我國斑點熱立克次體感染與免疫的實驗研究

熊小路，焦 俊，溫博海

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我國斑點熱立克次體感染與免疫的實驗研究

熊小路，焦 俊，溫博海

研究證明黑龍江立克次體能夠感染人血管內(nèi)皮細胞和BALB/c小鼠，引起小鼠菌血癥和器官損傷；全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)黑龍江立克次體毒力相關(guān)基因。表面蛋白質(zhì)組分析鑒定了黑龍江立克次體和立氏立克次體的表面蛋白，用表面蛋白免疫C3H/HeN小鼠，發(fā)現(xiàn)某些表面蛋白為保護性抗原，并揭示這些保護性抗原均能夠誘導抗原特異CD4+和CD8+T細胞增殖并產(chǎn)生和分泌IFN-γ和/或TNF-α，以及誘導高水平特異性IgG2a產(chǎn)生，在這些免疫因素的協(xié)同作用下使小鼠有效抵抗立克次體感染。用黑龍江立克次體感染Tim-3高表達或低表達人血管內(nèi)皮細胞以及Tim-3高表達轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)果有力證明Tim-3高表達能夠促進人血管內(nèi)皮細胞和小鼠抵抗黑龍江立克次體感染。

斑點熱立克次體；感染；免疫；保護性抗原

斑點熱立克次體通過“拉鏈式 (zipper-like)”入侵機制侵入非專業(yè)吞噬細胞(如血管內(nèi)皮細胞)[1]。“拉鏈式”入侵是一種受體介導的入侵機制，立克次體表面配體蛋白與宿主細胞表面受體結(jié)合后誘導宿主細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導。這些細胞內(nèi)信號分子在立克次體與宿主細胞相互作用部位募集肌動蛋白并重構(gòu)宿主細胞骨架，最終在立克次體周圍形成膜“拉鏈”。基于斑點熱立克次體“拉鏈式”入侵宿主細胞機制和專性胞內(nèi)寄生方式；斑點熱立克次體表面蛋白可以在立克次體的感染與免疫中發(fā)揮重要作用，比如介導立克次體粘附和入侵宿主細胞、促進立克次體在細胞內(nèi)生長繁殖以及誘導機體的免疫應(yīng)答等[1]。近幾年來，我國學者對在我國黑龍江立克次體和立克次體中毒力最強的立氏立克次體在感染與免疫方面開展了系列實驗研究。

1 黑龍江立克次體的致病性

黑龍江立克次體是1982年由我國學者婁丹等分離的斑點熱立克次體新種[2]。研究人員用黑龍江立克次體感染人血管內(nèi)皮細胞和小鼠，發(fā)現(xiàn)它與其它斑點熱立克次體相似的致病特征。同時測定黑龍江立克次體全基因組序列，通過全基因組序列的比較分析，發(fā)現(xiàn)它的毒力相關(guān)基因。這些研究證明黑龍江立克次體為毒力較強致病菌。

1.1 感染人血管內(nèi)皮細胞 孟艷芬等[3]將人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細胞分離，培養(yǎng)出人血管內(nèi)皮細胞，并用純化黑龍江立克次體體外感染血管內(nèi)皮細胞。感染后1～3 d，免疫熒光染色可見立克次體存在于細胞胞質(zhì)中，以游離狀態(tài)分散于胞質(zhì)內(nèi)，菌體外周有一層電子密度低的“環(huán)帶”將立克次體與宿主細胞胞質(zhì)分隔開。第5～9 d，立克次體在內(nèi)皮細胞以二分裂方式快速增殖，立克次體數(shù)量急劇增加，并且細胞核內(nèi)出現(xiàn)立克次體。被立克次體感染細胞的胞膜形成突觸，相鄰細胞胞膜凹陷將立克次體攝入胞質(zhì)。感染后第10 d，內(nèi)皮細胞由梭形貼壁伸展生長逐漸呈瘦長形，胞質(zhì)內(nèi)充滿立克次體，細胞核內(nèi)立克次體亦有增多。感染后第12 d，大部分內(nèi)皮細胞變圓脫落；檢查脫落內(nèi)皮細胞，可見細胞內(nèi)有大量立克次體。細胞培養(yǎng)上清中也有大量立克次體，這是由于立克次體大量繁殖致細胞裂解后立克次體釋放到上清中。

1.2 感染BALB/c小鼠 段長松等[4]采用眼眶靜脈叢注射將黑龍江立克次體感染BALB/c小鼠，定量PCR檢測感染小鼠血液和肝、脾、肺、腦等主要器官中立克次體DNA拷貝數(shù)。感染后第1 d檢出少量立克次體，第3 d立克次體載量顯著增長，第6 d達到頂峰，第9 d立克次體載量顯著下降。該結(jié)果證明黑龍江立克次體能夠在BALB/c小鼠體內(nèi)建立有效的感染。另外，黑龍江立克次體感染第6 d，小鼠肺和腦組織中檢出高水平的立克次體DNA，說明立克次體擴散到了肺和腦這兩個重要的器官，肺和腦損傷是立克次體感染致死的最重要原因。

黑龍江立克次體感染第1、3 d，小鼠的肝、脾、肺、腦組織沒有明顯病理改變。感染后第6 d，小鼠的肝、肺、腦組織出現(xiàn)明顯病理損傷：肝組織出現(xiàn)單核細胞炎性浸潤和匯管區(qū)多型核白細胞聚集以及肝細胞輕微溶脹，肺組織出現(xiàn)單個核細胞浸潤為特征的間質(zhì)性肺炎和肺泡壁增厚，腦實質(zhì)出現(xiàn)微出血點[4]。

黑龍江立克次體感染第3 d，小鼠肝、脾、肺、腦等主要器官中的IFN-γ、TNF-α和趨化因子RANTES的表達均顯著上調(diào)，說明小鼠啟動天然免疫應(yīng)答，但是器官的立克次體DNA拷貝數(shù)仍然在增加，說明天然免疫作用還比較弱，并不能有效抑制立克次體感染[4]。研究中發(fā)現(xiàn)促炎性因子IFN-γ和TNF-α的表達顯著上調(diào)與立克次體感染小鼠器官組織的炎性損傷密切相關(guān)。隨著這兩種炎性因子在器官組織中表達顯著下調(diào)，感染小鼠的器官組織損傷程度也顯著減輕。

1.3 全基因組序列分析毒力相關(guān)基因 段長松等[5-6]對黑龍江立克次體做全基因組測序，獲得一個全長1 278 471 bp的環(huán)狀基因組，該基因組含有1 333個基因，其中編碼蛋白質(zhì)的基因1 297個。將預(yù)測蛋白與毒力因子數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)黑龍江立克次體有266個潛在的毒力相關(guān)蛋白，16個編碼IV型分泌系統(tǒng)蛋白。該基因組有一個基因組島，全長3 732 bp，包括7個蛋白基因。其中兩個基因編碼已知功能蛋白：一個為IV型分泌系統(tǒng)蛋白VirB1類似物，另一個為轉(zhuǎn)座酶類似物。

段長松等[6]收集了立克次體屬的43株立克次體的全基因組序列，將這些序列使用統(tǒng)一注釋系統(tǒng)進行注釋，以去除不同注釋標準帶來的差異。分析這些統(tǒng)一注釋的全基因組序列，發(fā)現(xiàn)立克次體泛基因組含有4 737個基因，其中核心基因組有693個基因。將黑龍江立克次體與立氏立克次體強毒株(Sheila Smith)和弱毒株(Iowa)做直系同源ORF比較，發(fā)現(xiàn)它們共享983個直系同源ORF，黑龍江立克次體獨有481個ORF。值得注意的是：黑龍江立克次體與立氏立克次體強毒株共享37個直系同源ORF，這些ORF為立氏立克次體弱毒株所缺失，提示這37個基因可能與黑龍江立克次體毒力密切相關(guān)[6]。

2 表面蛋白分離鑒定和發(fā)現(xiàn)新保護性抗原

2.1 表面蛋白分離鑒定 國外學者[7]采用免疫印跡和分子克隆等技術(shù)，先后鑒定了外膜蛋白(Omp)A、OmpB、Sac1、Sac2、Adr1、Adr2等斑點熱立克次體表面蛋白，并證明這些表面蛋白與斑點熱立克次體的感染與免疫密切相關(guān)[1]。齊永等[8]采用膜不通透的生物素標記黑龍江立克次體表面蛋白，并用鏈親和素親和層析分離生物素標記的表面蛋白，再將層析分離的表面蛋白做等電聚焦和SDS-PAGE雙向電泳，最后用串聯(lián)質(zhì)譜對電泳分離的表面蛋白進行鑒定，結(jié)果鑒定出黑龍江立克次體的25種表面蛋白。用立克次體感染小鼠血清和患者血清分析黑龍江立克次體重組表面蛋白芯片，發(fā)現(xiàn)多數(shù)表面蛋白為血清學反應(yīng)陽性，其中OmpA-2、OmpB-3、RpsB、SdhB等表面蛋白具有與黑龍江立克次體感染血清反應(yīng)的特異性[9]。

龔文平等[10]采用同樣方法，鑒定了立氏立克次體的10種表面蛋白。除OmpA、OmpB、GroEL、GroES、DNA-binding protein等5個蛋白在國外已經(jīng)確認存在立氏立克次體表面外，Adr1、Adr2、OmpW、Porin_4、TolC等為首次鑒定的立氏立克次體表面蛋白。采用免疫電鏡對這5種新鑒定的表面蛋白做亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)Porin_4蛋白主要集中在血管內(nèi)皮細胞內(nèi)膜，其余的4種蛋白在細胞內(nèi)、外膜均有分布[10]。這些表面蛋白在細胞膜上呈點狀分布而非散在分布，這可能與其特殊的功能相關(guān)，比如吸附、運動、分子的結(jié)合及運輸?shù)取?/p>

2.2 保護性表面蛋白抗原的鑒定 國外學者[11]已經(jīng)明確的斑點熱立克次體保護性抗原僅有為OmpA和OmpB。龔文平等[10]將立氏立克次體新發(fā)現(xiàn)表面蛋白的重組蛋白免疫小鼠，用立氏立克次體攻擊免疫小鼠，最后用定量PCR檢測小鼠主要器官的立克次體載量。結(jié)果顯示Adr1、Adr2免疫小鼠的肝臟立克次體載量顯著低于非免疫小鼠；Adr2免疫小鼠的脾臟立克次體載量顯著低于非免疫小鼠；Adr1、Adr2、OmpW、Porin_4免疫小鼠的肺臟立克次體載量顯著低于非免疫小鼠。與此相反，TolC免疫小鼠的這些器官的立克次體載量與非免疫小鼠無顯著差異[10,12]。肺為立克次體感染主要器官，Adr1、Adr2、OmpW、Porin_4免疫能夠顯著減少小鼠肺部立克次體的載量，證明它們有良好的免疫保護性，為立氏立克次體保護性抗原。

齊永等[13]將黑龍江立克次體重組表面蛋白YbgF和PrsA分別免疫小鼠，再用黑龍江立克次體攻擊免疫小鼠。定量PCR檢測結(jié)果顯示YbgF免疫小鼠的立克次體載量顯著性低于PrsA免疫小鼠，而PrsA免疫小鼠的立克次體載量與非免疫小鼠無顯著差異，證明YbgF為保護性抗原。龔文平等[14]隨后也證明立氏立克次體YbgF也能誘導小鼠有效對抗立氏立克次體感染。另外，他還發(fā)現(xiàn)立氏立克次體外膜蛋白B片段OmpB-4與Adr2聯(lián)合免疫，它們誘導的特異性免疫保護效能顯著強于其單獨免疫[15]。另外，他們還發(fā)現(xiàn)貝氏柯克斯體全菌抗原與Adr2聯(lián)合免疫能夠顯著增強Adr2的抗立氏立克次體的免疫保護效能[16]。

3 保護性抗原的免疫保護機制

3.1 激活樹突狀細胞 孟艷芬等[17]從小鼠骨髓中分離樹突狀細胞(DC)。將黑龍江立克次體4個重組OmpB(OmpB-P1、OmpB-P2、OmpB-P3、OmpB-P4)刺激DC，24 h后將DC分別腹腔接種小鼠，14 d后用黑龍江立克次體攻擊DC受體小鼠，攻毒7d后用定量PCR檢查小鼠臟器的立克次體載量。結(jié)果顯示OmpB-P2、OmpB-P3或OmpB-P4刺激DC的受體小鼠的立克次體載量顯著低于非抗原刺激DC的受體小鼠或OmpB-P1刺激DC的受體小鼠。該結(jié)果提示OmpB-P2、OmpB-P3、OmpB-P4激活DC能誘導小鼠產(chǎn)生抗黑龍江立克次體免疫應(yīng)答，而OmpB-P1激活DC則不能。

采用磁珠分選技術(shù)將抗原激活DC的受體小鼠脾臟CD4+和CD8+T細胞分離，再將CD4+和CD8+T細胞分別與同源抗原刺激DC在體外相互作用24 h，然后用流式細胞儀檢測CD4+和CD8+T細胞的IFN-γ、TNF-α、IL-4表達。結(jié)果顯示OmpB-P2、OmpB-P3和OmpB-P4激活DC均能誘導CD4+T細胞分泌高水平的IFN-γ和TNF-α，其中IFN-γ水平顯著高于OmpB-P1激活DC作用的CD4+T細胞。另外還發(fā)現(xiàn)OmpB-P2、OmpB-P3、OmpB-P4激活DC均能誘導CD8+T細胞分泌高水平的IFN-γ和TNF-α，其水平顯著高于OmpB-P1刺激DC作用的CD8+T細胞[17]。這些提示立克次體保護性抗原激活的DC能夠誘導抗原特異的CD4+和 CD8+T細胞高效表達IFN-γ和TNF-α，使它們分別向Th1細胞和Tc1細胞分化，產(chǎn)生有效的特異性細胞免疫應(yīng)答[17]。

3.2 激活體液免疫應(yīng)答 齊永等[13]比較黑龍江立克次體YbgF和PrsA誘導小鼠的特異性體液免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)雖然這兩個蛋白都有能力誘導小鼠產(chǎn)生高水平的特異性IgG抗體，但是保護性抗原YbgF免疫血清抑制立克次體入侵人血管內(nèi)皮細胞能力顯著強于非保護性抗原PrsA免疫血清。同樣，龔文平等[10,12]發(fā)現(xiàn)立氏立克次體保護性抗原免疫血清能夠顯著抑制立氏立克次體侵入人血管內(nèi)皮細胞。這些結(jié)果提示這些保護性表面蛋白抗原的特異性抗體可以與立克次體表面相應(yīng)抗原結(jié)合，從而阻止其對人血管內(nèi)皮細胞的粘附和入侵。

國外研究[18]發(fā)現(xiàn)IgG2a抗體的Fc部分可以與補體相互作用并激活巨噬細胞的Fc受體，誘導Fc受體介導的免疫效應(yīng)，其中包括激活抗體依賴的細胞毒作用和調(diào)理巨噬細胞的吞噬作用。齊永[13]和龔文平等[12]研究證明這些保護性抗原均能誘導小鼠產(chǎn)生高水平的特異性IgG2a，而非保護性抗原則不能。

3.3 激活細胞免疫應(yīng)答 齊永等[13]發(fā)現(xiàn)黑龍江立克次體保護性抗原YbgF能特異性誘導感染小鼠CD4+T細胞顯著增殖和TNF-α分泌。龔文平等[12]用立氏立克次體保護性抗原Adr2體外刺激立氏立克次體感染小鼠的CD4+T細胞，發(fā)現(xiàn)該CD4+T細胞分泌TNF-α、IFN-γ的水平顯著高于Adr2刺激的非感染小鼠CD4+T細胞。另外，Adr2刺激的感染小鼠CD8+T細胞分泌IFN-γ和IL-6的水平顯著高于Adr2刺激的非感染小鼠CD8+T細胞。

王穎等[19]在體外將人單核細胞轉(zhuǎn)化為樹突狀細胞(HMDCs)，發(fā)現(xiàn)保護性抗原激活的HMDCs能夠誘導人CD4+和 CD8+T細胞激活并表達高水平IFN-γ和TNF-α，驅(qū)使CD4+和 CD8+T細胞分別朝著Th1 和 Tc1 極化。熊小路等[20]發(fā)現(xiàn)貝氏柯克斯體保護性蛋白抗原的Th1表位肽混合免疫能夠有效激活小鼠CD4+T細胞，誘導小鼠產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答對抗貝氏柯克斯體感染，提示保護性抗原的CD4+和CD8+T細胞表位在誘導抗立克次體的免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。

4 Tim-3增強血管內(nèi)皮細胞殺立克次體效能

T細胞免疫球蛋白和粘附分子-3 (Tim-3)最初被認為是Th1細胞的特異性受體，它通過調(diào)節(jié)Th1細胞的功能，維持免疫平衡和免疫耐受。研究發(fā)現(xiàn)Tim-3也在多種免疫活性細胞表達，包括斑點熱立克次體的宿主細胞—血管內(nèi)皮細胞。

楊小梅等[21]用黑龍江立克次體感染C3H/HeN小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)立克次體感染3 d內(nèi)，小鼠脾臟立克次體數(shù)量隨著感染時間延長而逐漸增加，Tim-3 mRNA表達水平則逐漸下降。用黑龍江立克次體感染體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞，立克次體載量與Tim-3 mRNA表達水平也呈負相關(guān)。體內(nèi)、外實驗結(jié)果一致證明Tim-3參與了立克次體感染早期的免疫應(yīng)答。

楊小梅等[21]使用小鼠Tim-3胞外段與人IgG1-Fc的融合蛋白阻斷小鼠的Tim-3信號通路。結(jié)果顯示小鼠脾臟的立克次體載量明顯增多，小鼠外周血中抗胞內(nèi)菌感染相關(guān)細胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-18)和趨化因子RANTES表達水平明顯下降。該結(jié)果提示，Tim-3信號通路的阻斷能夠抑制宿主的抗立克次體免疫應(yīng)答。用黑龍江立克次體感染Tim-3高表達的轉(zhuǎn)基因小鼠，感染后第3 d發(fā)現(xiàn)該小鼠無明顯感染表現(xiàn)，而野生型對照小鼠的感染則非常明顯，另外Tim-3高表達小鼠的抗胞內(nèi)菌感染相關(guān)細胞因子和趨化因子水平顯著高于野生型小鼠。這些說明Tim-3高表達能夠增強宿主抗立克次體的免疫應(yīng)答。

楊小梅等[21]用黑龍江立克次體感染用Tim-3-人IgG1-Fc融合蛋白封閉了Tim信號通路的血管內(nèi)皮細胞，感染3 d后發(fā)現(xiàn)該細胞內(nèi)立克次體數(shù)量顯著多于對照細胞，提示Tim-3信號通路的阻斷能夠降低血管內(nèi)皮細胞殺立克次體的效能。用黑龍江立克次體感染穩(wěn)定高表達或低表達Tim-3的血管內(nèi)皮細胞，3 d后發(fā)現(xiàn)Tim-3高表達細胞的立克次體數(shù)量顯著低于對照細胞，而Tim-3低表達細胞的立克次體數(shù)量顯著高于對照細胞。這些說明Tim-3高表達能夠增強血管內(nèi)皮細胞殺立克次體作用，而抑制Tim-3表達或阻斷Tim-3信號通路則能抑制血管內(nèi)皮細胞的抗立克次體相關(guān)細胞因子和趨化因子的表達，進而降低血管內(nèi)皮細胞殺傷胞內(nèi)立克次體的效能。

楊小梅等[21]還發(fā)現(xiàn)黑龍江立克次體感染3 d后，無論是阻斷Tim-3信號通路還是降低Tim-3表達的血管內(nèi)皮細胞，其一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表達水平和IFN-γ mRNA表達水平顯著下降。國外研究已經(jīng)證明IFN-γ能夠誘導巨噬細胞增加NO合成去殺傷胞內(nèi)菌，因此該結(jié)果提示Tim-3表達下降或Tim-3信號通路阻斷能夠抑制血管內(nèi)皮細胞的IFN-γ mRNA表達，進而減少iNOS表達和NO合成去降低血管內(nèi)皮細胞殺立克次體的效能。另外，黑龍江立克次體感染3 d后，Tim-3高表達小鼠的脾臟IFN-γ和TNF-α以及iNOS mRNA表達水平均顯著高于野生型小鼠，而脾臟內(nèi)立克次體數(shù)量則顯著低于野生型小鼠。這些說明Tim-3高表達和Tim-3信號通路激活能夠上調(diào)宿主和宿主細胞IFN-γ和TNF-α表達，進而增加iNOS表達和NO合成去殺傷胞內(nèi)、外的立克次體。

5 結(jié) 語

近年來，研究證明我國分離的黑龍江立克次體為毒力較強的致病菌，測定了黑龍江立克次體和立氏立克次體表面蛋白質(zhì)組并發(fā)現(xiàn)了新保護性抗原，同時研究證明這些保護性抗原能夠誘導抗原特異CD4+和CD8+T細胞增殖并產(chǎn)生高水平IFN-γ和/或TNF-α，以及誘導高水平特異性IgG2a，在這些免疫因素的協(xié)同作用下使機體能夠有效抵抗立克次體感染。另外，研究首次證明Tim-3高表達和Tim-3信號通路激活能夠增強宿主和宿主細胞—血管內(nèi)皮細胞清除立克次體感染的能力。

未來將研究表面蛋白在斑點熱立克次體與宿主細胞相互作用中所扮演角色，以及它們對宿主細胞Tim-3信號通路的影響，并鑒定保護性表面蛋白抗原的CD4+和CD8+T細胞表位。通過這些研究，將進一步闡明斑點熱立克次體的分子致病機制，研發(fā)出有效的斑點熱分子疫苗，并為斑點熱的治療提供新思路。

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Experimental studies on infection and immunity of spotted fever group rickettsiae in China

XIONG Xiao-lu, JIAO Jun, WEN Bo-hai

(StateKeyLaboratoryofPathogenandBiosecurity,InstituteofMicrobiologyandEpidemiology,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100071,China)

Studies showed thatRickettsiaheilongjiangensiscould infect human vascular endothelial cells (ECs) and BALB/c mice, causing bacteremia and organ damage in mice; whole genomic sequence assay revealed the virulence-associated genes ofR.heilongjiangensis. The study of surface proteome identified the surface proteins ofR.heilongjiangensisandR.rickettsii. By immunization of C3H/HeN mice with the surface proteins, several protective antigens were determined, which could efficiently induce proliferation and secretion of IFN-γ and/or TNF-α of in CD4+and CD8+T cells and elicited production of IgG2a in B cells, by which, the rickettsial organisms were eradicated in mice. We usedR.heilongjiangensisto infect ECs with low expression of Tim-3 and overexpressed Tim-3 or mice with overexpressed Tim-3, our results strongly demonstrated that enhanced Tim-3 expression could inhibit rickettsial growth, bothinvivoin mice andinvitroin ECs.

spotted fever group rickettsiae; infection; immunity; protective antigen

Wen Bo-hai, Email: bohaiwen@sohu.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.010.013

國家自然科學基金(No.31470894)

溫博海，Email: bohaiwen@sohu.com

軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所，病原生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071

R376

A

1002-2694(2016)10-0917-05

2016-05-09；

2016-08-17

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31470894)