立克次體與立克次體病的檢測與鑒定

張驍鵬，李炘檑，鄭波，胡曉梅

1.第三軍醫(yī)大學微生物教研室，重慶市微生物工程實驗室，重慶400038；2.第三軍醫(yī)大學學員旅八營，重慶 400038

立克次體與立克次體病的檢測與鑒定

張驍鵬1，李炘檑2，鄭波2，胡曉梅1

1.第三軍醫(yī)大學微生物教研室，重慶市微生物工程實驗室，重慶400038；2.第三軍醫(yī)大學學員旅八營，重慶 400038

立克次體是一類嚴格細胞內(nèi)寄生的原核細胞型微生物，已被列入生物戰(zhàn)劑名錄。立克次體病是一類嚴重威脅人類健康的人獸共患的自然疫源性疾病。立克次體嚴格的細胞寄生性決定了立克次體病的診斷不同于傳統(tǒng)方法，需根據(jù)流行病學資料、臨床癥狀和體征及實驗室檢測進行綜合判斷，通常實驗室檢測是明確診斷的主要依據(jù)。從病原體的分離和培養(yǎng)到目前的基因水平比對，立克次體的檢測技術(shù)雖發(fā)展了100多年，但人類尚未實現(xiàn)早期快速診斷立克次體病的目標。本文主要綜述了立克次體與立克次體病檢測與鑒定的研究進展。

立克次體；立克次體??；檢測；鑒定

1 立克次體與立克次體病

立克次體是一類嚴格細胞內(nèi)寄生的原核細胞型微生物，天然寄生于多種吸血節(jié)肢動物和昆蟲體內(nèi)［1，2］。對人類致病的立克次體主要包括5個屬，分別為立克次體科中的東方體屬、埃立克體屬、柯克斯體屬和立克次體屬，以及巴通體科的巴通體屬（表1）。其中立克次體屬包括2個群：斑疹傷寒群僅有普氏立克次體和斑疹傷寒立克次體2個種；而目前發(fā)現(xiàn)對人類致病的斑點熱群已超過15個種，如立氏立克次體、西伯利亞立克次體、澳大利亞立克次體、康氏立克次體等，該群還不斷有新現(xiàn)立克次體導致人類疾病的報道［3－5］。

表1 主要立克次體病及流行區(qū)域Tab.1 The epidemic area of main rickettsial diseases

立克次體病是一類人獸共患的自然疫源性疾病。人體通過感染立克次體的昆蟲叮咬或接觸其糞便而感染，多發(fā)生于熱帶與亞熱帶國家和地區(qū)，在歷史上曾嚴重威脅人類健康。近年來，世界范圍內(nèi)新發(fā)及再發(fā)立克次體病逐年上升，引起人們關注［6］。立克次體病通常指由立克次體屬和東方體屬感染所引起的人類疾病，分為斑疹傷寒、斑點熱和恙蟲病［7］。

斑疹傷寒主要由斑疹傷寒群立克次體引起，包括普氏立克次體引起的流行性斑疹傷寒（或虱傳斑疹傷寒）和斑疹傷寒立克次體引起的地方性斑疹傷寒（或鼠傳斑疹傷寒）。普氏立克次體通過人類體虱進行傳播，體虱叮咬患者后普氏立克次體隨患者血液感染體虱消化道，在患者與他人親密接觸過程中可伴隨體虱轉(zhuǎn)移至新的宿主，叮咬人類皮膚形成傷口，并通過糞便感染這些傷口，從而引起流行性斑疹傷寒。斑疹傷寒立克次體通過鼠蚤糞便感染人類，造成地方性的流行性傳播。

斑點熱群立克次體病主要根據(jù)發(fā)現(xiàn)的地域和相應的立克次體分群來命名，如落基山斑點熱、非洲蜱咬熱、昆士蘭斑疹傷寒、日本紅斑熱，以及我國流行的北亞蜱傳斑點熱、黑龍江蜱傳斑點熱、內(nèi)蒙古蜱傳斑點熱等，目前除極地地區(qū)外世界各地均有該群立克次體病的報道［8］。斑點熱群立克次體也主要通過蜱類傳播，受環(huán)境濕度和溫度、自然植被與野生動物、人類活動及殺蟲劑應用等因素的影響，呈現(xiàn)地域流行性特征［9］。

恙蟲病由恙蟲病東方體引起，通過恙螨幼蟲傳播，主要分布于叢林地區(qū)，也稱叢林斑疹傷寒。

目前，美國已將引起流行性斑疹傷寒、落基山斑點熱及Q熱的立克次體列入生物戰(zhàn)劑名錄中［10，11］。這3種立克次體也是實驗室感染的重要病原體。

2 致病機制和臨床表現(xiàn)

立克次體對內(nèi)皮細胞有明顯的親嗜性（其次是對單核-巨噬細胞和干細胞），通過其表面蛋白與宿主細胞相應受體的特異性結(jié)合侵入內(nèi)皮細胞。立克次體的表面蛋白主要包括外膜蛋白A和B（OmpA／B），OmpA僅存在于斑點熱群立克次體，而OmpB普遍存在于立克次體屬，與宿主細胞表面受體Ku70特異性結(jié)合，募集Arp2／3復合物，在其他表面蛋白如RickA的協(xié)助下改變宿主細胞內(nèi)的肌動蛋白構(gòu)象，從而介導宿主細胞的內(nèi)吞作用，將立克次體吞入細胞。然后，立克次體憑借磷脂酶D和溶血素C迅速破壞內(nèi)體膜，在內(nèi)體與溶酶體融合前進入胞質(zhì)，以免被溶酶體溶解。在宿主細胞內(nèi)大量增殖的同時，立克次體會引起宿主細胞產(chǎn)生大量過氧化物，導致細胞膜磷脂過氧化損傷，破壞細胞間的緊密連接，造成宿主細胞膜的破壞和血管內(nèi)皮通透性增高［12］。這一方面引起患者組織水腫和循環(huán)血量下降（如果發(fā)生于肺和腦組織，后果尤為嚴重），另一方面會增強立克次體的組織間擴散。立克次體可隨宿主細胞破裂崩解入血，引起第1次菌血癥，隨即擴散至全身各處血管內(nèi)皮細胞并增殖。被立克次體感染的細胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子β（tumor necrosis factorβ，TNF-β）、白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）、IL-8等炎性介質(zhì)，引起機體炎癥反應，患者出現(xiàn)發(fā)熱、乏力、頭昏頭痛等癥狀。若未加以干預治療，在患者血管內(nèi)皮細胞中廣泛增殖的立克次體會再次引起血管內(nèi)皮通透性增加并釋放入血，引起第2次菌血癥，往往導致機體嚴重的炎癥反應和彌散性血管內(nèi)凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC），病死率較高。

立克次體病的主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、皮疹、肌肉痛和頭痛。斑點熱群立克次體病常伴有惡心、嘔吐、腹瀉等胃腸道癥狀，恙蟲病常伴有廣泛性的淋巴結(jié)腫大和疼痛。除斑疹傷寒群外，立克次體感染的典型癥狀為蜱或螨叮咬部位形成的焦痂樣皮損，但通常由于皮損部位隱秘且無痛，很難觀察到而被忽視。由于立克次體病的臨床表現(xiàn)一般缺乏特異性，實驗室檢測通常是明確診斷的主要依據(jù)。實驗室常用的血清學診斷要在發(fā)病后10～12 d才開始呈陽性，無法滿足早期診斷的需求，且由于立克次體之間存在廣泛的抗原交叉，血清學檢測只能用于分群診斷［7］。因此，發(fā)展立克次體的早期快速診斷和分型診斷的技術(shù)迫在眉睫［13］。

3 檢測與鑒定

3.1 病原學診斷

立克次體感染初期，即病原體通過節(jié)肢動物叮咬侵入患者機體時，往往沒有明顯的疾病表現(xiàn)，患者不會就醫(yī)，很難分離到陽性標本，僅能從部分患者被叮咬部位形成的焦痂中通過組織活檢分離得到。當立克次體在患者體內(nèi)大量增殖而引起明顯疾病表現(xiàn)時，可從血液樣本中分離到立克次體，由于其是胞內(nèi)寄生菌，故血液樣本中有核細胞含量越多，檢出陽性率越大。另外，在疾病中后期出現(xiàn)的皮損中也能分離到大量立克次體。除患者外，從立克次體的中間宿主如虱、蚤等節(jié)肢動物體內(nèi)，以及自然宿主如野生哺乳類、鳥類和嚙齒類動物體內(nèi)，也可分離出大量的立克次體。

立克次體的培養(yǎng)和染色觀察是其診斷和分類的重要方法，為研究奠定了重要基礎。最為經(jīng)典的常規(guī)培養(yǎng)方法為雞胚接種，也可采用細胞培養(yǎng)（如Vero細胞），但仍需借助染色觀察或其他技術(shù)手段加以診斷和鑒別［14］。吉姆薩（Giemsa）染色法、吉姆尼茨（Gimenez）染色法、直接免疫熒光法（direct immunofluorescence assay，DFA）等可用于立克次體鑒定，但在非培養(yǎng)條件下很難觀察到陽性結(jié)果［15］。

立克次體檢查耗時長、成本高，對檢測人員的要求高，且存在一定的繼發(fā)感染風險，目前僅用于基礎研究和流行病學調(diào)查，不作為臨床檢測的主要方法。

3.2 血清學診斷

由于立克次體中部分種屬與變形桿菌有抗原交叉，可利用變形桿菌屬X19，X2.Xk菌株的菌體O抗原代替立克次體抗原，與患者血清進行交叉凝集反應，檢測患者血清中相應抗體，即外斐試驗。外斐試驗一度是立克次體診斷最經(jīng)典的方法，成本低廉，但特異性很差，目前已逐漸被特異性較高的熒光免疫法取代，僅在經(jīng)濟條件較差的國家和地區(qū)使用。免疫熒光法利用含有立克次體外膜蛋白特異性表位的熒光探針，檢測患者體內(nèi)針對該蛋白產(chǎn)生的特異性抗體，以診斷立克次體感染。免疫熒光法包括直接法和間接法2種，其中間接熒光法（indirect fluorescence assay，IF）是目前診斷立克次體感染的“金標準”?；诖嗽斫⒌拿嘎?lián)免疫法，即用酶染料代替熒光染料標記，常用于實驗室研究，其中免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）與酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）最常用［16］，但以上方法仍存在不能確定種屬且不能應用于早期診斷的問題。

3.3 聚合酶鏈反應和限制性片段長度多態(tài)性分析

1989年聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)的出現(xiàn)，為立克次體的診斷與分型打開了一扇新的大門，從而進入基因檢測的新時期。最初研究者嘗試利用普通PCR檢測立克次體的特定序列，但特異性和敏感性均不滿意。隨后改良的套式PCR（nested PCR，nPCR）明顯提高了檢測靈敏度，但存在假陽性率過高的問題。實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRTPCR）很好地克服了這一缺陷，還可利用熒光標記進行定量檢測［17］。DNA檢測縮短了立克次體診斷的窗口期，比傳統(tǒng)的血清學檢測更適用于早期快速診斷，已被很多研究機構(gòu)所采用。

由于立克次體的基因組高度保守，采用單一序列進行PCR檢測無法達到種屬分型的需求，研究者進一步采用限制性片段長度多態(tài)性分析（restrictionfragment length polymorphism，RFLP），即通過比較被限制性內(nèi)切酶處理過的樣本基因片段長度來鑒別不同立克次體及鑒定未知立克次體的種屬［18］。該法使立克次體的分型診斷首次成為現(xiàn)實，具有重要意義。但其僅通過酶切后的基因長度進行分析，仍無法為親緣性較近的立克次體分型，對其信度和效度也存在一定爭議。

3.4 多位點序列分型與全基因組比對分析

隨著生物信息學技術(shù)的發(fā)展，多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST或MST）成為立克次體基因診斷與分型較為可靠的新方法。2003年Fournier利用立克次體OmpA的編碼基因序列與GenBank中的已知序列比對進行斑點熱群立克次體的種間鑒別［5］，并做了大量實驗驗證工作［19］。隨后Fournier采用了新的算法，同時比對rrs、 gltA、ompA、ompB和sca4這5個不同基因，綜合5個位點的比對結(jié)果進行分型［20］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MLST大大提高了立克次體檢測的敏感性和分型的可靠性，自此立克次體的MLST法得以建立［21］，并很快在世界范圍內(nèi)被廣泛采用［22，23］。但某些樣品的MLST分析結(jié)果與目前通用的16s RNA分型結(jié)果并不完全一致，對現(xiàn)有的生物分類學標準提出了一定挑戰(zhàn)［9，24］。

隨著人類進入后基因組時代，全基因組測序的效率大幅度提高，越來越多的立克次體全基因組測序結(jié)果先后被報道［25］。Walker等首次對立克次體進行全基因組水平的比對分析，比傳統(tǒng)的5基因MLST法更全面，開啟了細菌全基因組鑒定的先河［26］。但其仍為DNA水平的比對分析，對樣本的要求也比傳統(tǒng)PCR更高（表2）。

表2 立克次體與立克次體病的檢測與鑒定方法Tab.2 Detection and identification of Rickettsiaand rickettsial diseases

4 結(jié)語

從病原體的培養(yǎng)觀察到較為特異的血清學診斷，再到基因水平的診斷和鑒定分型，人類在立克次體的診斷與分型道路上不斷探索和前進。立克次體作為一種重要的生物戰(zhàn)劑，對其進行深度的流行病學研究和病原學分析意義重大。隨著后基因組時代的到來，基因診斷與分型技術(shù)不斷提高，高通量的芯片和測序技術(shù)也不斷發(fā)展和完善，實現(xiàn)立克次體與立克次體病的早期快速檢測與鑒定指日可待。

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Detection and identification of Rickettsiaand rickettsial diseases

ZHANG Xiao-Peng1，LI Xin-Lei2，ZHENG Bo2，HU Xiao-Mei1
1.Department of Microbiology，College of Basic Medical Sciences，The Third Military Medical University，Chongqing 400038，China；2.Eighth Battalion，Cadet Brigade，The Third Military Medical University，Chongqing 400038，China

Rickettsia is an obligate intracellular parasitic bacterium which has been included in the list of biowarfare agents.Rickettsial diseases are zoonotic，natural focal diseases，and also threats to human health seriously.Different from the standard detection methods for other bacteria，the diagnosis of rickettsial diseases needs a collective consideration of the epidemiological data，clinical symptoms and laboratory test results.Although Rickettsia detection technology has been developed for more than 100 years，early rapid diagnosis is still difficult.Current progresses on Rickettsia and rickettsial disease detection，including pathogen isolation and molecular detections，are reviewed in this paper.

Rickettsia；Rickettsial disease；Detection；Identification

.HU Xiao-Mei，E-mail：hxmay2008＠163.com

2014－12－09）

全軍“十二五”重大科研項目（AWS11C001）

胡曉梅