CD36和胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路在脂多糖誘導(dǎo)炎癥因子中的作用研究

秦園，曹浚垣，吳淑燕，黃瑞

蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院病原生物學(xué)系，蘇州 215123

CD36和胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路在脂多糖誘導(dǎo)炎癥因子中的作用研究

秦園，曹浚垣，吳淑燕，黃瑞

蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院病原生物學(xué)系，蘇州 215123

本研究以鼠源巨噬細(xì)胞RAW264.7為模型，研究CD36和胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）通路對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子的影響。首先用100 ng／ml LPS刺激正常及小干擾RNA（siRNA）技術(shù)沉默CD36表達(dá)的巨噬細(xì)胞16 h，檢測巨噬細(xì)胞的ERK活性及分泌炎癥因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）和IL-10的水平；繼而以20 nmol／L ERK抑制劑處理細(xì)胞，再用LPS刺激，檢測以上各項(xiàng)指標(biāo)的變化，進(jìn)一步明確ERK通路與LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子的相關(guān)性。結(jié)果顯示，經(jīng)LPS刺激，巨噬細(xì)胞的ERK活性顯著增強(qiáng)，分泌的促炎因子TNF-α和IL-6顯著增高，抑炎因子IL-10水平無明顯變化；與CD36正常表達(dá)的巨噬細(xì)胞相比，CD36表達(dá)下降的巨噬細(xì)胞ERK活性及促炎因子TNF-α、IL-6水平顯著下降，抑炎因子IL-10顯著增多。與未處理組相比，ERK抑制劑預(yù)處理的巨噬細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的ERK活性顯著降低，促炎因子TNF-α和IL-6水平降低，抑炎因子IL-10水平升高。結(jié)果提示，LPS能通過其受體——CD36，激活巨噬細(xì)胞內(nèi)ERK活性，進(jìn)而促進(jìn)巨噬細(xì)胞促炎因子的分泌。

脂多糖；巨噬細(xì)胞；CD36；胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路；炎癥因子

超過30%的醫(yī)院內(nèi)感染由革蘭陰性菌引起，革蘭陰性菌引發(fā)的敗血癥和膿毒血癥休克是住院患者死亡的首要原因［1］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）即革蘭陰性菌內(nèi)毒素，由脂質(zhì)A、核心多糖和特異多糖組成。其中脂質(zhì)A是主要毒性成分，且無種屬特異性，因此不同細(xì)菌的LPS有相似的毒性作用，嚴(yán)重時(shí)威脅生命。目前認(rèn)為LPS的致病機(jī)制是通過與LPS結(jié)合蛋白（lipopolysaccharide binding protein，LBP）及CD14分子形成LPS-LBP-CD14復(fù)合物，再與Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）及輔助受體髓樣分化因子2（myeloid differential factor 2，MD-2）作用，激發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號途徑，激活單核-巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子，最終導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生病理變化［2］。適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)有利于機(jī)體清除細(xì)菌，但過度反應(yīng)使機(jī)體遭受損傷。

巨噬細(xì)胞參與宿主抗感染免疫過程，其依賴模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）識別病原菌的病原體相關(guān)分子模式（pathogenassociated molecular pattern，PAMP），啟動天然免疫，通過吞噬、消化及釋放炎癥因子而清除致病菌。在獲得性免疫中，巨噬細(xì)胞對細(xì)菌抗原具有處理和呈遞作用［3］。LPS作為革蘭陰性菌的PAMP，非常保守且與致病性有關(guān)，在巨噬細(xì)胞與革蘭陰性菌相互作用過程中至關(guān)重要。CD36是一種PRR，屬于能識別脂類和LPS等多種配體的清道夫受體，在巨噬細(xì)胞中高表達(dá)［4］，人與小鼠間cd36基因序列高度保守［5］。研究發(fā)現(xiàn)，長鏈脂肪酸與CD36結(jié)合后，可激活下游胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulated kinase，ERK）通路，促發(fā)細(xì)胞核內(nèi)核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）活化，促進(jìn)炎癥因子分泌，導(dǎo)致脂代謝紊亂和炎癥反應(yīng)，誘發(fā)心血管疾?。?，7］。CD36和ERK通路參與脂代謝有關(guān)的炎癥反應(yīng)屢見報(bào)道，但其在LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌中的作用及相關(guān)機(jī)制研究甚少。本研究應(yīng)用LPS刺激小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）轉(zhuǎn)染和ERK抑制劑干預(yù)的巨噬細(xì)胞模型，探討CD36和ERK通路對LPS誘導(dǎo)炎癥因子分泌的影響，為深入研究其致病機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及試劑鼠源巨噬細(xì)胞RAW264.7購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。試劑包括LPS（Escherichia coli 0111∶B4）、CD36 siRNA與Negative control siRNA、脂質(zhì)體iMax、ERK抑制劑（PD0325901）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）等。兔抗磷酸化ERK（phosphated ERK，pERK）、兔抗總ERK（total ERK，tERK）和鼠抗Tubulin購自優(yōu)寧維生物技術(shù)有限公司，鼠抗GAPDH購自Bioworld Technology公司，山羊抗鼠CD36、兔二抗、鼠二抗和山羊二抗購自R＆D Systems公司，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自eBioscience公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Thermo公司，倒置顯微鏡購自O(shè)lympus公司，低溫高速離心機(jī)購自Eppendorf公司，連續(xù)光譜酶標(biāo)儀購自Thermo Fisher Scientific公司，PowerPac Basic電泳儀購自Bio-Rad公司，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescene，ECL）全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析儀購自上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中。siRNA序列設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)［8］（表1）。轉(zhuǎn)染分為2組：陰性對照組中加入脂質(zhì)體iMax和Negative control siRNA復(fù)合物，CD36 siRNA轉(zhuǎn)染組中加入脂質(zhì)體iMax和CD36 siRNA復(fù)合物。轉(zhuǎn)染前1 d，將細(xì)胞以4×105個(gè)／孔鋪入12孔板，細(xì)胞融合度達(dá)60%時(shí)轉(zhuǎn)染，24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)［8］。

表1 siRNA序列Tab.1 The sequences of siRNA

1.2.2 MTT法檢測不同濃度ERK抑制劑對細(xì)胞活性的影響將細(xì)胞以5 000個(gè)／孔接種于96孔板。將0、5、10、20、50、100 nmol／L ERK抑制劑作用于細(xì)胞，每個(gè)濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，參照文獻(xiàn)［9］，用MTT法處理細(xì)胞并檢測各孔540 nm和570 nm處的光密度（optical density，OD），計(jì)算平均值。細(xì)胞存活率（%）＝實(shí)驗(yàn)組OD540～570值／空白組OD540～570值×100%。

1.2.3 LPS與細(xì)胞共作用模型的建立首先用LPS刺激正常及轉(zhuǎn)染CD36 siRNA的巨噬細(xì)胞，并設(shè)平行對照。參照文獻(xiàn)［10］，將100 ng／ml LPS與細(xì)胞共作用16 h后收集蛋白，繼而建立ERK抑制劑干預(yù)細(xì)胞模型。分組：對照組、ERK抑制劑干預(yù)組、LPS刺激組、LPS刺激＋ERK抑制劑干預(yù)組。參照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，ERK抑制劑干預(yù)濃度為20 nmol／L，作用8 h后，在LPS刺激組和LPS刺激＋ERK抑制劑干預(yù)組加入100 ng／ml LPS，繼續(xù)作用16 h，收集蛋白，用以進(jìn)一步明確LPS與ERK活性的相關(guān)性。

1.2.4 蛋白免疫印跡法檢測巨噬細(xì)胞CD36、pERK和tERK細(xì)胞經(jīng)不同條件處理、裂解，提取蛋白并測定濃度。取20μg樣品進(jìn)行8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜上。5%脫脂牛奶封閉NC膜1 h，加入兔抗pERK和tERK（1∶1 000）、鼠抗Tubulin和GAPDH（1∶1 000）、山羊抗鼠CD36（1∶1 000），4℃孵育過夜。次日用含吐溫20的Tris緩沖液（Tris buffered saline with Tween-20，TBST）洗膜3次，加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的抗兔、抗鼠或抗山羊二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，化學(xué)發(fā)光法顯影，檢測CD36、pERK和tERK蛋白表達(dá)。

1.2.5 ELISA檢測巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素6和白細(xì)胞介素10的水平將細(xì)胞以1×106個(gè)／孔接種于6孔板中培養(yǎng)過夜，根據(jù)LPS與細(xì)胞共作用模型分組。①siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，DMEM洗3次，所有LPS刺激組加入含100 ng／ml LPS的無血清培養(yǎng)基，其余組加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)16 h。②20 nmol／L ERK抑制劑干預(yù)細(xì)胞8 h，DMEM洗3次，加入含20 nmol／L ERK抑制劑的無血清培養(yǎng)基，對照組加入無血清培養(yǎng)基；LPS刺激方法同①。收集各組培養(yǎng)基并用ELISA試劑盒檢測腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL-6）和IL-10水平。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組均數(shù)兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD36對LPS激活巨噬細(xì)胞ERK活性的影響

用蛋白免疫印跡法檢測巨噬細(xì)胞中CD36表達(dá)和ERK磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)CD36在巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，且LPS刺激對CD36的表達(dá)無顯著影響。與無LPS刺激的陰性對照組相比，ERK磷酸化水平在LPS刺激后顯著升高（P＜0.01），表明LPS能激活巨噬細(xì)胞的ERK活性（圖1）。在LPS刺激條件下，經(jīng)CD36 siRNA處理的巨噬細(xì)胞中CD36表達(dá)顯著降低，ERK活性亦降低（P＜0.05），表明CD36表達(dá)下降可抑制LPS激活的ERK信號途徑。

2.2 CD36對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子的影響

用ELISA檢測炎癥因子的分泌水平，結(jié)果顯示，單獨(dú)LPS刺激組與陰性對照組相比，TNF-α和IL-6分泌水平顯著升高（P＜0.01），而IL-10分泌水平無顯著差異。LPS刺激＋CD36 siRNA組與單獨(dú)LPS刺激組相比，TNF-α和IL-6分泌水平顯著降低（P＜0.05），而IL-10分泌水平顯著升高（P＜0.01）（圖2）。表明LPS刺激巨噬細(xì)胞后，通過其受體CD36誘導(dǎo)促炎因子產(chǎn)生，而CD36表達(dá)下降導(dǎo)致促炎因子分泌水平下降；對抗炎因子的影響則與之相反。

2.3 ERK抑制劑工作濃度的確定

MTT法結(jié)果顯示，隨ERK抑制劑工作濃度升高，細(xì)胞存活率逐漸降低。在不高于20 nmol／L的抑制劑作用下，細(xì)胞存活率均超過50%（圖3A）。結(jié)合蛋白免疫印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在20和50 nmol／L ERK抑制劑作用下，細(xì)胞中ERK活性最?。≒＜0.01），抑制效果最好（圖3B、3C）。綜合上述結(jié)果，將20 nmol／L作為ERK抑制劑干預(yù)細(xì)胞的工作濃度。

圖1 CD36對LPS激活巨噬細(xì)胞ERK活性的影響Fig.1 CD36 influences the activation of ERK induced by LPS

圖2 CD36對LPS激活巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6和IL-10的影響Fig.2 Influence of CD36 on secretion of TNF-α，IL-6 and IL-10 measured by ELISA

圖3 ERK抑制劑工作濃度的確定Fig.3 Determination of the working concentration of ERK inhibitor

2.4 ERK抑制劑對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞ERK活化及分泌炎癥因子的影響

LPS與ERK抑制劑干預(yù)的細(xì)胞共作用后，對細(xì)胞中ERK磷酸化水平進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS刺激組ERK活性顯著升高（P＜0.01），與LPS刺激正常巨噬細(xì)胞的結(jié)果一致。與對照組相比，ERK抑制劑干預(yù)組ERK活性顯著下降（P＜0.01）。與單獨(dú)LPS刺激組相比，LPS刺激＋ERK抑制劑干預(yù)組ERK活性顯著下降（P＜0.01）（圖4）。

檢測各組炎癥因子的分泌，結(jié)果顯示，與對照組相比，單獨(dú)LPS刺激組TNF-α和IL-6分泌水平顯著升高（P＜0.01），而IL-10分泌水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與單獨(dú)LPS刺激組相比，LPS刺激＋ERK抑制劑干預(yù)組TNF-α和IL-6分泌水平顯著下降（P＜0.01，P＜0.05），而IL-10分泌水平顯著升高（P＜0.05）（圖5）。結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)激活ERK通路，提高促炎因子分泌水平；而ERK抑制劑干預(yù)ERK通路后，LPS誘導(dǎo)的促炎因子分泌下降，抗炎因子分泌上升。上述結(jié)果與CD36表達(dá)下降對巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌的影響相似。

圖4 ERK抑制劑對LPS激活巨噬細(xì)胞ERK活性的影響Fig.4 ERK inhibitor influences the activation of ERK induced by LPS

圖5 ERK抑制劑對LPS激活巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6和IL-10的影響Fig.5 Influence of ERK inhibitor on secretion of TNF-α，IL-6 and IL-10 measured by ELISA

3 討論

炎癥反應(yīng)是巨噬細(xì)胞參與宿主抗菌免疫應(yīng)答的重要部分，是宿主抵抗病原體的一種保護(hù)機(jī)制。LPS能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌多種炎癥因子，包括TNF-α、IL-6、IL-1和IL-10等。TNF-α和IL-6是促炎因子的主要代表，TNF-α能調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞遷移，促進(jìn)其他炎癥因子分泌，是造成內(nèi)毒素休克及彌漫性血栓的首要因素［11］；IL-6誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生急性期蛋白，與TNF-α共同介導(dǎo)微生物感染后宿主急性期反應(yīng)，參與革蘭陰性菌內(nèi)毒素血癥的進(jìn)展［12］。IL-10作為免疫調(diào)節(jié)因子，能阻斷TNF、IL-6和IL-12等炎癥因子的合成和活性，具有強(qiáng)烈的抗炎作用，將炎癥反應(yīng)控制在適當(dāng)范圍內(nèi)［13］。TNF-α、IL-6和IL-10是觀察LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的常用指標(biāo)［14］。

一方面，CD36介導(dǎo)細(xì)胞識別革蘭陰性菌和LPS等不同的配體；另一方面，CD36作為一種“生物傳感器”，利用其跨膜結(jié)構(gòu)將信號通過末端傳導(dǎo)至胞質(zhì)內(nèi)，激活下游信號途徑，在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能方面起重要作用［15］。在神經(jīng)細(xì)胞中，CD36結(jié)合β淀粉樣蛋白肽，并激活下游炎癥信號途徑，包括Scr激酶家族蛋白、Fyn和ERK［16］。研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激過表達(dá)CD36的人胚腎細(xì)胞HEK293后，JNK信號途徑激活，從而觸發(fā)IL-8分泌［17］。不同細(xì)胞的CD36在介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的機(jī)制方面具有異質(zhì)性［18］。本研究顯示，LPS刺激正常表達(dá)CD36的巨噬細(xì)胞后，ERK通路激活，誘導(dǎo)分泌的促炎因子TNF-α和IL-6水平顯著升高；當(dāng)CD36表達(dá)下降，細(xì)胞中ERK通路受抑制，誘導(dǎo)分泌的促炎因子TNF-α和IL-6水平降低，而抑炎因子IL-10水平顯著升高。

ERK是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族中研究最為廣泛的蛋白激酶之一。ERK磷酸化后成為有活性的蛋白激酶，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種功能，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡和衰老，還能調(diào)節(jié)炎癥因子的產(chǎn)生和分泌［19］。在巨噬細(xì)胞中ERK通路調(diào)節(jié)TNF、IL-1β等炎癥因子的產(chǎn)生，同時(shí)抑制IL-12、干擾素β（interferonβ，IFN-β）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等生成［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，20 nmol／L ERK抑制劑阻斷ERK磷酸化后，LPS刺激巨噬細(xì)胞時(shí)ERK活性被明顯抑制，細(xì)胞分泌促炎因子TNF-α和IL-6的水平顯著降低，而抑炎因子IL-10水平升高，此與LPS刺激CD36表達(dá)下降對巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌的影響結(jié)果一致。在單核細(xì)胞中活化的ERK能促進(jìn)CD36正常表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，陰性對照組中低水平激活的ERK參與巨噬細(xì)胞CD36的正常表達(dá)；用CD36 siRNA阻斷CD36的正常表達(dá)后，可使上游已活化的ERK累積而高于陰性對照組，其機(jī)制或與LPS刺激ERK活性升高不同，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，LPS作為PAMP存在于革蘭陰性菌中，高度保守，其與巨噬細(xì)胞相互作用后，被CD36識別并通過激活ERK通路使促炎因子分泌水平升高，CD36和ERK通路參與了LPS誘發(fā)的巨噬細(xì)胞炎癥因子釋放，為革蘭陰性菌LPS致病機(jī)制的研究提供了新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effects of CD36and extracellular regulated kinase signaling pathway on inflammatory cytokines induced by lipopolysaccharide

QIN Yuan，CAO Jun-Yuan，WU Shu-Yan，HUANG Rui
Department of Microbiology，Medical College of Soochow University，Suzhou215123，China

The present paper aims to establish a RAW264.7 macrophage model to investigate the effects of CD36 and extracellular regulated kinase（ERK）signaling pathway on the secretion of inflammation-related cytokines induced by lipopolysaccharide（LPS）.Firstly，the macrophages with or without CD36 knockdown were stimulated with100 ng／ml LPS for 16 h.Then the activation of ERK and secretion of tumor necrosis factorα（TNF-α），interleukin6（IL-6）and IL-10 were analyzed.Secondly，the cells were incubated with20 nmol／L ERK inhibitor，and LPS was added for further stimulation.The changes in the above indexes were investigated.The relationship between the secretion of inflammatory cytokines and ERK signaling pathway was studied.The results showed that in normal RAW264.7 cells，LPS treatment stimulated the activation of ERK and secretion of TNF-αand IL-6 significantly，and had no significant effects on IL-10 level.CD36 knockdown inhibited the activation of ERK and secretion of TNF-αand IL-6，and increased IL-10 level upon LPS treatment.The pharmaceutical inhibition of ERK decreased TNF-αand IL-6 secretion and enhanced IL-10 secretion upon LPS treatment.The results suggest that both CD36 and ERK pathway areinvolved in LPS-mediated secretion of proinflammatory cytokines.

Lipopolysaccharide；Macrophage；CD36；Extracellular regulated kinase signaling pathway；Inflammatory cytokine

.HUANG Rui，E-mail：hruisdm＠163.com

2015－05－06）

國家自然科學(xué)基金（81471572）

黃瑞