甲醇分離純化得化合物6(3.1 mg,tR=20 min)。Fr.2-2(2.7 g)再經(jīng)反相材料柱色譜分離,甲醇-水(50%→100%甲醇)梯度洗脫得到5個組分Fr.2-2-1～Fr.2-2-5。Fr.2-2-4(1.4 g)經(jīng)半制備液相色譜(YMC-Pack ODS-A,250 mm×10 mm,5 μm)分離,68%甲醇分離純化得化合物4(2.7 mg,tR=18 min)、5(4.2 mg,tR=27 min)。Fr.2-2-3(0.7 g)經(jīng)HW-40C凝膠柱色譜分離,得到5個組分Fr.2-2-3-1～Fr.2-2-3-5。Fr.2-2-3-3(0.3 g)經(jīng)半制備液相色譜(YMC-Pack ODS-A,250 mm×10 mm,5 μm)分離,70%甲醇分離純化得化合物7(2.8 mg,tR=22 min)。Fr.3(6.0 g)進(jìn)行硅膠柱色譜分離,二氯甲烷-甲醇(1∶0→0∶1)梯度洗脫得5個組分Fr.3-1～3-5。Fr.3-2(3.1 g)再經(jīng)HW-40C凝膠柱色譜分離,得到7個組分Fr.3-2-1～Fr.3-2-7。Fr.3-2-3(2.4 g)經(jīng)半制備液相色譜(YMC-Pack ODS-A,250 mm×10 mm,5 μm)分離,60%甲醇分離純化得化合物8(1.8 mg,tR=15 min)、9(1.5 mg,tR=20 min)、10(2.4 mg,tR=28 min)。Fr.3-4(1.9 g)經(jīng)半制備液相色譜(YMC-Pack ODS-A,250 mm×10 mm,5 μm)分離,60%甲醇分離純化得化合物11(3.2 mg,tR=22 min)。

1.2.2 體外抗腫瘤活性篩選

采用MTT比色法,對化合物1～11進(jìn)行抗腫瘤活性篩選:選取人宮頸癌細(xì)胞Hela,DMEM培養(yǎng)基稀釋后,以每孔6×104個/mL的密度接種于96孔板,每孔100 μL,培養(yǎng)24 h后,將五種不同濃度的溶于二甲基亞砜(DMSO)的每種化合物添加到每個孔中,以順鉑作為陽性藥。共設(shè)5個濃度(50、25、12.5、6.25、3.125 (mol/L),每個濃度3個復(fù)孔。在37 ℃,5% CO2中孵育48 h后,向每個孔中添加10 mL MTT(4 mg/mL)染色,繼續(xù)孵育4 h,吸棄原培養(yǎng)液,每孔加入200 μL DMSO,置搖床上低速振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解,并于酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm波長處檢測光密度值,重復(fù)三次。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1淡黃色膠質(zhì);ESI-MS:m/z203.08 [M+Na]+,分子式為C10H12O3。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.33(1H,d,J=7.2 Hz,H-3),6.68(1H,d,J=7.2 Hz,H-4),6.16(1H,q,J=7.2 Hz,H-3′),4.49(2H,s,H-5′),2.64(1H,s,5′-OH),1.88(3H,s,H-1′),1.85(3H,d,J=7.2 Hz,H-4′);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:161.0(C-2),100.1(C-3),140.0(C-4),124.9(C-5),162.5(C-6),11.7(C-1′),129.9(C-3′),14.3(C-4′),61.2(C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報道基本一致,故確定該化合物為鐮刀吡酮A。

化合物2橙色固體;ESI-MS:m/z333.09 [M+Na]+,分子式為C15H18O7。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:12.00(1H,s,9-OH),6.49(1H,s,H-8),6.49(1H,s,6-OH),5.58(1H,s,5-OH),5.35(1H,d,J=4.2 Hz,H-5),4.01(1H,dd,J=9.5,11.8 Hz,H-1a),3.96(3H,s,H-12),3.82(1H,dd,J=8.7,11.2 Hz,H-1b),3.02(1H,m,H-4a),2.96(1H,dd,J=11.4,4.2 Hz,H-10a),1.56(3H,s,H-11);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:56.4(C-1),100.1(C-3),38.8(C-4),62.7(C-5),137.6(C-6),154.3(C-7),106.2(C-8),158.6(C-9),203.1(C-10),23.8(C-11),56.4(C-12),40.0(C-4a),120.9(C-5a),107.1(C-9a),44.9(C-10a)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報道基本一致,故確定該化合物為5-羥基二氫鐮刀紅素C。

化合物3紅色粉末;ESI-MS:m/z343.07 [M+Na]+,分子式為C16H16O7。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:6.17(1H,s,H-7),4.90(1H,d,J=17.4 Hz,H-1a),4.57(1H,d,J=17.4 Hz,H-1b),3.94(3H,s,H-13),3.32(3H,s,H-12),3.02(1H,d,J=20.16 Hz,H-3a),2.68(1H,d,J=20.16 Hz,H-3b),1.56(3H,s,H-11);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:58.6(C-1),119.1(C-3),32.8(C-4),157.1(C-5),185.1(C-6),109.7(C-7),160.6(C-8),178.2(C-9),137.1(C-10),22.8(C-11),48.9(C-12),56.7(C-13),132.5(C-4a),109.7(C-5a),107.5(C-9a),136.9(C-10a)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致,故確定該化合物為3-甲基醚鐮刀紅素。

化合物4紅色粉末;ESI-MS:m/z313.06 [M+Na]+,分子式為C15H14O6。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:13.26(1H,s,8-OH),12.84(1H,s,5-OH),6.21(1H,s,H-6),3.94(3H,s,7-OCH3),3.91(2H,s,H-9),2.30(3H,s,3-CH3),2.24(3H,s,H-11);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:160.5(C-1),134.0(C-2),142.4(C-3),160.0(C-4),177.9(C-5),109.6(C-6),161.1(C-7),184.5(C-8),41.1(C-9),203.8(C-10),30.0(C-11),108.3(C-4a),109.6(C-8a),56.7(7-OCH3),12.8(3-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報道基本一致,故確定該化合物為2-acetonyl-3-methyl-7-methoxynaphthazarin。

化合物5無色油狀;ESI-MS:m/z263.19 [M+Na]+,分子式為C15H28O2。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:5.13(1H,t,J=7.8 Hz,H-9),2.06(2H,m,H-8),1.86(2H,m,H-4),1.70(3H,s,H-12),1.63(3H,s,H-11),1.58(1H,m,H-1),1.58(1H,m,H-5),1.49(2H,t,J=8.4 Hz,H-7),1.26(3H,s,H-13),1.17(3H,s,H-15),1.11(2H,m,H-3),1.05(3H,d,J=7.2 Hz,H-14);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:44.1(C-1),81.1(C-2),40.3(C-3),24.2(C-4),54.2(C-5),74.8(C-6),40.4(C-7),22.7(C-8),124.4(C-9),131.7(C-10),17.5(C-11),25.1(C-12),25.6(C-13),14.4(C-14)26.0(C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報道基本一致,故確定該化合物為(-)-cyclonerodiol。

化合物6紅色粉末;ESI-MS:m/z315.08 [M+Na]+,分子式為C15H16O6。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:13.34(1H,s,8-OH),13.07(1H,s,5-OH),6.21(1H,s,H-6),4.14(1H,m,H-10),3.94(3H,s,7-OCH3),2.96(2H,m,H-9),2.36(3H,s,3-CH3),1.35(3H,d,J=6.6 Hz,H-11);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:160.5(C-1),138.3(C-2),142.0(C-3),162.3(C-4),177.9(C-5),109.6(C-6),162.3(C-7),184.2(C-8),35.9(C-9),67.8(C-10),23.9(C-11),109.2(C-4a),107.9(C-8a),60.7(7-OCH3),12.9(3-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報道基本一致,故確定該化合物為2-isopropanol-3-methyl-7-methoxynaphthazarin。

化合物7無色油狀;ESI-MS:m/z221.08 [M+Na]+,分子式為C10H14O4。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:4.89(1H,d,J=8.4 Hz,H-3),3.23(1H,d,J=8.4 Hz,H-2),2.60(1H,m,H-5a),2.58(1H,m,H-5b),2.09(1H,dt,J=13.2,3.6 Hz,H-6a),1.82(3H,s,H-10),1.42(1H,dt,J=13.2,9.6 Hz,H-6b),1.33(3H,s,H-7);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:72.5(C-1),79.6(C-2),84.0(C-3),120.6(C-4),21.3(C-5),36.3(C-6),25.9(C-7),160.1(C-8),175.1(C-9),8.3(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報道基本一致,故確定該化合物為1,2-二羥基薄荷內(nèi)酯。

化合物8無色油狀;ESI-MS:m/z289.15 [M+Na]+,分子式為C15H22O4。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:4.40(1H,s,H-7),2.71(2H,d,J=7.2 Hz,H-9),2.55(1H,m,H-4a),2.31(1H,m,H-4b),2.27(1H,s,H-13),2.03(1H,m,H-5a),1.98(1H,m,H-10),1.74(1H,m,H-5b),1.31(3H,s,H-14),0.97(6H,d,J=6.6 Hz,H-11,12);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:149.1(C-2),128.7(C-3),17.4(C-4),32.4(C-5),71.6(C-6),69.0(C-7),191.6(C-8),47.5(C-9),24.6(C-10),22.6(C-11,12),9.7(C-13)24.1(C-14),122.7(C-3a),151.5(C-7a)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致,故確定該化合物為6,7-dihydroxy-3,6-dimethyl-2-isovaleroyl-4,5,6,7-tetrahydroben-zofuran。

化合物9無色油狀;ESI-MS:m/z223.10 [M+Na]+,分子式為C10H16O4。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:4.48(1H,dd,J=8.4,15.6 Hz,H-7a),3.39(1H,d,J=8.4 Hz,H-7),2.41(1H,m,H-3a),2.12(1H,m,H-3),1.68(1H,m,H-5a),1.62(1H,m,H-4a),1.53(1H,m,H-5b),1.40(1H,m,H-4b),1.31(3H,s,H-8),1.22(3H,d,J=6.4 Hz,H-9);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:179.5(C-2),36.3(C-3),18.9(C-4),31.5(C-5),72.0(C-6),82.8(C-7),26.4(C-8),13.5(C-9),42.7(C-3a),76.2(C-7a)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報道基本一致,故確定該化合物為二氫-3-外胸膜內(nèi)酯。

化合物10無色油狀;ESI-MS:m/z149.10 [M+Na]+,分子式為C6H6O3。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:9.53(1H,s,H-1),7.22(1H,d,J=3.5 Hz,H-3),6.53(1H,d,J=3.5 Hz,H-4),4.61(2H,s,H-6);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:177.7(C-1),152.3(C-2),126.4(C-3),109.7(C-4),160.6(C-5),57.6(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報道基本一致,故確定該化合物為5-羥甲基糠醛。

化合物11無色固體;ESI-MS:m/z289.34 [M+Na]+,分子式為C15H22O4。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:5.42(1H,m,6-OH),4.41(1H,m,7-OH),4.19(1H,s,H-7),2.65(1H,dd,J=7.2,1.2 Hz,H-9),2.44(1H,m,H-4a),2.41(1H,m,H-4b),2.20(3H,s,H-13),2.16(1H,m,H-10),1.86(1H,m,H-5a),1.58(1H,m,H-5b),1.12(3H,s,H-14),0.92(6H,d,J=6.6 Hz,H-11,12);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:147.8(C-2),128.8(C-3),16.9(C-4),32.8(C-5),71.2(C-6),68.8(C-7),190.3(C-8),47.4(C-9),24.8(C-10),22.7(C-11),22.7(C-12),9.8(C-13),24.4(C-14),122.3(C-3a),154.4(C-7a)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報道基本一致,故確定該化合物為6,7-dihydroxy-3,6-dimethyl-2-isovaleroyl-4,5,6,7-tetrahydrobenzofuran。

化合物1～11的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 化合物1～11的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1-11

2.2 抗腫瘤活性篩選

對白靈菇提取分離所得化合物進(jìn)行抗腫瘤活性篩選,結(jié)果(見表1)顯示除化合物5、9、10的活性較弱外,其他化合物均顯示出較強(qiáng)的抗腫瘤活性,其中化合物2～4的活性較為顯著,且化合物3的抗腫瘤活性最好,IC50為3.78 μmol/L(陽性對照藥為順鉑,IC50為0.94 μmol/L)。

表1 化合物1～11的體外抗Hela細(xì)胞活性Table 1 In vitro activity of compounds 1-11 against Hela cell

2.3 構(gòu)效關(guān)系分析

為了進(jìn)一步分析分離的化合物的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系,結(jié)果比較和分析了活性較為顯著的化合物2～4的抗腫瘤活性,通過分析發(fā)現(xiàn)化合物2和化合物3都具有6/6/6環(huán)系統(tǒng)結(jié)構(gòu),而未形成6/6/6環(huán)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的化合物4抗腫瘤活性相對較弱,由此推測可能形成6/6/6環(huán)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的化合物的抗腫瘤活性較強(qiáng);此外對于都具有6/6/6環(huán)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的化合物2和化合物3來說,化合物3的抗腫瘤活性明顯較強(qiáng),而化合物3與化合物2結(jié)構(gòu)中較為明顯的區(qū)別是在C-3位上所連接的基團(tuán)不同,于C-3位上連接甲氧基的化合物3活性高于在C-3位上連接羥基的化合物2,由此推測在C-3位上連接的甲氧基可能對化合物的抗腫瘤活性有提高的作用。根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系分析,化合物結(jié)構(gòu)中是否具有的6/6/6環(huán)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和在C-3位連接基團(tuán)的不同可能對化合物的抗腫瘤活性產(chǎn)生影響。本研究通過抗腫瘤活性研究為白靈菇中抗腫瘤活性化合物的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系提供了參考。其中化合物3對人宮頸癌細(xì)胞Hela的抗增殖作用較強(qiáng),但其具體的抑制宮頸癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本研究對白靈菇的化學(xué)成分進(jìn)行了探索,從中獲得了11個化合物,其中包括萜類6個(1、5、7、8、9、11),聚酮類4個(2、3、4、6),其他類化合物1個(10),得到的化合物均為首次在白靈菇中分離得到?？鼓[瘤活性篩選結(jié)果表明,化合物1～4、6～8、11均顯示出較強(qiáng)的抗腫瘤活性。進(jìn)一步分析分離的化合物的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系,可見化合物結(jié)構(gòu)中具有6/6/6環(huán)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、在C-3位連接基團(tuán)的不同都可能對抗腫瘤活性產(chǎn)生一定的影響。目前,國內(nèi)外對白靈菇中存在的小分子化合物報道不多,該研究屬于首次開展白靈菇的化學(xué)成分研究,該結(jié)果進(jìn)一步豐富了白靈菇中化學(xué)成分,也為后續(xù)深入闡明白靈菇的活性物質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。所發(fā)現(xiàn)的具有顯著抗腫瘤活性的化合物,可在白靈菇中大量富集后,進(jìn)行修飾、改造等深入研究,從而進(jìn)一步拓展白靈菇的應(yīng)用范圍,促進(jìn)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)的發(fā)展。