新疆阿拉爾市流浪貓?jiān)打绶N類鑒定及其攜帶立克次體PCR 檢測(cè)

司俊飛，赫永強(qiáng)，張振杰，朱婷婷，2，張 旭，曹夢(mèng)雅，趙愛(ài)云，齊 萌

（1. 塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2. 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第九師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所（畜牧科學(xué)研究所），新疆額敏 834601）

蜱是常見(jiàn)的吸血傳播媒介，在世界范圍內(nèi)廣泛分布，可傳播細(xì)菌、病毒、原蟲(chóng)等多種病原[1]。蜱種類繁多，宿主譜廣，不同地區(qū)家貓和流浪貓感染蜱的種類存在地理分布差異。Horak 等[2]在南非調(diào)查發(fā)現(xiàn)，家貓?bào)w表可寄生13 種硬蜱和1 種軟蜱，以橢圓血蜱（Haemaphysaliselliptica）為優(yōu)勢(shì)寄生種類；Saleh 等[3]在美國(guó)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，貓?bào)w表蜱以美洲花蜱（Amblyommaamericanum）為優(yōu)勢(shì)寄生種類；Chao 等[4]在我國(guó)臺(tái)灣省1 只流浪貓?bào)w表采集了15 只蜱，經(jīng)鑒定均為卵形硬蜱（I.ovatus）。

立克次體主要包括斑疹傷寒立克次體（typhus groupRickettsias，TGR）和斑點(diǎn)熱群立克次體（spotted fever groupRickettsias，SFGR）。SFGR是專性寄生于細(xì)胞內(nèi)的革蘭氏陰性原核生物，主要通過(guò)蜱傳播至人和動(dòng)物，引起發(fā)熱、頭痛、皮疹、肌肉疼痛、局部淋巴結(jié)病變等臨床癥狀[5]。目前，已發(fā)現(xiàn)至少28 種SFGR，其宿主主要是蜱，并可經(jīng)蜱卵進(jìn)行垂直傳播[6]。在國(guó)外，貓常見(jiàn)感染SFGR。Sirirat 等[7]在泰國(guó)貓中檢測(cè)到SFGR，感染率為4.76%（2/42）；Izzard 等[8]在澳大利亞貓血清中檢測(cè)到SFGR，感染率為59.33%（89/150）。本調(diào)查利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定新疆阿拉爾市流浪貓?jiān)打绶N類，并對(duì)其攜帶的立克次體進(jìn)行PCR 檢測(cè)，以期為我國(guó)貓?jiān)醇纳缂膀鐐鞑⊙芯刻峁┗A(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 蜱采集與處理

2023 年4 月，于新疆阿拉爾市某居民小區(qū)內(nèi)，對(duì)4 只流浪貓進(jìn)行體表寄生蜱檢查，在1 只貓?bào)w表采集蜱3 只，分別編號(hào)為C1、C2 和C3，將其置于2 mL 離心管中保存。

1.2 主要試劑與儀器

組織DNA 提取試劑盒、2×EasyTaqPCR Super Mix（+dye）、DL 2 000 DNA Marker，均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；SMZ18 體視顯微鏡，購(gòu)自Nikon 公司；Sorvall Legend Micro 17 型微量離心機(jī)，購(gòu)自Thermo Fisher Scientific 公司；MC proS 型梯度PCR 儀，購(gòu)自Eppendorf 公司；DYY-7C 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀及JY 系列電泳槽，購(gòu)自北京六一生物科技有限公司；Gel Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自Bio-Rad 公司。

1.3 形態(tài)學(xué)觀察

參考陳澤等主編的《蜱的系統(tǒng)分類學(xué)》[9]和鄧國(guó)藩等主編的《中國(guó)經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)志》[10]第三十九冊(cè)，使用體式顯微鏡觀察蜱的假頭基、緣垛、氣門板、眼、足、肛溝、肛門、肛毛等部位，進(jìn)行種類鑒定。

1.4 蜱DNA 提取

將3 只經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后的蜱分別用滅菌雙蒸水反復(fù)沖洗3 次。使用手持式電動(dòng)組織研磨器進(jìn)行研磨，然后參考組織DNA 提取試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行基因組DNA 提取，將獲得的基因組DNA 置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 蜱線粒體SSU rRNA 基因和COX I 基因PCR擴(kuò)增

參照方晨等[11]的報(bào)道設(shè)計(jì)蜱線粒體SSU rRNA 和COXI基因引物，引物序列信息見(jiàn)表1，由蘇州金維智生物科技有限公司合成。

表1 鑒定蜱種類的引物序列及其目的條帶大小

反應(yīng)體系：模板DNA 1.0 μL，2×EasyTaqPCR Super Mix（+dye）12.5 μL， 上下游引物（20 μmol/L）各0.3 μL，ddH2O 10.9 μL，共計(jì)25.0 μL。COXI和SSU rRNA 基因擴(kuò)增條件均為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。每次PCR 擴(kuò)增以殘緣璃眼蜱DNA 為陽(yáng)性對(duì)照，滅菌雙蒸水為陰性對(duì)照。擴(kuò)增結(jié)束后，取5.0 μL PCR 產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠（10 g/L）中進(jìn)行電泳觀察。

1.6 立克次體OmpA、OmpB 基因PCR 擴(kuò)增

參照劉城成等[12]的報(bào)道設(shè)計(jì)檢測(cè)立克次體的OmpA和OmpB基因引物，引物序列信息見(jiàn)表2，由蘇州金維智生物科技有限公司合成。

表2 檢測(cè)立克次體的引物序列及其目的條帶

PCR 反應(yīng)體系同1.5。OmpA基因擴(kuò)增條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。OmpB基因擴(kuò)增條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。每次PCR 擴(kuò)增以圖蘭扇頭蜱（Rhipicephalusturanicus）拉氏立克次體（Rickettsiaraoultii）DNA 為陽(yáng)性對(duì)照，滅菌雙蒸水為陰性對(duì)照。擴(kuò)增結(jié)束后，取5.0 μL PCR 產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠（10 g/L）中進(jìn)行電泳觀察。

1.7 序列比對(duì)及種系進(jìn)化分析

基于蜱線粒體SSU rRNA 和COXI基因，將蜱PCR 擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物送至蘇州金維智生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序和序列拼接，在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 搜索，應(yīng)用MEGA 7.0 軟件對(duì)所獲序列進(jìn)行比對(duì)分析，鑒定蜱的種類?；诹⒖舜误wOmpA和OmpB基因，將陽(yáng)性產(chǎn)物送至蘇州金維智生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序和序列拼接，應(yīng)用MEGA 7.0 軟件比對(duì)分析本調(diào)查所獲得的立克次體序列，鑒定其種類；在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中分別下載不同宿主來(lái)源的SFGR 序列，使用MEGA 7.0 軟件，選擇鄰接法（neighhor-joining，NJ 法）構(gòu)建種系發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。根據(jù)種系發(fā)育樹(shù)分支，分析不同SFGR的遺傳進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 蜱形態(tài)學(xué)鑒定

經(jīng)肉眼觀察，3 只蜱體色單一，均為雌蜱。使用體式顯微鏡對(duì)蜱觀察：假頭基寬短呈六角形，側(cè)角明顯；具眼呈卵圓形，略微凸起，盾板褐色且長(zhǎng)大于寬，后緣淺弧型凸出；體呈卵圓形，第I 基節(jié)短，背、腹面可見(jiàn)，4 對(duì)足，細(xì)長(zhǎng)均一，附節(jié)末端有小齒突，后緣圓潤(rùn)；氣門板呈短逗點(diǎn)型，長(zhǎng)大于寬（圖1）。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察，初步鑒定3 只蜱均為圖蘭扇頭蜱。

圖1 蜱形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

2.2 蜱DNA 樣本PCR 擴(kuò)增和種類鑒定

基于蜱線粒體SSU rRNA 和COXI基因?qū)μ崛〉尿鏒NA 樣本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果分別成功擴(kuò)增出大小約460 和850 bp 的目的片段（圖2～3），均與預(yù)期目的片段大小一致。

圖2 蜱線粒體SSU rRNA 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖3 蜱線粒體COX I 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)于SSU rRNA 基因序列，在3 條蜱序列中，有2 條與新疆策勒縣綿羊體表寄生的圖蘭扇頭蜱序列（GenBank 序列登錄號(hào)KY583074）同源性為100%；剩余1 條與該參考序列的同源性為99.73%，其第340 核苷酸位置處存在1 個(gè)堿基替換（A →G）。經(jīng)序列比對(duì)，鑒定3 只蜱均為圖蘭扇頭蜱。

對(duì)于COXI基因序列，在3 條蜱序列中，有2 條與新疆阿拉山口市綿羊體表寄生的圖蘭扇頭蜱序列（GenBank 序列登錄號(hào)KU364303）同源性為100%；剩余1 條與該參考序列的同源性為99.87%，其第508 核苷酸位置處存在1 個(gè)堿基替換（A →G）。經(jīng)序列比對(duì)，鑒定3 只蜱均為圖蘭扇頭蜱。

2.3 蜱DNA 樣本中立克次體PCR 檢測(cè)

基于OmpA和OmpB基因?qū)α⒖舜误w進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果分別擴(kuò)增到520 bp（圖4）和618 bp（圖5）的目的片段，與預(yù)期目的片段大小一致。

圖4 立克次體OmpA 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖5 立克次體OmpB 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.4 立克次體序列遺傳進(jìn)化分析

在OmpA基因位點(diǎn)，獲得2 條序列，二者與新疆石河子市圖蘭扇頭蜱體內(nèi)檢測(cè)到的暫定巴布瑞立克次體（CandidatusR.barbariae）序列（Genbank序列登錄號(hào)MF002506）同源性均為100%，將其命名為OS1；在OmpB基因位點(diǎn)，獲得2 條序列，二者與黎巴嫩具環(huán)扇頭蜱（Rhipicephalus annulatus）體內(nèi)檢測(cè)到的暫定巴布瑞立克次體序列（GenBank 序列登錄號(hào)KY233293）同源性均為100%，將其命名為OB1。因此，本研究獲得的2個(gè)立克次體樣本均被鑒定為暫定巴布瑞立克次體。

基于立克次體OmpA基因序列構(gòu)建的種系發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖6）顯示：所獲OS1 序列與我國(guó)、黎巴嫩、印度的蜱源暫定巴布瑞立克次體聚成一支，與其他蜱源非洲立克次體（R.africae）、西伯利亞立克次體（R.sibirica）、康氏立克次體（R.conorii）、立氏立克次體（R.rickettsii）聚類形成一個(gè)大群，而與拉氏立克次體、馬賽立克次體（R.massiliae）形成不同群組。

圖6 基于立克次體OmpA 序列構(gòu)建的種系發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

基于立克次體OmpB基因序列構(gòu)建的種系發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖7）顯示：所獲OB1 序列與我國(guó)、黎巴嫩、葡萄牙、斯威士蘭的蜱源暫定巴布瑞立克次體聚成一支，與其他蜱源拉氏立克次體和馬賽立克次體聚類形成一個(gè)大群，而與非洲立克次體、西伯利亞立克次體、拉氏立克次體、康氏立克次體形成不同群組。

圖7 基于立克次體OmpB 序列構(gòu)建的種系發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

3 討論

蜱的種類分布與地理環(huán)境密切相關(guān)。在意大利，Pennisi1 等[13]在308 只貓?bào)w表進(jìn)行檢查，發(fā)現(xiàn)37 只貓?bào)w表有蜱寄生，每只貓寄生蜱1～22 只，共采集到132 只蜱，鑒定出2 屬5 種蜱，以?shī)^氏硬蜱（I.ventalloi）為優(yōu)勢(shì)蜱種（46.97%，62/132）。在美國(guó)，Saleh 等[3]對(duì)體表寄生蜱的336 只貓進(jìn)行檢查，發(fā)現(xiàn)每只貓寄生蜱1～38 只，共采集891 只蜱，鑒定出5 屬12 種硬蜱，以美洲花蜱為優(yōu)勢(shì)寄生種類（343/891，38.50%）。在新疆南疆開(kāi)展的調(diào)查顯示，扇頭蜱是新疆南疆羊和犬寄生的優(yōu)勢(shì)蜱種類。郗宇等[14]在新疆南疆阿瓦提縣以及阿拉爾附近團(tuán)場(chǎng)的綿羊和狗體表共采集蜱1 340 只，其中圖蘭扇頭蜱1 331 只，占總數(shù)的99.32%；劉永宏等[15]在新疆阿圖什市羊體表共采集到232 只蜱，其中扇頭蜱屬占42.24%；李正等[16]在新疆和田地區(qū)羊養(yǎng)殖場(chǎng)的綿羊體表共采集到914 只蜱，其中圖蘭扇頭蜱532只，占總數(shù)的58.46%。本次調(diào)查在阿拉爾市貓?bào)w表采集到的3 只蜱均為圖蘭扇頭蜱，說(shuō)明圖蘭扇頭蜱是南疆地區(qū)流行的優(yōu)勢(shì)蜱種。

蜱在立克次體感染脊椎動(dòng)物的過(guò)程中起到了重要作用。在已建立的立克次體分子檢測(cè)方法中，OmpA和OmpB基因是診斷立克次體的常用位點(diǎn)，其中OmpA對(duì)SFGR 基因型或亞型的鑒定具有重要意義[17]。郗宇等[14]基于立克次體OmpA基因位點(diǎn)，對(duì)新疆南疆9 個(gè)地區(qū)羊源蜱進(jìn)行立克次體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了4 種立克次體，其中有3 種（馬賽立克次體、康氏立克次體、暫定巴布瑞立克次體）來(lái)自圖蘭扇頭蜱，其中暫定巴瑞立克次體的感染率較高，為91.23%（49/53）。李飛等[18]在新疆南疆31 個(gè)地區(qū)共采集1 144 只羊源圖蘭扇頭蜱，從中挑取93只進(jìn)行立克次體OmpA和OmpB基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率為16.13%（15/93），且均為暫定巴布瑞立克次體。本次調(diào)查在貓?bào)w表采集3 只圖蘭扇頭蜱，其中2 只攜帶暫定巴瑞立克次體，結(jié)果與上述調(diào)查研究一致。本調(diào)查結(jié)果提示，新疆南疆地區(qū)不同宿主源蜱攜帶的立克次體優(yōu)勢(shì)種是暫定巴瑞立克次體。

綜上，新疆阿拉爾市貓?bào)w表存在圖蘭扇頭蜱寄生，可攜帶暫定巴布瑞立克次體。本研究結(jié)果為我國(guó)貓?jiān)醇纳缂膀鐐鞑〉难芯刻峁┝嘶A(chǔ)資料。