磁珠富集法提高外周血HIV DNA 檢測靈敏度的研究?

王立林 鄔林楓 趙方 李然 李彤 劉衡 朱蕊 曾勁峰

(1.深圳市血液中心,廣東 深圳 518000,2.深圳市第三人民醫(yī)院)

人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染人體后,病毒在局部組織的巨噬細胞或樹突狀細胞中復(fù)制。隨后48～72 h 內(nèi),局部淋巴結(jié)開始有HIV 病毒復(fù)制。感染病毒72～120 h(3～5 d)內(nèi)出現(xiàn)病毒血癥,1～9 d 左右可在外周血中檢測到病毒DNA 和RNA 的成分,10～14 d 以后才能檢測到抗體[1-4]。受試劑靈敏度限制,各種診斷試劑在感染后一段時間內(nèi)無法檢出病毒感染標(biāo)記物的,將感染后至試劑檢測結(jié)果呈陽性的時間段稱為窗口期(window period,WP)[5]。HIV 病毒感染標(biāo)記物主要有抗-HIV、P24 抗原、HIV RNA、HIV DNA 等[6]。發(fā)生高危行為服用早期抗病毒治療(antiretroviral therapy,ART)阻斷藥物后,HIV 感染者血漿中HIV RNA 病毒載量、P24 抗原水平可以降至檢出限以下,早期ART 導(dǎo)致機體不能充分產(chǎn)生抗體應(yīng)答效應(yīng),抗體生成受到抑制,整合在基因組內(nèi)的HIV DNA 受治療影響較小,成為早期ART 后具有檢出可能性的診斷標(biāo)記物[7-8]。近年,越來越多的研究證實:獻血人群中有正在接受ART 和正在進行暴露前預(yù)防(pre-exposure prophylaxis,PrEP)HIV 感染的情況[9-10]。為應(yīng)對使用各類ART 藥物的HIV 感染者對血液安全造成的潛在風(fēng)險,本研究應(yīng)用1 名HIV 感染患者早期開展ART 后不同時間點外周血液,通過建立磁珠富集檢測方法提高HIV DNA 檢測靈敏度,驗證該方法可行性,為高危行為后HIV 突破感染人群的HIV 篩查確證工作提供新的方法和證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 患者信息 男,29 歲,漢族,未婚,2018 年5 月11 日第1次高危行為,5 月18 日第2 次高危行為,2018 年5 月19 日口服ART 藥物,2018 年5 月30 日主動聯(lián)系本中心。為了解此類HIV 感染早期開展ART 患者對血液安全的潛在風(fēng)險,我們于5 月30 日對其血液進行了HIV 相關(guān)檢測,并在2 個月內(nèi)隨訪3 次。本研究對象本人已簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 第4 代Genscreen ULTRA-HIV Ag-Ab 試劑(伯樂公司,批號:9A0455,以下稱抗-HIV 試劑1),第3 代抗-HIV 試劑(北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司,批號:I20181025,以下稱抗-HIV 試劑2)。人類免疫缺陷病毒(HIV 1＋2 型)抗體檢測免疫印跡法(western blotting,WB)HIV BLOT 2.2 試劑(新加坡MP 生物醫(yī)學(xué)亞太私人有限公司,批號:AE4036)。MPX v2.0 HBV、HCV、HIV(1＋2 型)PCR-熒光法核酸聯(lián)合檢測試劑(羅氏診斷公司,批號:352185),COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 test,version 2.0 HIV 核酸定量檢測試劑盒(羅氏診斷公司,批號:R00002),HIV-1 DNA檢測試劑盒(天津精耐特基因生物技術(shù)有限公司,批號:09L2Q),Ficoll 分離液(Stem Cell Technologies,批號:00219)。CD4＋T 細胞免疫磁珠陰性分選純化試劑(Stem Cell Technologies,批號:19555),Cobas s 201 CAP/CTM 核酸檢測系統(tǒng)(羅氏診斷公司),AutoBlot System 20 全自動免疫蛋白印跡儀(伯樂公司),FACS Calibur 標(biāo)準(zhǔn)流式細胞儀測(BD Biosciences 公司),高速臺式離心機(Eppendorf 公司),Mini-MACS 磁性吸附性分離裝置(美天旎公司)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本保存 全血使用EDTA-K2管保存。采集后6 h內(nèi),分離血漿和外周血單個核細胞,陰性分選富集PBMC 中CD4＋T 淋巴細胞,－80℃分裝凍存。

1.3.2 判定規(guī)則 按照試劑說明書操作并判定結(jié)果。所有標(biāo)本經(jīng)3 遍酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測,若2 遍及以上反應(yīng)性,則最終結(jié)果判定為陽性,否則結(jié)果為陰性。

1.3.3 HIV RNA 核酸檢測(nucleic acid testing,NAT)

1.3.3.1 單標(biāo)本模式檢測 標(biāo)本定性檢測患者血漿中的HIV-1 RNA、HCV RNA 和HBV DNA。

1.3.3.2 混樣模式檢測 通過取1 份待測標(biāo)本與血漿5 份酶免核酸陰性血漿混合,模擬6 人份混樣,進行MPX v2.0 PCR-熒光法NAT 聯(lián)合檢測。

1.3.4 HIV RNA 病毒載量檢測 按試劑盒說明書操作,HIV RNA 最低檢測限為20 copies/mL。

1.3.5 蛋白免疫印跡(Western Blotting,WB)確證實驗 按照試劑說明書中結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn),陰性結(jié)果為沒有病毒特異帶,或者只有p17 帶,HIV-1 陽性結(jié)果為檢出2 條ENV 帶(gpl60/gp41 和gpl20)及核心蛋白(p17、p24、p55 等GAG 蛋白)或酶蛋白(p31、p51、p66 等POL 蛋白),不確定結(jié)果為出現(xiàn)任何特異條帶,但不足以被判斷為陽性。

1.3.6 Ficoll 法分離全血標(biāo)本中PBMC 將1 體積淋巴細胞分離液Ficoll 用移液管沿管壁緩慢疊加于2 體積抗凝外周全血的離心管中,形成分層液,500×g 水平離心20 min,離心后管內(nèi)分為3 層,用移液器將云霧層吸至另一離心管中,加入3倍體積PBS,300×g 離心10 min,重復(fù)洗滌2 次,最后1 次離心棄上清,細胞計數(shù)調(diào)整細胞至1×106/mL。

1.3.7 免疫磁珠陰性分選富集PBMC 中CD4＋T 淋巴細胞

按照試劑盒說明書操作,將PBMC 稀釋為5×107細胞/mL濃度的細胞標(biāo)本,與試劑盒中雞尾酒混合抗體試劑混勻至終濃度50 μL/mL,顛倒混勻,常溫孵育10 min。與磁珠混勻,常溫孵育5 min,將磁珠放入不帶蓋回收管,插入磁力架內(nèi)至少5 min。吸附磁珠后,吸取富含濃縮CD4＋T 細胞的懸浮液,轉(zhuǎn)移入新試管中。取少量細胞測純度和活力。

1.3.8 細胞活力測定 將單細胞懸液稀釋至×106細胞/mL,以9 ∶1比例與0.4%臺盼藍溶液混勻,計數(shù)板計數(shù)活細胞和死細胞,計算活細胞率。

1.3.9 CD4＋T 細胞計數(shù)及純度 取磁珠富集后的CD4＋T 細胞(1×105細胞/mL)1 mL,離心,棄上清,加入80 μL PBS,10 μL 抗CD3mAb-FITC 和10 μL 抗CD4mAb-APCCY7 混勻,室溫避光放置30 min,應(yīng)用流式細胞儀檢測分析標(biāo)本中CD4＋T細胞計數(shù)及純度。

1.3.10 HIV DNA 定量分析 按試劑盒方法操作,檢測整合到人類白細胞基因組中HIV DNA[11]。

1.3.11 追蹤隨訪 在5 月30 日之后的2 個月內(nèi),對該例HIV 感染早期開展ART 的患者追蹤隨訪3 次,補充ELISA,HIV RNA 定量定性檢測,HIV DNA 定量檢測,WB 實驗,CD4＋T 細胞計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 細胞活力和純度 經(jīng)流式細胞儀檢測,PBMC 中磁珠法分離純化CD4＋T 細胞純度達到(96.4±2.6)%,0.4%臺盼蘭染色細胞活力為(95.9±2.9)%,見圖1。

圖1 免疫磁珠陰性分選后CD4＋T 細胞純度

2.2 血清學(xué)及核酸檢測結(jié)果 HIV 感染患者ART 后外周血液血清學(xué)、核酸學(xué)檢測結(jié)果見表1。隨著治療開展,患者血漿中HIV RNA 載量逐漸下降直至無檢出。全血組4 個時間點HIV DNA 定量檢測結(jié)果均為陰性。

表1 HIV 窗口期患者ART 后4 個時間點的血清學(xué)檢測結(jié)果

3 討論

2016 年,世界衛(wèi)生組織頒布了?使用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療和預(yù)防艾滋病毒感染合并指南?,明確提出“HIV 發(fā)現(xiàn)即治療”,新的治療原則有助于恢復(fù)CD4＋T 細胞計數(shù),減少HIV 病毒庫規(guī)模,同時,規(guī)范了HIV PrEP 和HIV 暴露后預(yù)防(post-exposure prophylaxis,PEP)使用抗病毒藥物的治療原則,推動全球HIV 高危人群的預(yù)防工作[12]。2019 年,全球68%艾滋病毒感染成人和53%艾滋病毒感染兒童接受終生ART[13]。ART 和PrEP、PEP 治療方法的應(yīng)用影響了HIV 診斷標(biāo)記物的檢測,增加了獻血者HIV 篩查的不確定性和風(fēng)險性,提高檢測靈敏度是保障血液安全的重要途徑[9-10]。

因HIV WP 發(fā)現(xiàn)概率非常低,早期感染后ART 標(biāo)本更少,同時,感染背景及治療史不明確,研究標(biāo)本稀缺,背景信息不詳,故而難以深入分析。本文研究對象因了解到血液篩查靈敏度高,高危行為后服用抗病毒藥物阻斷,主動聯(lián)系本中心。為明確這類患者對輸血安全的潛在風(fēng)險,我們對患者進行了追蹤檢測。雖然患者在2018 年5 月19 日,也即第2次高危行為的d2 口服抗病毒藥物,但是,患者2018 年5 月11 日第1 次高危行為,5 月18 日第2 次高危行為,5 月30 日第1 次追蹤F1 檢測結(jié)果顯示,HIV RNA 病毒載量已高達1.10E＋06,并且,第3 代和第4 代抗-HIV 試劑1 和2 檢測結(jié)果均為陽性,推測感染應(yīng)有更長的時間,所以判斷患者真正感染時間應(yīng)該是第1 次高危行為的5 月11 日,后續(xù)感染時間以此為基點計算。國際上已有PEP 或PrEP 失敗的個別案例報道,早期識別HIV 突破感染至關(guān)重要[14-15]。

免疫磁珠是一種磁性微球和免疫配基相結(jié)合的納米材料,通過磁珠表面錨定的氨基、羧基、羥基或巰基等化學(xué)基團,與活性蛋白、抗原、抗體等免疫配基結(jié)合,形成免疫磁珠。免疫磁珠廣泛用于生物標(biāo)本的提取和處理,如細胞分選、核酸、蛋白的提取等[16-17]。圖1 顯示,流式細胞儀測定PBMC中磁珠法分離純化CD4＋T 細胞純度達到(96.4±2.6)%,臺盼蘭染色檢測細胞活力達到(95.9±2.9)%,與既往研究數(shù)據(jù)中免疫磁珠法及密度梯度離心法分離純化細胞的效率一致[18],說明本研究建立的方法學(xué)穩(wěn)定可靠,可為后續(xù)實驗開展提供可靠的CD4＋T 淋巴細胞標(biāo)本。

結(jié)合HIV 早期治療背景數(shù)據(jù),研究者可以分析開展ART患者病毒抑制效率和病毒清除時間動力學(xué),評估患者長期治療結(jié)局。根據(jù)研究數(shù)據(jù),理想情況下,第1 劑PEP 應(yīng)在暴露后2 h 內(nèi)且不遲于暴露后72 h 內(nèi)給藥。越早開始PEP,病毒感染的風(fēng)險就越低[19]。動物實驗上,Ogata-Aoki 等[19]在小鼠腹腔注射熒光標(biāo)記HIV-1,感染后1 d 用雷特格韋治療,血漿中持續(xù)未檢出p24 或HIV-1 RNA。來自人體研究病例和臨床試驗數(shù)據(jù),也確定PEP 對患者的有效性。1 名患有鐮狀細胞病的12 歲女孩在輸注HIV 陽性獻血者含9 740 copies/mL HIV 病毒載量血液后,24 h 內(nèi)開展PEP,成功阻斷,半年后仍未在血液中檢測到HIV RNA 和HIV DNA[20]。但是,如果治療啟動時間超過72 h,出現(xiàn)突破感染概率非常高,血液中HIV 診斷標(biāo)記物變化因缺少足夠病例,尚無明確經(jīng)驗規(guī)律。本研究數(shù)據(jù)顯示,HIV RNA 病毒載量在第4 次追蹤F4時,MP6-NAT 模擬6 人份混和檢測及HIV RNA 定量檢測已經(jīng)無法檢測。同時,受HIV 感染時間短,全血中CD4＋T 淋巴細胞數(shù)量較富集后少,抗病毒治療開展早等因素影響,該患者全血中HIV DNA 病毒庫規(guī)模較小,濃度低,4 次追蹤結(jié)果均為陰性,采用磁珠富集法后,4 次追蹤均可檢出HIV DNA病毒庫,并且第4 次檢出結(jié)果最高?？梢酝茰y,如果患者更早開展ART,HIV RNA 載量會更容易抑制,當(dāng)病毒特異性抗體未能產(chǎn)生前,此時病毒檢測靶標(biāo)或許只有整合的HIV DNA病毒庫。結(jié)合HIV RNA,HIV DNA,抗-HIV 等不同診斷標(biāo)記物消漲動態(tài)改變,本研究發(fā)現(xiàn)CD4＋T 淋巴細胞富集檢測HIV DNA 方法有望成為HIV 突破感染更靈敏的檢測方法和診斷依據(jù)。

自2019 年以來,中國已開展多個HIV 防控示范項目,發(fā)布了預(yù)防艾滋病毒的技術(shù)指南,推廣宣傳PrEP 和PEP[21],越來越多中國男男性行為者(men who have sex with men,MSM)了解到PrEP 和PEP,新形勢下需要我們在獻血者征詢中強調(diào)HIV 藥物治療及突破感染對血液安全的威脅,同時運用更靈敏的方法保障血液安全。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。